Esplorare arteriosa Muscolo liscio KV7 Funzione canale del potassio con morsetto Elettrofisiologia Patch e Myography pressione

Summary

Misure di KV7 (KCNQ) canale attività di potassio in miociti isolati arteriosi (utilizzando tecniche elettrofisiologiche di patch clamp) in parallelo con misure di constrictor / dilatatore risposte (usando myography pressione) può rivelare importanti informazioni sul ruolo di KV7 canali in fisiologia vascolare muscolatura liscia e farmacologia.

Abstract

Contrazione o rilassamento delle cellule muscolari lisce all'interno delle pareti delle arterie di resistenza determina il diametro dell'arteria e controlla quindi il flusso di sangue attraverso il vaso e contribuisce alla pressione arteriosa sistemica. Il processo di contrazione è regolato principalmente dalla concentrazione di calcio citosolico ([Ca ^{2 +]} _cyt), che è a sua volta controllata da una serie di trasportatori e canali ionici. I canali ionici sono intermedi comuni vie di trasduzione del segnale attivati ​​da ormoni vasoattivi per effettuare vasocostrizione o vasodilatazione. E i canali ionici sono spesso presi di mira da agenti terapeutici intenzionalmente (es. calcio antagonisti utilizzati per indurre vasodilatazione e la pressione sanguigna più bassa) o involontariamente (ad esempio per indurre indesiderati effetti collaterali cardiovascolari).

KV7 (KCNQ) voltaggio-attivati ​​i canali del potassio sono stati recentemente implicati come importante targ fisiologici e terapeuticiets per la regolazione della contrazione della muscolatura liscia. Per chiarire i ruoli specifici dei KV7 canali sia trasduzione del segnale fisiologico e nelle azioni di agenti terapeutici, bisogna studiare come la loro attività è modulata a livello cellulare e valutare il loro contributo nell'ambito dell'arteria intatta.

Le arterie mesenteriche ratto forniscono un utile sistema modello. Le arterie possono essere facilmente sezionato, puliti del tessuto connettivo, e utilizzato per preparare isolate miociti arteriosi patch clamp per elettrofisiologia, o incannulata e pressione per misure di vasocostrittori / vasodilatatore risposte fisiologiche in condizioni relativamente. Qui descrivere i metodi utilizzati per entrambi i tipi di misure e di fornire alcuni esempi di come il disegno sperimentale possono essere integrati per fornire una comprensione più chiara dei ruoli di questi canali ionici nella regolazione del tono vascolare.

Protocol

1. L'escissione chirurgica del Arcade Piccolo intestinale vascolare mesenterica

1. Anestetizzare un g 300-400 Sprague-Dawley ratto con isoflurano (4%), somministrato per inalazione.
2. Eseguire una laparotomia mediana per esporre il mesentere dell'intestino tenue. Esteriorizzare l'intestino tenue e crasso attraverso l'incisione addominale con grande cura per evitare traumi alle viscere esposte e mesentere. Delicatamente a ventaglio il mesentere out su garza sterile.
3. Chirurgicamente accise tenue e una porzione dell'intestino crasso, compreso l'intestino cieco (vasi sanguigni accuratamente tagliati lungo i margini e alle origini dei rami primari della arteria mesenterica superiore / vena).
4. Trasferire il tessuto asportato in un becher contenente ghiaccio soluzione fredda dissezione (Tabella 1).
5. Seguendo escissione dell'intestino, il ratto dovrebbe essere umanamente eutanasia mentre sotto anestesia.

2. Dissezione di und pulizia delle arterie

1. Trasferire l'intestino asportato e arcade mesenterica ad una camera raffreddata dissezione (4-5 ° C) contenente soluzione di dissezione. La camera consiste di un 100-mm Petri piatto di vetro con una base 184 elastomero SYLGARD per ospitare perni dissezione, la piastra di Petri è collocato in una base di raffreddamento che viene mantenuta a 4-5 ° C con un bagno di acqua circolante.
2. Utilizzando forbici chirurgiche tagliare un segmento di circa 10-12 cm dal intestino tutto. Tagliato a ciascuna estremità del segmento intestinale mantenendo la sua vascolarizzazione attaccato, e quindi rimuovere l'intestino inutilizzato dalla camera lasciando un segmento con la sua vascolarizzazione allegata (arcade mesenterica) in isolamento.
3. Fissare il segmento di intestino tenue, diffondendo il mesentere sul lato vicino della camera in modo tale che il ramo principale della arteria mesenterica superiore / vena è al centro ed i successivi ordini di rami irradiano dal centro (Figura 1). Pl asso i perni solo nei segmenti intestinali (non sui vasi sanguigni).
4. Distinguere arterie di vene dal loro colore rosso vivo relativamente, muri spessi e caratteristici a forma di V rami, piuttosto che a forma di U rami visti nelle vene.
5. Visualizzazione attraverso un microscopio da dissezione illuminato, attentamente deselezionare il tessuto adiposo e il tessuto connettivo circostante la ² - 4 ^° ordine arterie vicine agli intestini (cerchio tratteggiato in figura 1) utilizzando micro pinze e forbici. Tenendo le vene adiacenti facilita compensazione del tessuto adiposo e del tessuto connettivo. Evitare inutili allungamento delle arterie.
6. Segmenti di arteria mesenterica liquidati del tessuto connettivo può essere sezionato e utilizzati per l'isolamento delle cellule (per studi di patch clamp monocellulari, sezioni 3-4) o cannulata per myography pressione (sezione 5). Tagliare i segmenti tra i punti di ramificazione, di solito fino a 1 cm di lunghezza.

jove_title "> 3. cella di isolamento per gli Studi patch clamp

1. Preparare 0,5 L di soluzione di isolamento (Tabella 1) e dividerlo in 2 porzioni prima di regolare il pH. La prima porzione (generalmente 100 ml) deve essere riscaldato fino a 37 ° C e pH deve essere regolato a 7,2 a 37 ° C (37 ° C Isolamento Solution). La seconda porzione della soluzione di isolamento deve essere raffreddato a 4 ° C e il pH deve essere regolato a 7,2 a 4 ° C (soluzione di isolamento ghiaccio freddo). Dopo la regolazione del pH, l'osmolarità di entrambe le soluzioni devono essere regolati a 298 mOsm aggiungendo una quantità appropriata di D-glucosio o di H ₂ O.
2. Trasferire 2 ml di 37 ° C Isolamento soluzione in una fiala di vetro e incubare a 37 ° C per l'uso al punto 3.4. Aggiungere 20 mg di albumina di siero bovino (BSA) a 10 ml di 37 ° C soluzione di isolamento, sciogliere, ri-riscaldare a 37 ° C e regolare il pH a 7,2. A 2 ml di questa soluzione aggiungere 4 mg collagenasi tipo VIII (Sigma, Lot 089K8612: 633 ulendini / attività Collagenasi mg, 285 unità / attività Caseinase mg, 1.6 mg / le unità di attività clostripaina), 0,64 mg elastasi tipo IV (Sigma, Lot 110M7025V 5,9 unità / mg, aggiungere 40 microlitri di una mg / ml 16 magazzino preparato in 37 ° Soluzione Isolamento C) e 2 ml di 1 M DL-ditiotreitolo (DTT Sigma), pre-riscaldare questa soluzione enzimatica a 37 ° C in preparazione per passo 3,5.
3. Trasferimento 2-3 segmenti dell'arteria mesenterica in un 35 mm piatto di coltura contenente 2 ml di soluzione di isolamento Ice Cold e posto il piatto sul ghiaccio. Tagliare i segmenti dell'arteria mesenterica in 3-4 mm di lunghezza pezzi.
4. Usando una pipetta Pasteur con punta fuoco lucido (per evitare di danneggiare arterie) trasferire i segmenti arteriosi in una fiala di vetro (15 x 45 mm, 1 DRAM) contenente 2 ml di pre-riscaldato a 37 ° C soluzione di isolamento e incubare per 30 min a 37 ° C.
5. Dopo 30 min, aspirare accuratamente la soluzione di isolamento 37 ° C usando una pipetta Pasteur, aggiungere 2 ml soluzione enzimatica tiepida e incubare per 35 mina 37 ° C.
6. Immediatamente dopo l'incubazione 35 min nella soluzione enzimatica, posizionare la fiala sul ghiaccio, aspirare la soluzione enzimatica e aggiungere 2 ml di soluzione di isolamento Ice Cold (aspirazione ripetizione e aggiunta di soluzione fresca Isolation Ice Cold 4 volte). Poi, in un volume di 1 ml di soluzione di isolamento Ice Cold, delicatamente triturare segmenti arteriosi con i lucidi pipetta Pasteur 10-20 volte per rilasciare singoli mesenterici cellule muscolari lisce arteriose (MASMCs).
7. Verificare periodicamente aspetto miociti mettendo una goccia di sospensione cellulare su un piatto di 35 mm e la visualizzazione al microscopio. MASMCs sani dovrebbero avere un aspetto liscio allungata. Non tutte le cellule della parete arteriosa sarà rilasciato. La sospensione cellulare deve essere tenuto in ghiaccio.
8. Un altro utile indicatore della salute MASMC è la loro tolleranza fisiologica Ca ^{2 +} concentrazioni. Riempire camera di registrazione (Strumenti Bioscience, # CSC-25L) con bagno soluzione contenente 2 mM CaCl ₂ (pH 7,3 a temperatura ambiente (RT), per la composizione vedi Tabella 1) e agar ponte posizione (vetro piegato capillare riempito con 2% di agar in 2 M KCl, inserito l'elettrodo di riferimento (Instrument Warner, REF -3L)) all'interno della camera. Usando la pipetta Pasteur lucido, trasferire circa 100-200 microlitri di sospensione cellulare per una camera di registrazione e permettere alle cellule di aderire per 15 min. Cellule non danneggiate non dovrebbero contrarre in modo significativo nel mM 2 _CaCl2 soluzione contenente (cellule dovrebbe apparire per essere allungato o a forma di bastoncello, non arrotondata delle palline).
9. Dopo aver aggiunto la prima aliquota della sospensione cellulare alla camera di registrazione, 0,25 ml di soluzione di bagno contenente 2 mM CaCl ₂ deve essere aggiunto il rimanente volume di sospensione cellulare. Questa sospensione cellulare rimanente può essere mantenuto in questa soluzione il ghiaccio e utilizzato per la registrazione del patch clamp per fino a 6 ore.

4.L'uso della pinza Whole Patch Cell per misurare KV7 correnti di potassio o membrana di tensione

1. Dopo miociti aderire alla base di vetro della camera di registrazione (25-mm No. 1 vetrino tondo, Warner Instruments), avviare perfusione continua della soluzione del bagno (Tabella 1). Per la registrazione di KV7 correnti in isolamento dalle correnti ritardo potassio raddrizzatore di KV1 e KV2 famiglie, la soluzione del bagno dovrebbe essere integrato con 100 mM GdCl _3.
2. Realizzare una pipetta di patch di vetro borosilicato (Kimax-51, Kimble Chase) con un estrattore pipetta e microforgia, la sua resistenza deve essere 4-5 MW quando è riempita con una soluzione interna (Tabella 1). Rivestire il ^_1/3 inferiore della pipetta (~ 1-2 mm sopra la punta) con SYLGARD 184.
3. Per la registrazione delle correnti MASMCs KV7, l'intera tensione di patch perforato tecnica cella morsetto deve essere utilizzato. Uso di una configurazione di patch perforato aiuta a prevenire depletion di membrana fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP ₂₎ e veloce la successiva (entro 5 minuti) sintesi delle correnti KV7, che viene comunemente osservati utilizzando la configurazione di patch di rottura. Supplemento alla soluzione interna (Tabella 1) con 120 mg / ml di amfotericina B: aggiungere 3 ml di 2 mg / ml di brodo di amfotericina B (preparato in DMSO e mantenuti congelati in piccole aliquote e al riparo dalla luce) a 0,5 ml di soluzione interna. Riempire la punta della pipetta patch con Amfotericina B senza soluzione interna immergendo il puntale nella soluzione priva B Amfotericina interna e quindi applicando aspirazione all'altra estremità con una siringa da 10 ml collegato tramite un pezzo di tubo (Tygon R- 3603). Aggiungi amfotericina B soluzione contenente pipetta dalla parte superiore utilizzando un Eppendorf Microloader punta della pipetta fino a quando la pipetta è circa la metà riempito di soluzione. Rimuovere le bolle d'aria picchiettando leggermente la pipetta. Usare la pipetta immediatamente.
4. Inserire la pipetta inal portaelettrodo e utilizzare un micromanipolatore per abbassare la pipetta alla superficie di un miociti allungata (vicino a, ma non in cima al nucleo, Figura 2). Quando la resistenza nella pipetta aumenta a 6-10 MW, applicare il vuoto per ottenere un giga-tenuta (> 10 GΩ).
5. Impostata tenendo tensione a 0 mV attesa perforazione della membrana. Applicare 100 gradini di tensione ms a +10 mV e poi a -10 mV, e utilizzare l'amplificatore per compensare rapidi transitori di capacità per pipette. In concomitanza con la comparsa di transienti interi capacità della cella, piccole correnti costanti positive (generalmente 2-10 pA) indica la presenza di canali funzionali KV7.
6. Perforazione di successo con amfotericina B riduce la resistenza accesso a 35 MW o meno. Registrazione corrente può quindi essere avviata con una tensione di 5 sec protocollo passo dalla tensione -4 azienda mV. Usiamo la tensione -4 mV tenuta per realizzare vicino inattivazione massimo di altri tipi di rec ritardatocorrenti di potassio tifier (mediata principalmente da KV1 e KV2 canali) che altrimenti contaminano la registrazione dei relativamente piccoli non inattivanti KV7 correnti. Il lungo (5 sec) protocollo gradino di tensione necessario per conseguire stato stazionario attivazione di canali KV7, che presentano lento dipendente dalla tensione di attivazione e disattivazione. Le correnti KV7 non inattivare durante le fasi di tensione sostenuti.
7. Per registrare la KV7 corrente-tensione (IV) relazione, applicare gradini di tensione 5 sec a tensioni da -84 mV, in cui la probabilità di apertura dei canali KV7 è minima, a +16 mV in cui la probabilità di apertura dei canali KV7 raggiunge plateau, dopo 5 secondi ad ogni tensione di prova, un passo indietro per la tensione di mantenimento (-4 mV) per 10 sec. Sarà necessario circa 3,5 min per la serie completa di impulsi di test (Figura 3A). Completa 2-3 di controllo registrazioni IV al fine di garantire che le correnti registrate sono stabili nel tempo. Trama media fine impulsi correnti (mediacorrenti registrate per ultimo 1 sec) contro tensione per creare una curva IV (Figura 3D). Le curve IV di controllo devono essere sovrapposti di circa se le correnti sono stabili.
8. Prima di applicare tutti gli agenti farmacologici avviare un protocollo di andamento nel tempo progettato per registrare continuamente corrente a -20 mV. Assicurare una registrazione stabile della corrente per almeno 5 minuti prima dell'applicazione farmaco. Applicare gli agenti farmacologici per 5-15 minuti o fino a stato stazionario è raggiunto (Figura 3C), quindi terminare il protocollo decorso e registrare due curve IV, utilizzando la tensione-passo protocollo. Washout del farmaco e registrare l'andamento nel tempo di washout farmaco, seguito dalla registrazione di due curve aggiuntive IV.
9. Alla fine dell'esperimento applicare linopirdine 10 pM o 10 pM XE991, inibitori irreversibili della KV7 canali; questi farmaci dovrebbero inibire completamente le correnti registrate a tensioni negative a -20 mV (Figura 3D).

5. L'uso di segmenti Arteria intatto per Myography pressione

1. Un sistema miografo pressione acquistato da Danese Myo Technology (DMT A / S, Danimarca, Modello 110P) viene utilizzata per l'esperimento myography pressione. Montare il segmento di arteria nella camera di acciaio inossidabile inserendo la cannula fissata orizzontalmente vetro sinistra in un'estremità e la cannula mobile giusto bicchiere nell'altra estremità. Due trasduttori di pressione (P1 a destra e P2 sul lato sinistro) sono integrati per monitorare la pressione all'interno del lume dell'arteria. Liquido dalla cannula bicchiere giusto sarà utilizzato per regolare la pressione all'interno dell'arteria al suo livello approssimativo fisiologico. Per iniziare, pre-riempire una siringa da 10 ml aperto (che serve come una colonna di pressione alimentazione a gravità), con soluzione lumen (Tabella 1). Sollevare la siringa per spingere soluzionizione tramite tubo di polietilene nella cannula di vetro a destra, avendo cura di evitare bolle d'aria nel tubo o cannula. La cannula sinistra dovrebbe essere pre-riempita con una soluzione lumen con una siringa da 1 ml. Riempire la camera miografo pressione con 10 ml della soluzione del bagno recipiente (Tabella 1). Liberamente sospendere due pre-made suture in nylon sottili su ogni lato adiacente al cannule di vetro.
2. Trasferire accuratamente l'sezionato segmento dell'arteria mesenterica (di solito un 3 ^° e 4 ^° segmento di ordine, circa 200-350 micron di diametro, dal punto 2.6) dalla camera di dissezione alla camera miografo pressione aggrappandosi ad una estremità del segmento utilizzando micro pinza.
3. Visualizzazione attraverso un microscopio da dissezione illuminato, tenere una estremità del segmento di arteria e delicatamente scorrere sul vetro cannula sinistra e fissare l'estremità con le suture in nylon. Lavare delicatamente il fluido attraverso il lume del vaso montato per rimuovere il sangue e detriti all'interno del vaso.La valvola a siringa sinistra dovrebbe quindi essere chiuso in modo che questo lato presenta una colonna statica di fluido contro la quale viene regolata la pressione dal lato destro.
4. Utilizzando la, posizione micromanipolatore la cannula mobile vetro destra vicino al segmento di arteria e tirare l'estremità destra del segmento sopra, infine fissaggio con le suture in nylon. Clip fuori i fili di sutura in eccesso.
5. Montare l'unità miografo pressione sul palcoscenico sopra il microscopio miografo pressione. Posizionare il coperchio sulla camera di miografo pressione. Il coperchio per la camera contenente l'ingresso superfusione e il tubo di aspirazione collegato ad esso. Collegare l'ingresso superfusione ad un collettore per consentire superfusione della vasca a temperatura ambiente o 60 mM KCl soluzione nella camera di pressione miografo per gravità. Le sostanze in esame, come i farmaci o ormoni che si trovano nelle misurazioni con la pinza delle patch di influenzare KV7 funzione del canale, sono generalmente applicati direttamente alla soluzione del bagno, non tramite il bagno superfusion o nella soluzione lume. La superfusione della soluzione del bagno sarà utilizzato per lavare la soluzione KCl. Collegare il tubo di aspirazione ad un sistema di vuoto per rimuovere l'eccesso superfusate. Inserire il sensore di temperatura nella soluzione del bagno attraverso l'apertura nel coperchio della camera miografo.
6. Collegare l'unità miografo pressione al myo-interfaccia di sistema, l'hardware che consente la comunicazione dell'unità miografo al software myoview (DMT).
7. Aprire il software myoview nel computer. Nella finestra dei parametri, impostare la temperatura desiderata di 35 ° C, con una tolleranza di temperatura di 1 ° C, pressione di afflusso bersaglio come 80 mmHg e deflusso pressione target come 80 mmHg. Caricare il file di calibrazione e calibrare il diametro esterno nave in modo che le variazioni del diametro dell'arteria riportare accuratamente in micron. Regolare il contrasto se necessario per consentire una buona visione del segmento montato sullo sfondo. Una descrizione dettagliata su come utilizzare il softwareè previsto nel manuale utente da DMT.
8. Gradualmente aumentare la siringa da 10 ml (che serve come una colonna di pressione alimentazione a gravità) per un periodo di 15 min fino al trasduttore di pressione P1 legge 80 mmHg. Mentre aumentando la colonna a pressione, verificare la presenza di eventuali perdite nel serbatoio. Se ci sono perdite, eliminare il segmento e montare un altro segmento dell'arteria (ripetere i punti da 5.2). Regolare la distanza tra le cannule quando necessario. La distanza deve essere regolata in modo tale che il segmento di arteria pressurizzato è approssimativamente rettilineo (ma non allungato) e forma una spalla come-modello in cui sono realizzati i legami (Figura 4A).
9. Accendere il riscaldamento della camera miografo pressione attraverso i controlli del myo-interfaccia di sistema. Consentire la soluzione del bagno a riscaldare gradualmente fino a raggiungere 36-37 ° C.
10. Utilizzare le regolazioni XYZ dell'obiettivo del microscopio DMT, se necessario, per mantenere la nave a fuoco e facilitare il monitoraggio accurato del changes di diametro recipiente esterno.
11. Verificare la fattibilità della nave montato da superfusione transitoria (~ 30 secondi) con 60 mM KCl. Una nave vitale restringe rapidamente con l'aggiunta di KCl e dilata immediatamente dopo washout del mM KCl 60 (superfuse circa 60 ml di soluzione del bagno per lavare il KCl). Dopo questa prova, regolare il volume della soluzione del bagno di esattamente 10 ml. La temperatura del bagno viene ridotta durante la prova KCl e washout perché queste soluzioni siano a temperatura ambiente, ma il riscaldamento della camera ripristinerà la temperatura a 36-37 ° C in pochi minuti.
12. Consentire l'arteria equilibrare per almeno 30 min (il diametro dovrebbe essere stabile per almeno gli ultimi 10 min di questo periodo). Aggiungere la sostanza di prova concentrato alla soluzione del bagno direttamente e pipettare delicatamente avanti e indietro vicino ai bordi della camera per miscelare la sostanza in esame nella soluzione del bagno, ottenendo la concentrazione finale adeguata nella camera di volume 10 ml. Changes nel seguente aggiunta diametro del vaso di sostanza di prova (s) possono essere monitorati nell'immagine video in diretta e anche tracciato nella finestra di analisi dell'immagine mentre l'esperimento è in corso.
13. Dopo il completamento dell'esperimento, i dati memorizzati (*. Myo) file può essere aperto come un foglio di calcolo per ulteriori analisi.

6. Rappresentante dei risultati

I risultati mostrati nella Figura 3 illustrano tipiche registrazioni di correnti KV7 da miociti mesenterica utilizzando un protocollo di tensione prima fase (figura 3A, B tracce nere) e durante il trattamento con un canale KV7 attivatore Zn piritione (ZnPyr, 100 nM; Figura 3A, B tracce di rosso). Analoghi dati di tensione step da 3 celle sono stati mediati per preparare i corrente-tensione (IV) rappresenta mostrati in Figura 3D. Un tempo rappresentante della valorizzazione di ampiezza corrente (misurata dalla pinza di tensione continua a -20 mV) DurinTrattamento g con 100 nM Zn piritione è mostrato in Figura 3C Figura 4B illustra l'andamento temporale dell'effetto del ZnPyr sul diametro dell'arteria mesenterica esterno misurato usando myography pressione;. la nave era pre-ristretto con 100 pM arginina vasopressina (AVP) prima aggiunta di 100 nM ZnPyr. Mediati dati dose-risposta per ZnPyr indotta dilatazione dell'arteria mesenterica sono mostrati nella figura 4C.

Figura 1. Immagine di una galleria mesenterica nella camera di dissezione.

Figura 2. Immagine di una miociti con una pipetta cerotto sulla sua superficie.

Tracce di Figura 3. Originali di KV7 correnti, andamento nel tempo dei farmaci applicazione, IV curve. Famiglia A. sequenziali tracce correnti (pannello inferiore) registrati in risposta a gradini di tensione (pannello superiore) prima del trattamento (controllo, nero) e la stabilizzazione seguito alla presenza di 100 nM ZnPyr (rosso) in un unico MASMC. B. tracce attuale rappresentante dalla A (come indicato dalla freccia) per il controllo (nero) e per 100 nM ZnPyr (rosso). Barre grigie indicano l'intervallo di tempo in cui sono stati misurati medi ampiezze di corrente per la corrente-tensione (IV) appezzamenti. Tensioni di passo sono indicate a destra da frecce. Tempo C. KV7 miglioramento corrente da 100 nM ZnPyr misurata con morsetto tensione continua a -20 mV (bar). D. media curve IV (n = 3) derivato da KV7 densità di corrente registrato prima (controllo, cerchi pieni), durante il trattamento con nM ZnPyr 100 (cerchi vuoti), e durante il trattamento con 10 pM XE991 (triangoli pieni). Non specifiche correnti di fuga sono stati sottratti come descritto da Passmore et al. ^1.

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Figura 4. ZnPyr rilassamento indotto dell'arteria mesenterica pre-ristretto con 100 pM AVP. Fotografia A. di un'arteria mesenterica montato nel miografo pressione set-up. B. Naturalmente il tempo di variazione del diametro esterno del vaso in risposta all'applicazione di 100 pM AVP (bar aperto) e applicazione del nM 100 ZnPyr (riempito bar). C. Grafico a barre che riassume i risultati di 100 nM ZnPyr indotta vasodilaion.

Discussion

I metodi e gli approcci sperimentali descritti qui sono piuttosto robusti e in grado di produrre risultati chiari e riproducibili se applicato con meticolosa attenzione ai dettagli. Buone registrazioni elettrofisiologiche e costrizione / dilatazione dei segmenti arteriosi dipendono la salute delle cellule e segmenti di arteria, rispettivamente. Preparazioni di cellule può variare da un giorno all'altro, anche utilizzando lo stesso protocollo. Le soluzioni di isolamento può essere utilizzato per un massimo di 2 settimane, ma se la qualità della preparazione cellulare è basso, per due giorni consecutivi Isolation Solutions nuovi devono essere preparati. Abbiamo trovato che le attività enzimatiche variare da lotto a lotto condizioni di isolamento e quindi (tempi di incubazione e concentrazioni di enzimi) richiedono ottimizzazione con ciascun nuovo lotto di enzimi. Abbiamo anche trovato che il protocollo di isolamento cellulare descritto qui per arteria mesenterica di ratto non è ottimale per altri letti vascolari o altre specie che possono avere un diverso mix o dentelità dei componenti della matrice extracellulare. Ogni preparazione vascolare richiede la sua ottimizzazione proprio per identificare le condizioni che producono le cellule sane. I criteri che si ritengono più utili per identificare le cellule sane sono: 1) morfologia cellulare: aspetto liscio, allungato, ma leggermente ristretto, dopo triturazione segmenti MA nella soluzione di isolamento contenente 50 mM Ca ^{2 +,} e mantenendo lo stesso aspetto quando vengono trasferiti a 2 mM Ca ^{2 +-contenente} soluzione esterna. Non tutte le cellule mantengono la loro forma allungata quasi completamente rilassato, ma solo miociti quasi completamente rilassato deve essere utilizzato per la registrazione elettrofisiologica; 2) Le cellule devono essere otticamente denso, che indica una membrana intatta intatto; 3) tensioni membrana a riposo di miociti sani utilizzati per correnti di potassio di registrazione o per la corrente-clamp della tensione di membrana dovrebbe essere più negativo di -40 mV (solitamente nell'intervallo di -45 mV a -56 mV in condizioni ioniche described nel nostro protocollo qui).

Per garantire successo registrazioni elettrofisiologiche, la soluzione del bagno e la soluzione pipetta (per la composizione vedi Tabella 1) deve essere preparato il giorno dell'esperimento. È fondamentale per regolare osmolalità delle soluzioni sia interne vasca identici (298-299 mOsm).

Isobariche misurazioni effettuate in funzione delle arterie piccole arterie (<500 micron) con myography pressione si avvicinano sempre più le condizioni fisiologiche di quanto non facciano le misure di forza isometrica effettuata utilizzando un miografo filo. Le navi in un miografo pressione sono tipicamente più sensibili agli agonisti vasocostrittori ^2-4, più strettamente approssimano le sensibilità misurati in vivo ^{5, 6.} La sensibilità a basse concentrazioni di agonisti ha permesso l'identificazione di meccanismi di trasduzione del segnale indotto da concentrazioni fisiologicamente rilevanti picomolari AVP^{7, 8.}

Myography pressione conserva la geometria della nave e mantiene l'integrità dell'endotelio. Endotelio-mediata effetti dei farmaci può essere distinto dal muscolo liscio effetti mediati effettuando misurazioni parallele in contenitori integri e endotelio-denudato ^9. L'interruzione intenzionale dell'endotelio può essere realizzato fisicamente danneggiare l'endotelio (ad esempio passando un capello avanti e indietro attraverso il lume) o mediante perfusione aria attraverso il lumen dell'arteria. La perdita della funzione endoteliale (ma non la funzione vascolare muscolatura liscia) dovrebbe essere confermata misurando una ridotta endotelio-mediata risposta vasodilatatoria all'acetilcolina in vasi pre-ristrette con un agonista ^9.

Misurazioni parallele di correnti ioniche / potenziale di membrana in miociti dell'arteria mesenterica con tecniche patch clamp e costrizione arteriosa / dilatazione dei arteri mesentericaes utilizzando myography pressione può consentire delucidazione del ruolo di specifici canali ionici in entrambe le cascate di trasduzione del segnale fisiologiche e nelle azioni di agenti terapeutici. Trattamenti di targeting specifiche classi di canali ionici o specifici intermedi trasduzione del segnale può essere in modo additivo o in sequenza per fornire informazioni meccanicistiche sui ruoli di questi canali nella regolazione della funzione dei miociti a livello cellulare e in costrizione / dilatazione delle arterie intatti. Risultati convergenti di trattamenti che aumentano o inibiscono particolari tipi di correnti ioniche con effetti corrispondenti sul diametro dell'arteria fornire interpretazioni più affidabili può essere ottenuta utilizzando il metodo di per sé. Idealmente, la concentrazione-dipendenza degli agenti in studio deve essere determinato in entrambi i sistemi. Per valutare rilevanza fisiologica o terapeutici, le concentrazioni devono essere correlato alle concentrazioni misurate nell'ambiente o fisiologicor ottenuto con terapie cliniche. Esempi di questi tipi di approcci sperimentali possono essere trovate nelle nostre precedenti pubblicazioni ^8-10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S5886	Dissecting Solution: 145 Bath solution for Electrophysiology*: 140 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 140 Bath solution for pressure myography: 145 Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride	Sigma	P5405	Dissecting Solution: 4.7 Bath solution for Electrophysiology*: 5.36 Internal solution for electrophysiology: 135 Isolation solution for myocytes*: 5.36 Bath solution for pressure myography: 4.7 Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA	Sigma	E4378	Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES	Sigma	H9136	Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate	Sigma	S5136	Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate	Sigma	P5655	Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride	Sigma	M2393	Bath solution for Electrophysiology*: 1.2 Internal solution for electrophysiology: 1 Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride	Sigma	C7902	Bath solution for Electrophysiology*: 2 Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate	Fisher Scientific	BP331-1	Dissecting Solution: 1.2 Bath solution for pressure myography: 1.2 Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643	Dissecting Solution: 1.17 Bath solution for pressure myography: 1.17 Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS	Fisher Scientific	BP308	Dissecting Solution: 3 Bath solution for pressure myography: 3 Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid	Sigma	P4562	Dissecting Solution: 2 Bath solution for pressure myography: 2 Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate	Research Organics	9572E	Dissecting Solution: 0.02 Bath solution for pressure myography: 0.02 Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose	Sigma	G7021	Dissecting Solution: 5 Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 20 Isolation solution for myocytes*: 10 Bath solution for pressure myography: 5 Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin	Sigma	A3912	Dissecting Solution: 1% Lumen solution for pressure myography: 1%
pH			Dissecting Solution: 7.4 Bath solution for Electrophysiology*: 7.3 Internal solution for electrophysiology: 7.2 Isolation solution for myocytes*: 7.2 Bath solution for pressure myography: 7.4 Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity			Dissecting Solution: 300 Bath solution for Electrophysiology*: 298 Internal solution for electrophysiology: 298 Isolation solution for myocytes*: 298 Bath solution for pressure myography: 300 Lumen solution for pressure myography: 300
*11
Table 1. Components of solutions used in the experiment.