Summary
サブミクロンの空間とサブミリ秒の時間分解能で膜電位の変化を監視するためのイメージング技術が記載されている。電位感受性色素のレーザー励起に基づく手法では、軸索と軸索側枝、樹枝状の端子、および個々の樹状突起棘における信号の測定が可能です。
Abstract
生物物理学的特性および単一ニューロンの機能的な組織を理解し、それらがどのように情報を処理する脳がどのように機能するかを理解するための基本です。任意の神経細胞の主な機能は、通常、複数の情報源から、電気信号を処理することです。神経突起の電気的特性は、詳細な測定の不存在下で予測することは非常に、複雑でダイナミック、そして、一般的な場合では、不可能である。彼らは活動電位の開始に影響を与えるために特定の場所で神経プロセスと合計する上の原点のサイトから移動する際に、複数のサイトで、サブスレッショルドイベントを一つは、理想的には、監視できるようにしたいと思い、このような測定を得るために。この目標は、電極を用いる測定の技術的制限により、任意のニューロンで達成されていません。この欠点を克服するために、それは大規模な並列recordinを許可するイメージング技術でパッチ電極のアプローチを補完することが非常に望ましいニューロンのすべての部分からのGS。サブミリセカンド、サブマイクロメートルの分解能によって特徴付け-有機電位感受性色素（V メートルイメージング）と膜電位の過渡光記録-ここでは、このような手法を説明します。我々の方法は、電位感受性分子プローブ2の先駆的な研究に基づいています。初期の技術の多くの側面を連続数十3、5、11より改善されてきた。また、前作はV メートルイメージングの二つの本質的な特性を文書化した。まず、蛍光シグナルは、全体の生理的な範囲で膜電位（、10、14、16、100 mVから-100 MV）に直線的に比例します。第二に、ここで使用される電圧感受性色素（JPW 3028）と、ロード·ニューロンは、検出可能な薬理作用を持っていません。色素ローディング中にスパイクの広がり記録、7 4完全に可逆的である。さらに、実験的証拠は、それが得ることが可能であることを示しています前の任意の検出可能な光毒性効果4、6、12、13への録音のかなりの数（最大数百人まで）。現在のところ、我々は、V メートルイメージング技術の感度を最大にするために、最適に近い波長でのレーザ光 源の明るさと優れた安定性を活用しています。現在の感度は軸索と軸索側枝は、端末樹の枝、及び個々の樹状突起棘含むニューロンのすべての部分からV メートル過渡の複数のサイト光学録音を可能にする。信号の相互作用に関する情報が取得された定量的な解析だけでなく、ムービーの形で直接可視化することができます。
Protocol
1。機器セットアップ
ステップ1.1。イメージングセットアップ
膜電位感受性色素信号を記録するための鍵は、適切なセットアップデザインです。我々は、3つのカメラを搭載した正立顕微鏡（オリンパスBX51WIまたはツァイスAxioExaminer）を使用します。セットアップはニコン60X/1.0 NAまたはツァイス63X/1.0 NAの水浸漬目標のいずれかを使用して、落射蛍光、広い視野顕微鏡モードでの励起光によって脳スライスにおける照明個々のニューロンのために設計されています。当社の顕微鏡は防振台にボルトで固定し、電動可動ステージを完備しています。各顕微鏡は、3つのカメラポートが装備されています。一台のカメラポートがビデオ顕微鏡（IR-1000、DAGE MTI、米国）赤外線DICのための標準的な高空間分解能のCCDカメラを持っています。第2のカメラポートは、比較的低い空間分解能（80×80ピクセル）が、優れたダイナミックレンジ（14ビット）と読み、非常に低いと、高速データ·アクイジション·カメラ（最大20 kHzのフレームレート）を有しているノイズ（NeuroCCD-SM RedShirtImaging LLCは、ディケーター、ジョージア州）。用共焦点画像のzスタックを収集するために使用スピニングディスク共焦点スキャナ（CSU-10、横河電機、日本）に搭載され、第3のカメラポートは、高空間分解能を持つCCDカメラ（PCO AG、ドイツPixelFly、1392x1024ピクセル）を持つ染色された細胞の詳細な形態学的再建。倍周波数ダイオード励起Nd：波長532 nm（MLL-III/400 mWで、CNI、長春、中国）での連続波YVO4レーザ（400 mW）の発光は、励起光の源である。シャッター（LS6、ビンセント·アソシエイツ）によってゲート直径2mmのレーザービームがあふれへの背面開口部を設計したシングルポートの落射蛍光コンデンサー（フォトニクス社、グレーフェルフィングまで、ドイツ）を介して顕微鏡に結合された光ガイドに導かれる客観的かつ物体面の均一な照明の近くに提供する。レーザ光 はによってV メートルイメージングの感度を最大にするために、従来のキセノンアークランプの代わりに使用されます：（1）単色EXを使用して染料9、10、（2）アークランプによって達成することができるレベルを超えて、励起光の強度を増加させるのV mの感度を最大にするために、吸収スペクトルの赤い翼で引用光。励起光は560nmの中心波長を持つダイクロイックミラーにより準備に反映されていたと記録された蛍光の光は610nmのバリアフィルタ（Schott社RG610）に通した。光強度の増加とほぼ最適な単色励起波長の使用の複合効果により、以前の測定6に比べて約50倍の電圧イメージングの感度が劇的に改善しました。
ステップ1.2。均一な照明を調整
蛍光スライド標準（緑色励起/赤色発光）を使用します。 CCDが飽和しないように、レーザ光路の適切な減光フィルターを挿入します。の表面に目的を集中スライド。レーザーランチャー対物レンズの前の石英光導路の受信端の位置を調整し、中心と均一達成するために、落射蛍光コンデンサー上の適切なアクチュエータを用いた顕微鏡に取り付けられたライトガイドの出力端の位置を調整視野の照明。
ステップ1.3。振動ノイズを決定
蛍光スライドの表面に小さな黒いインクマークを置きます。連続記録モードでNeuroCCD持つレコード光強度。黒インクマークの暗い端に目的を当てる。 2 kHzのフレームレートで約100ミリ秒の光強度を記録します。均一に照明エリアから、インクマークの縁に沿って約20ピクセルからの光を受けて〜20ピクセルから小数光強度トレース（ΔF/ F）の空間平均を表示します。高コントラストのエッジを持つピクセルから録音中の過剰なノイズがで振動ノイズを反映システム。
手順1.4。振動絶縁
これは実験的な撮影状況に匹敵する光強度におけるショット雑音以下のレベルに振動アイソレーションテーブルを使用することにより、振動を低減するために必須です。画像のシャープなエッジをカバーするピクセルからの光強度の振動ノイズが無視できるまで防振台を調整します。可動部品（メカニカルシャッター、ファン）を備えた機器はいずれもテーブルの上にマウントすることはできません。振動から絶縁されていません他のコンポーネントに接続されているテーブルの上に機器のケーブルは、顕微鏡に機械的振動を伝達しないように緩んでなければなりません。
2。 V メートルイメージングのための適切なニューロンの選択
ステップ2.1。ニューロンの選択
標準的な手順に従って、脳スライスを作成します。 iの個々の神経細胞にEGFPを発現するマウスラインを使用nterest。回転するディスク共焦点システムでは、スライスのEGFP標識された神経細胞を可視化する。無傷の軸索/樹木でV メートルイメージングのための神経細胞を選択し、プロセスはスライスの表面に平行かつ近接し実行されています。軸索と樹状突起は薄いが、ほとんどの部分は、DIC顕微鏡モードでは表示されませんので、これは野生型マウスでは実現できません。
3。電位感受性色素を使用したロードニューロン
ステップ3.1。パッチピペットの充填
電極テーパーの2月3日までの約15秒間陰圧を適用することにより、色素無細胞内液で先端からガラスパッチピペットを埋める。先端における染料の無料のソリューションは、バックグラウンド蛍光を増加させ、劇的に信号対雑音比を減少させるスライスに色素の流出を防止することが必要である。膜非透過性の膜電位感受性色素JPW3028が溶解含有する溶液と電極を埋戻し細胞内溶液（0.8 mM）のインチ
JPW3028、細胞内のアプリケーションのために最も成功した電圧プローブは、まだ十分に水をマイクロインジェクションに使用するには可溶である親油性スチリル色素のANEPシリーズの二重に正に帯電アナログである。この色素のジ-エチル類縁体と実質的に同一の特性（電圧感度を含む）を有しており、JPW1114（ 表1参照）として市販されている。私たちは、蒸留H 2 O中の20mMストック溶液を調製ストック溶液の50μlアリコートを-20℃で凍結保存されます0.8 mMの最終色素濃度は、原液の2μlを実験当日の細胞内溶液50μlに溶解させる。在庫色素溶液は安定しており、数ヶ月のために室温に保つことができる。それが使い果たされるまで、したがって、私たちは、室温で150μlアリコートを保つ。
ステップ3.2。迅速ギガシールを確立
ステップ3.3。染色のレベルを監視
全細胞構成における染料拡散中、電流クランプモードで誘発活動電位を記録することによって、ニューロンの生理的状態を監視します。さらに、2 kのフレームレートで細胞体からの安静時の光強度（RLI）を記録することにより、染色の量を監視 HzとNDフィルター（我々は400 mWのレーザーからのレーザー光強度の0.04％を使用）で調整フル光強度のほんの一部で。活動電位は、電極の大きさと抵抗に応じて、通常20から40分後に、広げるために開始されるまで色素ローディング処理を続行します。
スパイクの広がりは、完全に可逆および体膜中の色素の飽和濃度の容量性負荷効果による可能性が最も高い。染料濃度はニューロン全体で平衡化した後にスパイクの波形が完全に復元されます。
ステップ3.4。染料電極を取り外し
期間を染色するの終わりには、慎重に持ち上げ全細胞から外にアウトパッチ設定への移行のプロセスで達成されることを確実に電圧クランプ構成でソーマからパッチピペットを引き抜きます。
ステップ3.5。染料拡散待つ
ENT ">神経プロセスに広めるために電位感受性色素を可能にするために、室温でさらに1.5から2時間のスライスをインキュベートする。染料拡散し、かなりの量の後に離れてからの樹状細胞体と軸索のプロセスに、波形をAPは完全に復元されます。4。光学式記録
手順4.1。イメージングのための細胞区画を選択
低光レベル蛍光とDICの下で標準（無色素）パッチ電極で再度パッチニューロンの下で染色されたニューロンの細胞体の位置を確認します。電圧撮像するCCDの連続記録モードで10から40 Hzのフレームレートで低照度下で神経プロセスを可視化します。目的のオブジェクトを視覚化するために必要な最小限度の減光フィルターで光レベルを下げてください。我々は、染色されたニューロンの位置決め時に400mWのレーザー強度の0.01％を使用しています。 XYステージを使用して、トンへの関心の神経突起を配置彼撮像領域の真ん中。顕微鏡の部分的に閉じ視野絞り虹彩を用いた励起光からソーマを保護します。高強度の励起光からソーマをシールドすることが大幅に記録中に光線力学的ダメージを減らすことができます。
膜電位の過渡に関連4.2記録された光信号をステップ
個々の樹枝状でbackpropagated APに関連した光信号を記録します。軸索内のAPに関連する光信号を記録します。樹状突起棘のAPをbackpropagatingに関連した光信号を記録します。信号波形の正確な再構成のための適切なフレームレートを使用し、漂白、染料と光線力学損害を最小限にするために記録期間と高強度の励起光への曝露はできるだけ短くしてください。例えば、軸索内の単一活動電位の発生と進展のシーケンスを調べると、5から10ミリ秒の期間を記録する必要があります。励起光激化録音中にtyは一方では信号対雑音比、他方で漂白染料および光線力学損傷の程度との間の妥協である。我々は、直径300μmの領域が点灯している軸索の長い部分から記録で400 mWのレーザの強度を100％使用。励起光が樹状突起スパインのイメージングのための30μmの直径の領域にフォーカスされている場合、我々は、レーザ光強度の10〜25％を使用しています。記録の必要な期間は、最適な励起光強度を決定する重要な要因であり、短い記録期間は、より高い光強度を可能にします。最適な照度は、それぞれ最高の準備と測定の設定について経験的に決定されます。
5。データ解析
ステップ5.1。既知のエラーの生データを訂正
データの分析と表示はIDL（ITT視覚情報solutをで書かNeuroPlexプログラム（RedShirtImaging）を用いて行ったイオンは、コロラド州ボルダー）とカスタムのVisual Basicルーチン。低光レベルの条件の下では、バックグラウンド蛍光はΔF/ F信号の大きさの重要な決定要因となります。生データは、最初のスライス上に染色されていない領域から求めた平均バックグラウンド蛍光強度を差し引くことによってこの効果を補正した。その後、信号アライメントソフトウェアはAP開始の時間ジッタのためだけでなく、平均化時の準備の可能小さな動きを補正するために使用されていました。時間領域では、AP信号が平均化の開始（ 図1B）で取得された基準信号に各試験で電気的に記録されたAPの相互相関によって整列させた。空間領域では、画像は準備の可能性のある小さな横方向の動きを補正するために画像の相互相関によってオフラインに二次元的に配列していた。 z次元の画像のピントは、個々の試験の前に確認された。Smalのリットルの調整が頻繁に必要であった。 図1Bに示すように、空間的にも時間的に整列された信号を平均化した。染料の脱色による光強度の緩やかな変化は無刺激（ 図1B）で記録試験から得適切なデュアル指数関数でデータを分割して補正した。 APの信号の波形はキュービックスプライン補間は、各データ点を通る区分的に連続した曲線を使用して一連のデータポイントから再構築されました。電位感受性色素信号がミリ秒の時間スケールでかなりの歪みが無く、膜電位を追跡していることを確認するには、相馬からの電気AP信号は 、 図3Bに示すように、隣接する軸索小丘からの光AP信号と比較した。二つの信号は、光記録におけるショットノイズを考慮して、非常に密接に重ねる。
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図1。データ解析（アニメーション）。 （A）はアッパーパネル：記録位置で軸索で染色したニューロンの高分解能共焦点画像。記録電極は、模式的に示さ基底樹状突起の横のソーマ、細胞外刺激電極に接続されている。活動電位は細胞外、シナプス刺激により誘発される。ソーマ（黒のトレース）は、AISからの光学録音（赤いトレース）からV メートルイメージングのために使用されるCCDによって得られた軸索の低空間分解能蛍光像（B）電極レコーディング、およびランヴィエ絞輪（緑のトレース）から：下のパネル。 。トップトレース：AP通信開始の時間ジッタを示す9の試験からの生データ。トレースの2行目：時間的に整列信号。トレースの3行目：平均化された信号。トレースの4行目：漂白剤補正。ボトムトレース：テンポラル平滑化の1つのパスを持つ3次スプライン補間。
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Representative Results
成功した共焦点顕微鏡は、スライスの表面に近いとフォーカスの一方の面に配置されている無傷の神経プロセスの明確な識別を可能にするべきである。前電位感受性色素負荷への電圧イメージングに適した神経細胞の選択は非常に重要です。皮質スライス（Crymトランスジェニックマウス系統）にEGFPを発現L5錐体細胞の共焦点画像の例を図2に示します。個々のニューロンの軸索は、はっきりと見える。スライスの表面に近い焦点の一つの面で長い無傷の軸索（白矢印）をもつ細胞を選択した。
図2：軸索からAP信号のV メートルイメージングのためのL5の皮質ニューロンの選択。同じスライス領域の低い（左）および高い（右）拡大画像;横河電機を使用して488 nmの励起ディスクスキャナをスピニング。
軸索起始部におけるNaチャネルクラスタリングの空間的パターン（AIS）は軸索の神経可塑性の新規フォームを媒介することが示されているニューロンの計算とNaチャネル分布の変化を調整する上で重要な役割を果たしている。ただし、チャネル分布に関する免疫組織化学的データは直接活動電位開始の時空間特性を予測できないことがあり、事前の電気生理学的な措置は間接である（細胞外）または直接スパイクトリガーゾーン（TZ）を特徴づけるために十分な空間分解能は（細胞内）が欠けている。ここで説明した膜電位イメージング技術の感度が重要な方法論の改善は機能的な用語で定義されているスパイクTZの位置と長さの直接測定を可能にする。高空間時間分解能でのAP信号を記録する例を図3に示します。 図3Bは、ことを示していますV メートルイメージングの使用可能感度は回生AP信号に先行するサブスレッショルド脱分極の正確なモニタリングには十分でした。また、ソーマ/軸索小丘からと絞輪より遠位ノードから光AP信号の比較はAPがこれら二つの位置8、15で著しく異なるダイナミクスを持っていることを確認した。アップストロークとAPの下降の両方がで速かったランヴィエ絞輪。スパイクTZがポポヴィッチらに図3と図5を参照のサイズと位置の測定における時空間分解能の制限についての詳細はこちら。（2011）。
軸索から図3。活動電位信号。 （A）はアッパーパネル：記録位置における軸索との電位感受性色素でロードL5は皮質ニューロンの高分解能共焦点画像と、投影FRomの共焦点画像のzスタック。録音/ソーマに添付パッチ電極を刺激する。下部パネル：V メートルイメージングのために使用されるCCDによって得られた軸索の低空間分解能蛍光画像。 （B）は、AP関連の信号は10 kHzのフレームレートで記録された。右側のトレース：以下の3つの場所からAPトランジェント：1電極記録ソーマから、軸索小丘から出ている2 - 光記録、絞輪の最初のノードから3光記録。ボトムトレース：同じ3つの場所からの信号を重ね合わせた。
LTPの誘導を担当して樹状突起の興奮性シナプス後電位（EPSPの）とBAPS間の非線形相互作用は完全には理解されません。この相互作用は、両方の信号の振幅に大きく依存し、したがって、空間的に不均一である必要があります。小径の樹枝がないので、この予測の実験的なテストが行われていない空間的に分解測定を必要とする電極測定にccessible。 図4に示すように、ここで説明した膜電位イメージング技術は、全体の樹のあずまやで、複数の場所からの電気信号をモニタすることができます。樹あずまやでBAP活動のパターンが徐々に現在の長期化カルシウムに変更近位領域におけるナトリウム電流スパイクが支配することを特徴としている遠位樹状突起の脱分極イベントを支配した。
図4：アクションL5の皮質ニューロンの樹状あずまや上の複数の場所からの潜在的なシグナル。左のパネル：電位感受性色素でロードL5は皮質ニューロンの高解像度画像、共焦点画像のzスタックからの投影。右のパネル：ソーマに配信短い脱分極電流パルス（下のトレース）によって100 Hzで開始4 APのバースト。 Backpropagating心尖部と樹状突起に沿って斜めの6選択された場所（1-6）からction潜在的なシグナル。 〜3トレース1は、単一の裁判記録から得られた。トレースは5と6が16トライアルの平均値であるときにトレース4は、4トライアルの平均です。
棘が根底可塑性およびおそらく学習と記憶のメカニズムは、最近では脳の機能のために、その重要な意味合い（ユステ、2010）のかなりの注目を集めていることをシナプス効力を変更することの電気的な役割を持っているという仮説。この仮説のか反対か賛成でほとんど直接的な実験的証拠は、しかし、があります。間接的な結果の解釈と樹状突起棘の電気的挙動についての直接的な証拠の欠如の不確実性は、主に方法論的な制限のためにある - 棘は小さく、電気生理学の従来の方法ではアクセスできません。したがって、に頼って実験データの存在しない場合に、この質問を調査しようとしスパイン形態と背骨の首の拡散特性に基づいて電気的パラメータの推定値とコンピュータシミュレーション。ここで説明した電圧イメージングアプローチは、活動電位信号と高感度を持つ個々の樹状突起棘の空間スケールでのシナプス電位信号を監視することが可能になります。実験は、現在直接樹状突起棘の電気的挙動に関する基礎的な理論上の予測をテストするように設計することができる。個々の樹状突起スパインと親樹状突起におけるbackpropagating APに関連する光信号の例を図5に示します。
図5：個々の樹状突起のスパインからの活動電位信号。左パネル：上部顕微鏡 - スピニングディスク共焦点画像スタックから得られる解剖学的再建。下段顕微鏡写真 - フロリダ州同じ領域のuorescence画像はV M-撮像するCCDカメラを用いて得られた。右のパネル：CCD画像上で概説1から3の場所からBAPに対応する蛍光強度のトレース。 9試験の時間的な平均値。ボトムトレース：ソーマから電極録音。棘がないエリアからのトレース3は、スライスの浅層における光散乱の低いレベルを示す検出可能なシグナルを持っていないことに注意してくださいませ。
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Discussion
この記事では、サブミクロンおよびサブミリ時空間分解能で個々の神経細胞の電気的活動を監視するための電位感受性色素記録方法を説明します。最適に近い波長のレーザー励起が（信号の大きさに関して）従来のアプローチ以上〜50倍記録の感度を向上させました。感度電流は樹状突起、軸索、軸索側枝と軸索末端だけでなく、個々の樹状突起棘を含む個々のニューロンのすべての部分からの電気信号を、監視できます。現在の感度で、膜電位の過渡の録音は最大20 kHzまでのフレームレートで行うことができる。ささやかな信号平均（4月25日の試験では）容易に2から5倍の信号対ノイズ比として表さ録音の感度を向上させることができます。電圧イメージングの主な制限は、絶対電圧スケール上の複数の場所からの光信号の簡単なキャリブレーションの欠如である。いくつかの準備中sは、これはすべての場所での既知の振幅を有する膜電位信号を見つけることによって解決することができます。 6軸索で、いくつかの完全に興奮樹状突起のAP信号は、優れた校正標準を提供します。
この方法論の適用における重要なステップは次のとおりです。
- 急性脳スライス（<30μm）の表面近くにあるニューロンに録音を制限することによって、光散乱の影響を最小限に抑えることができます。これは、スライス1の上層に健康なニューロンの高い割合を取得しスライシング手順を最適化する必要がありました。
- ニューロンの迅速なローディングを保証するために染料を提供するための電極の先端に透明な溶液の量を最適化する。
- 光記録に過剰なノイズの発生源になります準備の機械的振動を排除。
- 振幅のRMSノイズと低ノイズの連続波（CW）レーザを用いて<0.5％を元のソースとして引用光。
- 記録期間の長さを基準に適切な励起光強度を選択することにより、ダークピリオドでの連続録音を分離することで、光線力学的損傷を制御する。長時間録画期間は光線力学的損傷を防止するために低い光強度を必要とします。
上に示した記録の例は、背骨や軸索生理学のターニングポイントを示しています。これらの録音は、直接過去だけで理論的な根拠に基づいて分析することができる電気のイベントを記録することができるという驚くべき力を明らかにする。
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Disclosures
デヤンZecevic彼はLLCをRedShirtImagingの共同経営者。、電位感受性色素記録に使用される高速、低ノイズCCDカメラに特化した会社であることを宣言します。他のすべての著者らは金銭的な利益または現在の研究に関連した潜在的な利益相反が報告されていない。
Acknowledgments
私たちは親切に染料を提供するためレスリー·M.·レーブにだけでなく、この技術の初期開発に参加した私たちの共同研究者クヌートHolthoff、アーサーKonnerthとマルコCanepariに感謝しています。 NSFの助成金、IOS-0817969、NIHの助成NS068407とM136043で、エール大学神経科学カヴリ研究所によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss Axi–xaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392x1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
References
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