Spenning-sensitive Dye Opptak fra Axoner, dendritter og dendrittiske spines av enkelte nerveceller i hjernen skiver

Summary

En avbildningsteknikk for monitorering av membranpotensialet forandringer med sub-mikrometer romlig og sub-millisekund tidsoppløsning er beskrevet. Teknikken er basert på laser eksitasjon av spenningssensitive fargestoffer, kan målinger av signaler i axoner og axon collaterals, terminal dendritic grener og individuelle dendritic spines.

Abstract

Forstå biofysiske egenskaper og funksjonelle organisering av single nevroner og hvordan de behandler informasjon er grunnleggende for å forstå hvordan hjernen fungerer. Den primære funksjon av noen nervecelle er å behandle elektriske signaler, vanligvis fra flere kilder. Elektriske egenskaper av neuronal prosesser er usedvanlig kompleks, dynamisk, og, i det generelle tilfelle, er umulig å forutsi i fravær av detaljerte målinger. Å få en slik måling en ville, ideelt sett, liker å være i stand til å overvåke, på flere områder, terskelnivået hendelser som de reiser fra nettstedene til opprinnelsen på neuronal prosesser og summate på spesielle steder å påvirke handlingen potensielle innvielse. Dette målet har ikke blitt oppnådd i noen nevron grunn av tekniske begrensninger av målinger som benytter elektroder. For å overvinne denne ulempen, er det svært ønskelig å utfylle patch-elektroden tilnærming med avbildningsteknikker som tillater omfattende parallell Recordings fra alle deler av et nevron. Her beskriver vi en slik teknikk - optisk innspilling av membran potensielle transienter med organiske spenningssensitive fargestoffer (V _m-imaging) - preget av sub-millisekund og sub-mikrometer oppløsning. Vår metode er basert på banebrytende arbeid på spenningssensitive molekylære prober ^2. Mange aspekter av den opprinnelige teknologien har blitt kontinuerlig forbedret over flere tiår ^{3, 5, 11.} I tillegg, tidligere arbeidserfaring dokumentert to essensielle egenskapene V _{m-bildebehandling.} Først, fluorescens-signaler er lineært proporsjonal til membranpotensialet over hele fysiologiske området (-100 mV til +100 mV, ^{10, 14, 16).} Det andre, lasting nerveceller med spenning-sensitive fargestoff som brukes her (JPW 3028) ikke har påviselige farmakologiske effekter. Den innspilte utvidelse av piggen under fargestoff lasting er fullstendig reversibel ^{4, 7.} I tillegg viser eksperimentelle bevis for at det er mulig å fremskaffeet betydelig antall (opptil flere hundre) av opptak før påvisbare fototoksiske effekter ^{4, 6, 12, 13.} I dag, tar vi fordel av det utmerkede lysstyrke og stabiliteten av et laser lyskilde på nær optimal bølgelengde for å maksimere følsomheten av V _{m-avbildningsteknikk.} Den nåværende følsomhet tillater flere reiser optiske opptak av V _m transienter fra alle deler av et nevron, inkludert axoner og axon collaterals, terminal dendrittiske grener, og individuelle dendrittiske spines. Relevant informasjon om signal interaksjoner kan analyseres kvantitativt samt direkte visualisert i form av en film.

Protocol

1. Utstyr Setup

Trinn 1.1. Imaging oppsett

Nøkkelen til opptak spenningsstyrte dye signaler er riktig oppsett design. Vi bruker en oppreist mikroskop (BX51WI Olympus eller Zeiss AxioExaminer) utstyrt med tre kameraer. Oppsettet er utviklet for belysning individuelle nerveceller i hjernen skiver av eksitasjon lys i epi-fluorescens, wide-felt mikroskopi modus ved hjelp av enten Nikon 60X/1.0 NA eller Zeiss 63X/1.0 NA vann dipping mål. Våre mikroskoper er boltet til en vibrasjon isolasjon bord og utstyrt med motoriserte bevegelige stadier. Hver mikroskop er utstyrt med tre kamera porter. Ett kamera port har en standard høy romlig oppløsning CCD-kamera for infrarød DIC video-mikroskopi (IR-1000, Dage MTI, USA). Det andre kameraet porten har en rask datainnsamling kamera (opp til 20 kHz bildefrekvens) med relativt lav romlig oppløsning (80 x 80 piksler), men enestående dynamikk (14 biter) og eksepsjonelt lavt lesestøy (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA). Det tredje kameraet porten har en CCD-kamera med høy romlig oppløsning (PixelFly, 1392x1024 piksler, PCO AG, Tyskland) montert på en roterende plater confocal scanner (CSU-10, Yokogawa, Japan) som brukes til å samle z-stabler av confocal bilder for detaljert morfologiske rekonstruksjon av farget celle. En frekvens-doblet diode-pumpet Nd: YVO4 kontinuerlig bølge laser (400 mW) emitting ved 532 nm (MLL-III/400 mW; CNI, Changchun, Kina) er kilden til eksitasjon lys. Den 2 mm diameter laserstrålen gated ved en lukker (LS6; Vincent Associates) ledes til en lysleder koplet til mikroskopet via en én port epifluorescence kondensator (TILL Photonics GmbH, Grafelfing, Tyskland) er utformet for å overfylle baksiden blenderåpning på objektiv og gi nær jevn belysning av objektet flyet. Laserlyset blir brukt i stedet for en konvensjonell Xenon arc-lampe for å maksimere følsomheten V _m-avbildning ved å: (1) ved hjelp av en monokromatisk exsitat lys i den røde fløyen av absorpsjonsspektrum å maksimere v _m følsomhet ^{9 fargestoff, 10} og (2) å øke intensiteten av magnetiseringssystemet lyset utover nivået som kan oppnås ved en bue-lampe. Eksitasjon lyset ble reflektert til forberedelse av et dikroisk speil med en sentral bølgelengde på 560 nm og den innspilte fluorescens lyset ble ført gjennom en 610 nm barriere filteret (en Schott RG610). Den kombinerte effekten av en økning i lysintensitet og bruk av nær optimale monokromatiske eksitasjonsbølgelengdene var en dramatisk forbedring i følsomhet av spenning imaging ved en faktor på ca 50 i forhold til tidligere målinger ^6.

Trinn 1.2. Juster for jevn belysning

Bruk en fluorescens lysbilde standard (grønn eksitasjon / rød utslipp). Sett passende nøytral tetthet filtre i laserstrålen banen slik at CCD er ikke mettet. Fokus målet på overflaten avlysbildet. Justere plasseringen av den mottakende ende av kvarts lysleder foran laser bærerakett objektiv, og justere posisjonen utgangsende lysleder festet til ved hjelp av egnede aktuatorer mikroskopet på epi-fluorescens kondensator å oppnå sentrert og ensartet belysning av synsfeltet.

Trinn 1.3. Bestem vibrasjonen støy

Plassere en liten svart blekk merke på overflaten av fluorescensen lysbildet. Record lysintensitet med NeuroCCD i kontinuerlig opptaksmodus. Fokuser målet på en mørk kant av svart blekk mark. Registrere lysintensiteten for ca 100 msek ved 2 kHz bildefrekvens. Vise romlige gjennomsnitt av de fraksjonerte lysintensitet spor (Af / f) fra ~ 20 piksler mottar lys fra den jevnt belyst området og fra ~ 20 piksler langs kanten av blekket mark. Det overskytende støy i opptak fra piksler med høy kontrast kanter gjenspeiler vibrasjonen støy isystemet.

Trinn 1.4. Vibrasjonsisolering

Det er obligatorisk for å redusere vibrasjoner ved hjelp av en vibrasjonsfri isolert tabell til et nivå under skuddet støy på lysintensiteter sammenlignbare til eksperimentelle opptaksforhold. Juster vibrasjonsisolasjon tabellen til vibrasjonsstøy i lysintensiteten fra piksler dekker den skarpe kanten av bildet er ubetydelig. Ingen av utstyret med bevegelige deler (mekaniske skodder, vifter) kan monteres på bordet. Kablene fra utstyret på bordet festet til andre komponenter som ikke er isolert fra vibrasjon må være løs, slik at de ikke overfører mekaniske vibrasjoner til mikroskopet.

2. Valg av en passende Neuron for V _m-Imaging

Trinn 2.1. Valg av nerveceller

Merke hjernen skiver i henhold til standard prosedyrer. Bruke mus linje uttrykker EGFP i enkelte nerveceller av interest. Med en roterende plate confocal system, visualisere EGFP merket nevroner i stykket. Velg nevroner for V _m-avbildning med intakte dendrittiske / aksonal trær og med prosesser som går parallelt og nær overflaten av skiven. Dette kan ikke oppnås i villtype mus fordi axoner og tynne dendritter, for det meste, er ikke synlig i DIC mikroskopi modus.

3. Lasting Neurons med spenningssensitive Dye

Trinn 3.1. Fylling av plasteret pipette

Fyll glass patch pipetter fra spissen med fargestoff-fri intracellulær løsning ved å anvende et undertrykk i ca 15 s opp til 2/3 av elektroden avsmalningen. Fargestoffet gratis løsning i spissen er nødvendig for å hindre utslipp av fargestoff på stykke som øker bakgrunnsfluorescens og dramatisk reduserer signal til støyforhold. Back-fyll elektroden med oppløsning inneholdende membranen impermeant spenningsfølsom fargestoff JPW3028 oppløsti intracellulær løsning (0,8 mM).

JPW3028, den mest vellykkede spenningsprobe for intracellulær applikasjon, er en dobbelt positivt ladet analog av ANEP serie lipofile styryl fargestoffer som er likevel tilstrekkelig vannløselig til å brukes for mikroinjeksjon. Di-etyl analog av denne fargestoff har praktisk talt identiske karakteristika (inkludert spenningsstyrt følsomhet) og er kommersielt tilgjengelig som JPW1114 (se tabell 1). Vi forbereder 20 mM stamløsning i destillert H ₂ O. 50 ul alikvoter av stamløsningen holdes frosset ved -20 ° C. For den endelige fargestoff konsentrasjon på 0,8 mM, er 2 ul av stamløsningen oppløst i 50 pl av intracellulær løsning på dagen av eksperimentet. Bestanden fargeløsning er stabil og kan oppbevares ved romtemperatur i flere måneder. Så følger vi en 50 ul alikvot ved romtemperatur inntil det er brukt opp.

Trinn 3.2. Etablere en giga-forsegling raskt

Trinn 3.3. Overvåke nivået av flekker

Under fargestoff diffusjon i hele-celle konfigurasjonen, overvåke fysiologiske tilstand nervecellen ved å registrere fremkalt aksjonspotensialer i gjeldende-klemmen modus. I tillegg overvåke mengden av flekker ved å registrere hvile lysintensitet (RLI) fra cellen soma på en bildefrekvens på 2 k Hz og til en brøkdel av en lysintensitet justert med nøytral tetthet filtre (vi bruker 0,04% av laserlys intensitet fra en 400 mW laser). Fortsett fargestoffet lessingen inntil aksjonspotensialet begynner å utvide, vanligvis etter 20-40 minutter, avhengig av størrelsen og elektroden motstand.

Utvidelsen av aksen er fullstendig reversibel og mest sannsynlig på grunn av kapasitiv last effekt av den mettede konsentrasjonen av fargestoff i somatiske membran. Bølgeformen til nålen er fullt gjenopprettet etter fargestoff konsentrasjonen er ekvilibrert hele neuron.

Trinn 3.4. Fjerne fargestoff elektroden

Ved utgangen av flekker perioden, trekk plasteret pipetten unna soma i spenning klemmen konfigurasjon sikrer at overgangen fra hel-celle til utsiden-out patch konfigurasjonen oppnås i prosessen.

Trinn 3.5. Vent på dye diffusjon

ent "> Inkuber stykke for ytterligere 1,5 til 2 timer ved romtemperatur for å tillate spenningen-følsomme fargestoff å spre seg inn nevronale prosesser. Etter en betydelig mengde av fargestoff diffunderer bort fra soma inn dendrittiske og aksonal prosesser, bølgeform AP er fullstendig restaurert.

4. Optisk Opptak

Trinn 4.1. Velg en mobil avdeling for bildediagnostikk

Finne soma av farget nervecellen under dårlige lys nivå fluorescens og re-patch nervecellen med en standard (ingen fargestoff) patch elektroden som DIC. Visualisere nevrale prosesser under lavt lysnivå med en bildefrekvens på 10-40 Hz i kontinuerlig opptaksmodus av CCD for spenning-imaging. Redusere lyset nivå med nøytral tetthet filtre til et minimum for å visualisere gjenstand for interesse. Vi bruker 0,01% av 400 mW laser intensitet under posisjonering av farget neuron. Ved hjelp av en XY stadium, posisjonere neuronal prosessen av interesse i than midten av bildeområdet. Beskytt soma fra eksitasjon lys ved hjelp av delvis lukket feltblender iris av mikroskopet. Skjerming soma fra høy intensitet magnetisering lys vil redusere fotodynamisk skade under innspillingen.

Trinn 4,2 Record optiske signaler knyttet til membran potensielle transienter

Spille optiske signaler knyttet til backpropagated aksesspunkter i enkelte dendrittiske grener. Spille optiske signaler knyttet til APS i axon. Spille optiske signaler knyttet til backpropagating aksesspunkter i dendrittiske spines. Bruk bildefrekvens passende for nøyaktig rekonstruksjon av signal bølgeform og holde innspilling perioder og eksponering for høy intensitet magnetisering lys så korte som mulig for å minimere farge bleking og fotodynamisk skade. For eksempel undersøke rekkefølgen av initiering og forplantning av enkle aksjonspotensialer i axon krever opptak perioder på 5-10 msek. Eksitasjon lys intensivertty under opptak er et kompromiss mellom signal-til-støy-forhold på den ene side og den grad av fargestoff bleking og fotodynamisk skader på den annen side. Vi bruker 100% av intensiteten av 400 mW laser i opptak fra lange deler av axoner når et område på 300 mikrometer i diameter er opplyst. Når magnetiseringsstrømmen lyset fokuseres til en 30 um diameter område for dendrittiske ryggraden bildebehandling, bruker vi 10-25% av laser lysintensitet. Den nødvendige varighet av opptaket er en viktig determinant for optimal eksitasjon lysintensiteten; kortere opptak perioder tillate høyere lysintensiteter. Den optimal belysning intensitet er best bestemmes empirisk for hvert preparat og måling innstillinger.

5. Dataanalyse

Trinn 5.1. Korrigere rådata til kjente feil

Analysen og visning av data ble utført ved hjelp av NeuroPlex program (RedShirtImaging) skrevet i IDL (ITT Visual Information solutioner, Boulder, Colorado) og tilpassede Visual Basic rutiner. Under betingelsene for lave lysnivåer, blir bakgrunnsfluorescens en betydelig determinant av Af / F-signalet størrelse. Rådataene ble først korrigert for denne effekten ved å subtrahere den gjennomsnittlige bakgrunnsfluorescens intensitet bestemmes fra et unstained område på skive. Deretter ble signalet innretting programvare som brukes til å korrigere for temporal jitter i AP initiering samt for eventuelle små bevegelser av preparatet under gjennomsnitt. I temporale domenet ble AP signaler justert ved krysskorrelasjon av den elektrisk innspilt ApS i hvert forsøk til referansesignalet ervervet ved starten av gjennomsnitt (figur 1B). I den romlige domenet ble bildene justert i to dimensjoner frakoblet etter bilde kryss-korrelasjon for å kompensere for mulige små sidebevegelser av preparatet. Korrekt fokus av bildet i z-dimensjonen ble bekreftet før hver enkelt rettssak; smal l justeringer var ofte nødvendig. Den romlig og tidsmessig innrettede signaler ble midlet som vist i figur 1B. Langsomme endringer i lysintensitet grunnet bleking av fargestoffet ble korrigert ved å dividere dataene ved en passende dual eksponential funksjon avledet fra opptaket forsøk med ingen stimulering (figur 1B). Bølgeformen av AP signalet ble rekonstruert fra et sett av data som bruker Cubic Spline interpolasjon, en stykkevis kontinuerlig kurve som går gjennom hvert datapunkt. For å bekrefte at spenningssensitive fargestoff signalet sporer membranpotensialet uten betydelig forvrengning på millisekund tidsskalaen, ble det elektriske signalet fra AP soma sammenlignet til den optiske AP-signalet fra den tilstøtende axon hillock som vist i figur 3B. De to signalene superimpose svært tett, noe som åpner for skudd støy i optisk innspilling.

les/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg "/>
Figur 1. Dataanalyse (Animasjon). (A) Øvre panel: høy oppløsning confocal bilde av en farget nervecellen med axon i opptak. Innspilling elektroden knyttet til soma og ekstracellulære stimulerende elektrode ved siden basal dendrite vist skjematisk. Aksjonspotensialer fremkalt av ekstracellulær, synaptisk stimulering. Nedre panel: lav romlig oppløsning fluorescens bilde av axon innhentet av CCD brukes for V _m imaging (B) Elektrode opptak fra soma (svarte spor), optiske opptak fra AIS (røde spor), og fra noden Ranvier (grønne spor). . Topp spor: rådata fra 9 studier som viser temporal jitter i AP innvielsen. Andre rad av spor: timelig justert signaler. Tredje rad av spor: middelverdisignal. Fjerde rad spor: bleike korreksjon. Bunn spor: kubisk spline interpolasjon med ett pass av temporal glatting.

Representative Results

Vellykket konfokalmikroskopi bør tillate klar identifikasjon av intakte neuronale prosesser som er nær overflaten av stykket og plassert i ett plan av fokus. Valget av nerveceller som er aktuelle for spenning imaging før spenningssensitive fargestoff lasting er kritisk. Et eksempel på confocal bilder av L5 pyramidale nevroner uttrykker EGFP i kortikale stykke (Crym transgen mus linje) er vist i figur 2. Axons av individuelle nevroner er klart synlig. Celler med lange intakte axoner (hvite piler) i ett plan av fokus nær overflaten av stykket ble valgt.

Figur 2. Valg av L5 kortikale nevroner for V _m-avbildning av AP signaler fra axons. Lav (til venstre) og høy (høyre) forstørrelse bilder av samme stykke regionen, 488 nm eksitasjon ved hjelp Yokogawaroterende disk skanner.

Den romlige mønster av Na-kanal clustering i axon første segmentet (AIS) spiller en avgjørende rolle i tuning neuronal beregninger og endringer i Na-kanal distribusjon er vist å mediere nye former av neuronal plastisitet i axon. Imidlertid kan immuncytokjemisk data på kanalen distribusjon ikke direkte forutsi Spatiotemporal egenskapene aksjonspotensialet initiering, og før elektrofysiologiske tiltak er enten indirekte (ekstracellulære) eller mangler tilstrekkelig romlig oppløsning (intracellulær) til direkte karakterisere pigg trigger sonen (TZ). En kritisk metodisk forbedring i følsomhet membranpotensialet avbildningsteknikk beskrevet her tillater direkte bestemmelse av plasseringen og lengden av spike TZ som definert i funksjonelle termer. Et eksempel på innspilling AP signaler ved høy romlig og tidsmessig oppløsning er vist i figur 3.. Figur 3B illustrerer atden tilgjengelige følsomheten V _m-avbildning var tilstrekkelig for nøyaktig overvåking av subthreshold depolarisering forut den regenerative AP-signalet. Tillegg bekreftet sammenligning av de optiske signaler fra AP soma / axon Lichfield og fra en mer distal noden Ranvier at AP har markert forskjellige dynamikk på disse to steder ^{8, 15,} og både upstroke og downstroke av AP var raskere i noden Ranvier. For detaljer om Spatiotemporal oppløsning grenser i målinger av størrelsen og plasseringen av spike TZ se figur 3 og 5 i Popovic et al. (2011).

Figur 3. Aksjonspotensiale signaler fra axon. (A) Øvre panel: høy oppløsning confocal bilde av en L5 kortikale nevroner lastet med spenningen-sensitive fargestoff med axon i opptak posisjon; projeksjon frOm en z-stack av confocal bilder. Opptak / stimulere patch elektrode festet til soma. Nedre panel: lav romlig oppløsning fluorescens bilde av axon erholdt ved CCD brukt for V _{m-avbildning.} (B) AP relaterte signaler spilt inn med en bildefrekvens på 10 kHz. Spor på høyre: AP transienter fra tre steder: 1-elektrode opptak fra soma, 2-optisk opptak fra axon hillock, 3-optisk opptak fra den første noden Ranvier. Bottom spor: superimposed signal fra de samme tre steder.

Den ikke-lineære samspill mellom eksitatoriske postsynaptiske potensialer (epsps) og BAPS i dendritter som er ansvarlig for induksjon av LTP er ikke fullt ut forstått. Denne interaksjonen avhenger kritisk på amplituden av begge signalene og må derfor være romlig uensartet. Den eksperimentelle test av denne forutsigelse trenger romlig godt oppløste målinger som ikke har vært foretatt fordi dendrittiske grener med liten diameter ikke er enccessible til elektrode målinger. Membranen potensielle avbildningsteknikk beskrevet her tillater overvåking av elektriske signaler fra flere steder i hele dendrittiske arbor som vist i Figur 4. Mønsteret for BaP aktivitet i dendrittiske arbor er preget av natrium dagens dominert toppene i proksimale områder som gradvis endret til langvarig kalsiumstrømmen dominert depolariserende hendelser i distale dendritter.

Figur 4. Aksjonspotensiale signaler fra flere steder på dendrittiske arbor av en L5 kortikale nevroner. Venstre panel: høy oppløsning av en L5 kortikale nevron lastet med en spenning-sensitiv fargestoff; projeksjon fra en z-stabel med confocal bilder. Høyre panel: et utbrudd av 4 AP initiert ved 100 Hz ved korte depolariserende strømpulser (bunn) levert til soma. Backpropagating enDette skjer potensielle signaler fra seks utvalgte steder (1-6) langs den apikale og skrå dendritter. Spor 1 til 3 ble hentet fra en enkelt prøveopptak. Trace 4 er en fire rettssak gjennomsnitt, mens spor 5 og 6 er seksten rettssaken gjennomsnitt.

Hypotesen om at spines har en elektrisk rolle endre synaptiske effekt som ligger til grunn plastisitet og muligens læring og hukommelse mekanismer har nylig fått stor oppmerksomhet på grunn av sin kritiske konsekvenser for hjernens funksjon (Yuste, 2010). Det er imidlertid svært liten direkte eksperimentelle bevis for eller mot denne hypotesen. Usikkerheten i tolkningen av indirekte resultater og mangel på direkte bevis om elektriske oppførselen til dendrittiske spines skyldes først og fremst en metodisk begrensning - spines er små og ikke tilgjengelig for konvensjonelle metoder for elektrofysiologi. Så forsøk på å undersøke dette spørsmålet i fravær av eksperimentelle data stolt pådatasimuleringer med estimater av elektriske parametere basert på ryggraden morfologi og diffusjonsgrenselaget egenskaper ryggraden halsen. Spenningen-imaging tilnærming beskrevet her gjør det mulig å overvåke aksjonspotensial signaler og synaptiske potensielle signaler ved romlig skala av individuelle dendrittiske spines med høy følsomhet. Forsøkene kan nå bli designet for å direkte teste de grunnleggende teoretiske forutsigelser om elektriske oppførselen til dendrittiske spines. Et eksempel på optiske signaler knyttet til backpropagating aksesspunkter i en individuell dendrittiske ryggraden og dens overordnede dendrite er vist i Figur 5.

Figur 5. Aksjonspotensiale signaler fra en individuell dendrittiske ryggraden. Venstre panel: øvre mikrografer - anatomiske rekonstruksjoner hentet fra en bunke med spinning-disk confocal bilder. Lavere mikrografer - fluorescence bilder av samme region oppnådd med CCD-kamera for V _{m-avbildning.} Høyre panel: fluorescensintensitet sporer tilsvarende BaP fra steder 1-3 skissert på CCD-bilder. Timelige gjennomsnitt av ni forsøk. Bunnekko: elektrode opptak fra soma. Merk at spor 3 fra et område uten et ryggraden har ingen detectible signal som indikerer lave lysspredning i overfladiske lag av stykket.

Discussion

Denne artikkelen beskriver en spenning-sensitive dye opptak metode for å overvåke elektriske aktiviteten enkelte nerveceller med sub-mikrometer og sub-millisekund Spatiotemporal oppløsning. Laser eksitasjon ved nær-optimal bølgelengde (angående signal størrelse) forbedret følsomhet opptaket med en faktor på ~ 50 over tidligere tilnærminger. Den nåværende følsomhet gjør overvåking elektriske signaler fra alle deler av individuelle nevroner, inkludert dendritter, aksoner, axon collaterals og axon terminaler samt individuelle dendrittiske spines. Med foreliggende følsomhet kan opptak av membranpotensialet transienter utføres på rammen på opptil 20 kHz. Beskjeden signal gjennomsnitt (4-25 forsøk) kan lett forbedre følsomheten opptaket uttrykt som signal-til-støyforholdet med en faktor på 2-5. Den store begrensning av spenning bildebehandling er mangelen på enkel kalibrering av optiske signaler fra flere steder på en absolutt spenning skala. I noen forberedelsers dette kan løses ved å finne en membranpotensiale signal som har en kjent amplitude på alle steder. AP signaler i axon og i noen fullt eksiterbare dendritter ⁶ gi en utmerket kalibreringsstandarden.

Kritiske trinn i anvendelsen av denne metoden er:

1. Minimering lysspredningsegenskaper effekter ved å begrense opptakene til nevroner lokalisert nær overflaten av akutte hjernen skiver (<30 um). Dette krevde optimalisere slicing prosedyren for å oppnå en høy andel av friske nevroner i det øvre laget av stykket ^1.
2. Optimalisere mengden av klar løsning i spissen av elektroden for å levere fargestoff å sikre rask lasting av neuroner.
3. Eliminere mekanisk vibrasjon av blandingen som kan være en kilde til overflødig støy i optisk opptak.
4. Ansette støysvake kontinuerlig bølge (CW) laser med RMS støy av amplitude <0,5% som en kilde av exsitat lys.
5. Kontrollere fotodynamisk skade ved å velge hensiktsmessig eksitasjon lysintensitet i forhold til varigheten av opptaket perioden og ved å skille suksessive innspillinger av mørke perioder. Lengre opptakstid perioder krever lavere lysintensitet for å hindre fotodynamisk skade.

Opptakslagene eksemplene ovenfor indikerer et vendepunkt i ryggraden og axon fysiologi. Disse opptakene avslører bemerkelsesverdig kraft av å være i stand til å direkte spille elektriske hendelser som bare kunne analyseres på teoretisk grunnlag i det siste.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Setup components
Upright Microscope	Olympus Inc.	BX51WI	With three camera ports
Motorized Movable Stage	Siskiyou	MXOPi.2
Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51	TILL Photonics	0000-560-11659
Upright Microscope	Carl Zeiss, LLC	AxioExaminer D1	With three camera ports
Motorized Top Plate	Scientifica Limited	MMBP
Epi-fluorescence Condenser for Zeiss Axi–xaminer	TILL Photonics
Data Acquisition Camera	RedShirtImaging LLC	NeuroCCD-SM	High speed, low read noise
CCD for IR-DIC	Dage-MTI	IR-1000
Spinning-Disc Confocal Scanner	Yokogawa	CSU-10
High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner	PCO AG	PixelFly	1392x1024 pixels
DPSS CW Laser (532 Nm)	CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd	MLL-III-532 400mW	Excitation light source
Multi-Mode Fiber Launcher	Siskiyou	SM-CFT
Light Guide	TILL Photonics	0000-515-11524
Shutter	Vincent Associates	LS6
Vibration Isolation Table	Minus k Technology	MK26
Specific reagents
Di-2-ANEPEQ (JPW 1114)	Life Technologies	D-6923	Voltage sensitive dye
Crym-EGFP Mouse Line	GENSAT (MMRRC)	STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd	Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons