Summary
מדידות של Kv7 פעילות ערוץ (KCNQ) אשלגן בmyocytes העורק המבודד (באמצעות תיקון לצבוט טכניקות אלקטרו) במקביל למדידות של תגובות הכווץ / מרחיב (באמצעות myography לחץ) יכולות לחשוף פרטים חשובים על התפקידים של Kv7 ערוצים בפיזיולוגיה של שריר חלק של כלי דם ו פרמקולוגיה.
Abstract
התכווצות או הרפיה של תאי שריר חלק בתוך החומות של עורקי התנגדות קובעת את הקוטר העורק ובכך שולטת בזרימת הדם דרך כלי הדם ותורמת ללחץ דם מערכתי. תהליך ההתכווצות מוסדר בעיקר על ידי ריכוז cytosolic סידן ([Ca 2 +] CYT), שהוא בתורו נשלט על ידי מגוון רחב של מובילי יון וערוצים. תעלות יונים הן חומרי ביניים נפוצים במסלולי העברת אותות המופעלים על ידי הורמוני vasoactive לחולל התכווצות כלי דם או הרחבת כלי דם. ותעלות יונים לעתים קרובות ממוקדות על ידי סוכנים טיפוליים בכוונה (חוסמי תעלות סידן כגון שימוש כדי לגרום התרחבות ולחץ דם נמוך) או שלא בכוונה (למשל כדי לגרום לתופעות לוואי לא רצויות לב וכלי דם).
(KCNQ) ערוצי אשלגן מתח הופעל Kv7 לאחרונה היו מעורבים כטארג פיסיולוגי והטיפולי חשובETS לויסות התכווצות שריר חלק. כדי להבהיר את התפקידים הספציפיים של Kv7 ערוצים הוא בהעברת אותות פיזיולוגית ובפעולות של סוכנים טיפוליים, אנחנו צריכים ללמוד איך הפעילות שלהם היא מווסתת ברמה התאית, כמו גם להעריך את תרומתם בהקשר של העורק ללא פגע.
עורקי mesenteric העכברוש מספקים מערכת מודל שימושית. העורקים יכולים להיות גזורים בקלות, ניקו של רקמת חיבור, ומשמשים להכנת myocytes העורק מבודד לתיקון המהדק electrophysiology, או cannulated ולחץ גבוה למדידות של תגובות vasoconstrictor / vasodilator בתנאים יחסית פיסיולוגיים. כאן אנו מתארים את השיטות המשמשות לשני הסוגים של מדידות ולספק כמה דוגמאות כיצד ניתן לשלב עיצוב הניסיון לספק הבנה ברורה יותר של התפקידים של תעלות יונים אלה בויסות טונוס כלי דם.
Protocol
1. כריתה כירורגית של ארקייד כלי הדם קטן מעי mesenteric
- הרדם 300-400 חולדה גרמה ספראג-Dawley עם isoflurane (4%) המנוהלת על ידי שאיפה.
- בצע laparotomy קו אמצע לחשוף לפדר המעי הדק. Exteriorize מעי הדק וגדול דרך החתך בבטן בזהירות רבה כדי להימנע מטראומה למעי ולפדר החשוף. עדינות ללבות לפדר מעל גזת סטרילי.
- ניתוח בלו מעי הדק וחלק מהמעי הגס, כולל המעי האטום (כלי דם לחתוך בזהירות בשולים ובמקורות מהענפים העיקריים של עורק mesenteric / וריד המעולה).
- העברת הרקמות נכרתו למבחנה המכילה תמיסה לנתח קרה כקרח (טבלה 1).
- לאחר הכריתה של המעי, החולדה צריכה להיות מורדמת הומנית תחת הרדמה.
2. נתיחהניקוי ד של עורקים
- להעביר את המעי שנכרת וארקייד mesenteric לחדר ביתור מקורר (4-5 ° C) המכיל פתרון לנתח. התא מורכב מצלחת 100-מ"מ זכוכית פטרי עם בסיס אלסטומר SYLGARD 184 כדי להתאים סיכות מבתרות; צלחת פטרי מונחת בבסיס מקורר שנשמר ב4-5 מעלות צלזיוס באמבט מים במחזור.
- בעזרת מספרי כירורגיות לחתוך כ 10-12 סנטימטר קטע מתוך כל המעי. לחתוך בכל קצה של קטע מעי שמירת vasculature המצורף, ולאחר מכן להסיר את המעי שאינו בשימוש מהתא משאיר קטע אחד עם כלי הדם המחוברים אליו (ארקייד mesenteric) בבידוד.
- להצמיד את הקטע של מעי דק, מתפשט לפדר מעל הצד הקרוב של החדר כזה, שהסניף הראשי של mesenteric המעולה עורק / וריד הוא במרכז ואת הצווים הבאים של להקרין סניפים מהמרכז (איור 1). Pl אס הפינים רק על מגזרי המעיים (לא על כלי הדם).
- להבדיל מעורקי ורידים לפי צבעם הבהיר יחסית האדום, קירות עבים וענפים אופייניים בצורת V, ולא את הענפים בצורת האות ראו בורידים.
- הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מואר, נקה את רקמת השומן ורקמת חיבור המקיפה את 2 nd זהירות - 4 עורקי סדר ה קרובה למעי (העיגול מקווקו באיור 1) באמצעות מלקחיים ומספריים מייקרו. מחזיק את הוורידים הסמוכים מאפשר ניקוי רקמת השומן ורקמת חיבור. הימנע ממתיחה מיותרת של העורקים.
- מקטעי עורקי mesenteric נוקו מרקמת חיבור אז יכולים להיות גזורים החוצה ומשמשים לבידוד תא (למחקרים מהדקים תיקון תא בודד, סעיפי 3-4) או cannulated לmyography לחץ (סעיף 5). לחתוך קטעים בין נקודתי הסתעפות, בדרך כלל עד 1 סנטימטר באורך.
- הכן 0.5 ליטר של פתרון בידוד (טבלה 1) ומחלק אותו ל 2 חלקים לפני כוונון pH. המנה הראשונה (בדרך כלל 100 מ"ל) יש לחמם עד 37 מעלות צלזיוס, ורמת החומציות צריכה להיות מותאמת ל 7.2 על 37 מעלות צלזיוס (37 מעלות צלזיוס פתרון בידוד). החלק השני של פתרון הבידוד צריך להיות התקרר עד 4 צריכים להיות מותאם ° C ו-pH ל -7.2 ב 4 ° C (פתרון בידוד קר כקרח). לאחר התאמת ה-pH, אוסמולריות של שני הפתרונים חייבת להיות מותאמת ל298 mOsm ידי הוספת כמות מתאימה של גלוקוז-D או H 2 O.
- להעביר 2 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס פתרון בידוד לבקבוקון זכוכית ולדגור על 37 מעלות צלזיוס לשימוש בשלב 3.4. להוסיף 20 מ"ג של אלבומין בסרום שור (BSA) עד 10 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס פתרון בידוד, להתמוסס, מחדש חם עד 37 מעלות צלזיוס, ולהתקין מחדש את ה-pH ל -7.2. עד 2 מ"ל של פתרון זה להוסיף 4 מ"ג collagenase סוג שמיני (Sigma, לוט 089K8612: 633 units / פעילות collagenase מ"ג, 285 יחידות / פעילות Caseinase מ"ג, 1.6 יחידות / פעילות Clostripain מ"ג), 0.64 מ"ג elastase הסוג IV (Sigma, לוט 110M7025V 5.9 יחידות / מ"ג; להוסיף 40 μl של מניית 16 מ"ג / מ"ל הוכנה בשנת 37 ° פתרון בידוד C) ו 2 μl של 1 ז DL-dithiothreitol (DTT סיגמא); מראש חם פתרון אנזים זה עד 37 מעלות צלזיוס בהכנה לצעד 3.5.
- להעביר 2-3 מקטעים של עורק mesenteric לתוך צלחת תרבית רקמת 35-מ"מ המכיל 2 מ"ל של פתרון קרח קר ובידוד מקום הצלחת על קרח. לחתוך קטעי עורקים mesenteric לחתיכות מ"מ באורך 3-4.
- באמצעות פיפטה פסטרה עם קצה מלוטש אש (כדי למנוע פגיעה של עורקים) להעביר את מקטעי עורקים לתוך בקבוקון זכוכית (15 x 45 מ"מ, ה-DRAM 1) המכיל 2 מ"ל מראש התחמם-37 ° C פתרון בידוד ודגירה במשך 30 דקות בשעת 37 ° C.
- לאחר 30 דקות, לשאוב 37 ° C פתרון הבידוד באמצעות פיפטה פסטר בזהירות, להוסיף פתרון 2 מיליליטר אנזים חם ודגירה במשך 35 דקותב 37 ° C.
- מייד לאחר דגירת 35 דקות בתמיסת האנזים, הנח את הבקבוקון על קרח, לשאוב את פתרון האנזים ולהוסיף 2 מ"ל של פתרון בידוד קר קרח (אספירציה חוזרות ותוספת של פתרון בידוד קר טרי קרח 4 פעמים). ואז, בנפח של 1 מ"ל של פתרון בידוד קרח קר, עדינות triturate מגזרים עורקים עם 10-20 פעמי פיפטה פסטר המלוטשות לשחרר תאים בודדים mesenteric עורק שריר חלק (MASMCs).
- מעת לעת לוודא הופעת myocytes ידי הצבת ירידה של השעית התא על צלחת 35-מ"מ וצפייה מתחת למיקרוסקופ. MASMCs הבריא צריכה להיות מראה מוארך חלק. לא כל התאים בדופן העורק ישוחרר. השעית התא יש לשמור על קרח.
- מדד שימושי נוסף של בריאות MASMC הוא הסובלנות שלהם פיסיולוגיים Ca 2 + ריכוזים. מלא תא הקלטה (כלי Bioscience, # CSC-25L) עם האמבטיה שלolution המכיל 2 מ"מ CaCl 2 (pH 7.3 בטמפרטורת חדר (RT), להרכב ראה טבלה 1) וגשר אגר עמדה (זכוכית נטויה נימים מלאות אגר 2% ב 2 M KCl, מוכנס לתוך אלקטרודה ההשוואתית (וורנר כלי, REF -3L)) בתוך החדר. באמצעות פיפטה פסטר המלוטשת, להעביר כ 100-200 השעית תא μl לחדר הקלטה ולאפשר לתאים לדבוק במשך 15 דקות. תאים שלא נפגעו לא צריכים להתכווץ באופן משמעותי בפתרון 2 המ"מ CaCl 2-המכיל (תאים צריכים להיראות מוארך או בצורת מוט, ולא מעוגלים כלפי מעלה לכדורים).
- לאחר הוספת aliquot הראשון של השעית התא לתא ההקלטה, 0.25 מ"ל של תמיסה המכיל אמבטיה 2 מ"מ CaCl 2 יש להוסיף נפח הנותר של השעית תא. השעית תא שנותר זה יכולה להישמר בפתרון זה על קרח ומשמשת להקלטת מהדק תיקון לתקופה של עד 6 שעות.
4.שימוש בקלאמפ תיקון התא השלם למדוד Kv7 זרמים או מתח ממברנה אשלגן
- לאחר myocytes לדבוק בבסיס הזכוכית של חדר ההקלטה (עגול תלוש 25-מ"מ מס '1 כיסוי, וורנר מכשירים), ליזום זלוף המתמשך של פתרון האמבטיה (טבלה 1). להקלטה של Kv7 זרמים בבידוד מזרמי אשלגן rectifier מתעכבים של Kv1 וKv2 משפחות, פתרון האמבטיה יש להשלים עם 100 מיקרומטר 3 GdCl.
- לפברק פיפטה תיקון מורוסיליקט זכוכית (Kimax-51, קימבל צ'ייס) באמצעות פיפטה חולץ וmicroforge; ההתנגדות שלה צריכה להיות 4-5 MΩ כאשר התמלא פתרון פנימי (טבלה 1). מעייל נמוך 1/3 מפיפטה (~ 1-2 מ"מ מעל הקצה) עם SYLGARD 184.
- להקלטה של Kv7 זרמים בMASMCs, הטכניקה המחוררת תיקון כל תא מתח המהדק אמורה לשמש. שימוש בתצורת תיקון מחוררת מסייע במניעת depletion של הקרום phosphatidylinositol-bisphosphate 4,5 (PIP 2) ולאחר מכן במהירות (תוך 5 דקות) סקירה מהירה של Kv7 זרמים, אשר נצפו בדרך כלל תוך שימוש בתצורת תיקון הקרע הקונבנציונלית. תוספת הפתרון הפנימי (טבלה 1) עם 120 מיקרוגרם / המ"ל Amphotericin B: להוסיף 3 μl של מניית 2 מ"ג / מ"ל של Amphotericin B (שהוכן בDMSO ושמר קפואים בaliquots הקטן ומוגן מפני אור) ל 0.5 מ"ל של הפתרון הפנימי. מלא את קצה פיפטה התיקון עם הפתרון הפנימי ב 'ללא Amphotericin על ידי טבילת קצה פיפטה בפתרון הפנימי ב' ללא Amphotericin ולאחר מכן החלת יניקה בצד השני באמצעות מזרק 10 מ"ל מצורף באמצעות חתיכת הצינור (-R Tygon 3603). הוסף פתרון פיפטה B המכיל Amphotericin מלמעלה בעזרת טיפ פיפטה Microloader אפנדורף עד פיפטה היא כ מלאה למחצה בפתרון. הסר את כל בועות אוויר על ידי קשה על פיפטה בעדינות. השתמש פיפטה באופן מיידי.
- הכנס בפיפטהלמחזיק האלקטרודה ולהשתמש micromanipulator להנמיך את הפיפטה אל פני השטח של myocyte מוארך (קרוב ל, אך לא על גבי הגרעין, האיור 2). כאשר ההתנגדות בפיפטה עולה ל 6-10 MΩ, תחול יניקה להשיג גיגה חותם (> 10 GΩ).
- הגדר מחזיק מתח עד 0 mV בזמן המתנה לניקוב קרום. החל 100 צעדי ms מתח 10 mV ואז ל-10 mV, ולהשתמש במגבר כדי לפצות ארעי קיבול פיפטה מהירה. במקביל להופעה של הארעיים תא שלמים קיבול, זרמים חיוביים מתמשכים קטנים (בדרך כלל 2-10 הרשות פלסטינית) יהיה להעיד על הנוכחות של Kv7 ערוצים פונקציונליים.
- ניקוב מוצלח עם Amphotericin B יפחית התנגדות גישה ל 35 MΩ או פחות. הקלטה נוכחית ואז יכולה להיות יזם באמצעות פרוטוקול צעד מתח שניות 5 ממתח החזקת mV -4. אנו משתמשים במתח מחזיק mV -4 כדי להשיג קרבת האיון מקסימאלי של סוגים אחרים של rec מתעכבזרמי tifier האשלגן (מתווך בעיקר על ידי Kv1 וKv2 ערוצים), שאחרת היה לזהם את ההקלטה של Kv7 הזרמים הקטנים יחסית שאינם inactivating-. (5 שניות) פרוטוקול צעד המתח הרב הוא הכרחי כדי להשיג הפעלה יציבה של Kv7 ערוצים, אשר מפגינים הפעלת מתח תלוי איטית ושחרור משרות. את Kv7 הזרמים לא להשבית במהלך שלבי המתח המתמשכים.
- כדי להקליט Kv7 היחסים נוכחי המתח (IV), תחול 5 שלבי מתח שניות למתחים הנעים בין -84 mV, שבהסתברות הפתוחה של Kv7 ערוצים היא מזערית, ל16 mV שבהסתברות הפתוחה של Kv7 ערוצים מגיעה רמה; לאחר 5 שניות בכל מתח בדיקה, חזר למתח מחזיק (mV -4) למשך 10 שניות. זה ייקח כ 3.5 דקות לסדרה המלאה של פולסים בדיקה (איור 3 א). בצע 2-3 קלטות בקרת IV על מנת להבטיח שהזרמים שנרשמו הם יציבים לאורך זמן. עלילה ממוצעת סוף דופק זרמים (ממוצעזרמים שנרשמו ל1 השניות אחרונות) לעומת מתח כדי ליצור עקומת IV (האיור 3D). עקומות בקרת IV צריכות להיות על גבי כ אם הזרמים הם יציבים.
- לפני החלת סוכנים תרופתיים ליזום פרוטוקול כמובן זמן נועד ברציפות להקליט הנוכחי ב -20 mV. ודא הקלטה יציבה הנוכחי לפחות 5 דקות לפני יישום התרופה. החל את הסוכנים התרופתיים ל5-15 דקות או עד למצב יציב-מושג (האיור 3C), ולאחר מכן לסיים את הפרוטוקול ולהקליט שתי עקומות IV באמצעות פרוטוקול מתח הצעד כמובן הזמן. סחף הסמים ולהקליט כמובן זמן שטיפת סמים, ואחרי ההקלטה של שתי עקומות IV נוספות.
- בסוף הניסוי יחול linopirdine מיקרומטר 10 או 10 מיקרומטר XE991, מעכבים בלתי הפיכים של Kv7 ערוצים; תרופות אלה צריכות לעכב באופן מלא את הזרמים שנרשמו במתח שלילי ל-20 mV (האיור 3D).
5. שימוש בעורק מגזרים שלמים לMyography לחץ
- מערכת myograph לחץ נרכשה ממיו טכנולוגיה דנית (DMT / S, דנמרק, דגם 110P) משמשת לניסוי myography לחץ. הר קטע העורק בתא הנירוסטה על ידי החדרת צינורית הזכוכית השמאלית הקבועה אופקי לתוך קצה אחד וצינורית זכוכית זכות מטלטלין לקצה השני. שני מתמרי לחץ (P1 על ימין ועל P2 בצד השמאל) בנויים בניטור הלחץ בתוך החלל העורק. נוזל מצינורית זכוכית הזכות ישמש כדי להתאים את הלחץ בתוך העורקים לרמה הפיזיולוגית המשוערת שלו. כדי להתחיל, מילוי מראש של מזרק 10 מ"ל פתוח (המשמש כעמודת לחץ הזנת כוח משיכה), עם פתרון לומן (טבלה 1). הרם את המזרק כדי לדחוף solution דרך צינורות פוליאתילן לתוך צינורית הזכוכית הנכונה, טיפול כדי למנוע בועות אוויר בצינורות או קנולה. הצינורית השמאלית צריכה להיות מראש מלאה פתרון לום באמצעות מזרק 1 מ"ל. למלא את תא לחץ myograph עם 10 מ"ל של פתרון אמבטית הכלי (טבלה 1). רופף להשעות 2 תפרי ניילון עדינים מראש שנעשה בכל צד סמוך לcannulae הזכוכית.
- בזהירות להעביר את קטע עורק mesenteric הגזור (קטע 3 באו 4 בצו, בדרך כלל סביב 200 - 350 מיקרומטר בקוטר; מצעד 2.6) מהתא לתא לנתח myograph לחץ, נאחז בקצה אחד של המגזר באמצעות מייקרו מלקחיים.
- הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מואר, החזק קצה אחד של קטע העורק והחלק בעדינות אותו מעל צינורית הזכוכית השמאלית ולהבטיח את סוף השימוש בתפרי הניילון. לשטוף בעדינות את נוזל הלום באמצעות כלי רכוב להסיר דם ופסולת בתוך הכלי.השסתום למזרק שמאלה ואז צריך להיות סגור, כך שהצד הזה מציג עמודה סטטית של נוזל נגד שהלחץ מותאם מהצד הימני.
- שימוש micromanipulator, עמדת זכוכית צינורית זכות מטלטלין קרובים יותר למגזר העורק ומושך את הקצה הימני של הקטע על זה, סוף הסוף לקבע אותו בעזרת תפרי הניילון. קליפ מחוטי התפרים העודפים.
- הר יחידת myograph לחץ על הבמה מעל מיקרוסקופ myograph לחץ. הנח את הכיסוי על תא myograph לחץ. הכיסוי לתא מכיל את מפרצון superfusion וצינור היניקה המצורפת אליו. חבר את כניסת superfusion לסעפת לאפשר superfusion של פתרון KCl mM 60 לתוך תא myograph לחץ על ידי כוח הכביד אמבטית טמפרטורת חדר או. חומרי בדיקה, כגון תרופות או הורמונים שנמצאו במדידות המהדקות לתיקון להשפיע על תפקוד הערוץ Kv7, מיושמים בדרך כלל ישירות לפתרון האמבטיה, לא דרך אמבטית superfusion או בפתרון הלום. Superfusion של פתרון אמבטיה ישמש כדי לשטוף את פתרון KCl. צרף צינור היניקה למערכת ואקום כדי להסיר superfusate העודף. הכנס את חיישן הטמפרטורה לפתרון האמבטיה דרך הפתח האמור בכיסוי תא myograph.
- חבר את יחידת לחץ myograph למערכת מיו הממשק, החומרה המאפשרת תקשורת של יחידת myograph לתוכנת myoview (DMT).
- פתח את תוכנת myoview במחשב. בחלון הפרמטר, לקבוע את טמפרטורת היעד כמו 35 מעלות צלזיוס בטמפרטורה של סובלנות 1 ° C, לחץ זרימת היעד כמו 80 מ"מ כספי ולחץ יצוא היעד כמו 80 מ"מ כספי. טען את קובץ הכיול ולכייל את הקוטר החיצוני הכלי כך שהשינויים בקוטר עורק נרשמים במדויק במיקרון. כוון את הניגודיות כנדרשת כדי לאפשר תצפית טובה על הקטע רכוב על הרקע. תיאור מפורט לאופן שימוש בתוכנהמסופק במדריך למשתמש מDMT.
- בהדרגה להעלות את מזרק 10 מ"ל (המשמש כעמודת לחץ הזנה הכבידה) על פני תקופה של 15 דקות עד למתמר לחץ P1 קורא 80 מ"מ כספי. תוך העלאת עמודת לחץ, לבדוק את כל הדלפות בכלי השיט. אם יש הדלפות כלשהן, השלך את הקטע ולעלות קטע עורק אחר (חזור על שלבים מ5.2). התאם את המרחק בין cannulae בעת צורך. המרחק צריך להיות מותאם באופן כזה שקטע עורק הלחץ הוא כ ישר (אבל לא מתוח) ויוצר כתף כמו בדפוס שבו הקשרים מורכבים (איור 4 א).
- הפעל את החימום של חדר myograph לחץ באמצעות הפקדים במערכת מיו הממשק. אפשר פתרון האמבטיה כדי לחמם בהדרגה עד שהוא מגיע 36-37 מעלות צלזיוס
- השתמש בהתאמות XYZ של אובייקטיבי במיקרוסקופ DMT בעת צורך כדי לשמור על הכלי בפוקוס ולהקל על מעקב מדויק של הפרקAnges בקוטר כלי חיצוני.
- בדוק את הכדאיות של הכלי רכוב על ידי superfusion החולף (~ 30 שניות) עם KCl 60 מ"מ. כלי קיימא מכווץ מהירות בתוספת של KCl ומרחיב מייד עם סחף של 60 המ"מ KCl (superfuse כ 60 מ"ל של פתרון אמבטיה לשטוף את KCl). לאחר בדיקה זו, להתאים מחדש את עוצמת הקול של הפתרון לאמבטיה בדיוק 10 מ"ל. הטמפרטורה של האמבטיה מצטמצמת במהלך הבדיקה ושטיפת KCl כי פתרונות אלה הם בטמפרטורת חדר, אבל הדוד הקאמרי יחזיר את הטמפרטורה ל 36-37 מעלות תוך מספר דקות.
- אפשר העורק כדי לאזן לפחות 30 דקות (הקוטר צריך להיות יציב במשך לפחות 10 הדקות האחרונות של תקופה זו). הוסף חומר הבדיקה המרוכז לפתרון האמבטיה ישירות ופיפטה קדימה ואחורה בעדינות ליד הקצוות של החדר לערבב את חומר הבדיקה בפתרון האמבטיה, מניב הריכוז הסופי המתאים בנפח 10 המ"ל הקאמרי. צ'אןGES בתוספת הבאה קוטר הכלי של בדיקת חומר (הים) יכול להיות במעקב בתמונת הווידאו החייה וגם מופה בחלון ניתוח התמונה בזמן הניסוי הוא בביצוע.
- לאחר השלים הניסוי, נתונים המאוחסן קובץ (*. מיו) ניתן לפתוח כקובץ גיליון אלקטרוני לניתוח נוסף.
6. נציג תוצאות
התוצאות מוצגות באיור 3 ממחישות הקלטות טיפוסיות של Kv7 זרמים מmyocytes העורקים mesenteric באמצעות פרוטוקול צעד מתח לפני (איור 3 א, עקבות B השחורים) ותקופת הטיפול בKv7 ערוץ activator Zn pyrithione (ZnPyr, 100 ננומטר; 3A איור, B עקבות אדומות). נתוני צעד דומה ממתח 3 תאים היו ממוצעים להכין את החלקות נוכחי המתח (IV) המוצגות באיור 3D. כמובן נציג זמן של שיפור של משרעת הנוכחית (שנמדד על ידי מהדק מתח מתמשך ב -20 mV) דוריןהטיפול גרם עם nM Zn pyrithione 100 מוצג באיור 3C האיור 4B ממחיש כמובן הזמן של השפעת ZnPyr בקוטר חיצוני עורק mesenteric נמדד באמצעות myography לחץ;. הספינה הייתה מראש מוגבלת עם 100 PM ארגינין וזופרסין (AVP) לפני תוספת של ZnPyr nM 100. נתוני מנת תגובת ממוצע להתרחבות העורק mesenteric ZnPyr מושרה מוצגים באיור 4C.
איור 1. תמונה של ארקייד mesenteric בחדר הניתוח של גוויות.
איור 2. תמונה של myocyte עם פיפטה תיקון על פני השטח שלו.
איור 3. עקבות מקוריות של Kv7 זרמים, קורס זמן של תרופות יישום, עקומות IV. משפחת א 'של עקבות נוכחיות עוקבות (פנל תחתון) שנרשמו בתגובה לצעדי מתח (פנל עליון) לפני הטיפול (שליטה, שחור) והייצוב הבא בנוכחות של 100 ננומטר ZnPyr (אדום) בMASMC אחת. עקבות נוכחיות נציג B. מ( כפי שמצוין על ידי ראשי חץ) לבקרה (שחור) ועבור 100 ננומטר ZnPyr (אדום). פסים אפורים מצביעים על מרווח זמן שבו אמפליטודות נוכחית ממוצע נמדדה לחלקות נוכחיות מתח (IV). מתחי צעד מצוינים בצד ימין על ידי ראשי חץ. כמובן זמן ג השיפור הנוכחי Kv7 ידי ZnPyr nM 100 נמדדו עם מהדק מתח מתמשך ב -20 mV (בר). ד הממוצעים העקומות הרביעיות (n = 3) נגזרות מKv7 צפיפות נוכחית נרשמו לפני (שליטה, עיגולים מלאים), במהלך טיפול עם nM ZnPyr 100 (עיגולים פתוחים), ובמהלך הטיפול עם 10 מיקרומטר XE991 (משולשים מלאים). זרמי דליפה לא ספציפיים נגרעו כפי שתואר על ידי פסמור et al. 1.
איור 4. הרפית ZnPyr המושרית של עורק מראש מכווץ-100 עם AVP PM mesenteric. תמונת א 'של עורק mesenteric רכובה בmyograph לחץ הגדרה. כמובן ב 'זמן של שינויים בקוטר חיצוני של כלי השיט בתגובה לבקשה של 100 PM AVP (בר פתוח) ואחרי היישום של 100 ננומטר ZnPyr (בר מלא). גרף בר ג סיכום תוצאות vasodilaion 100 ננומטר ZnPyr המושרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטות והגישות ניסיוניות שתוארו כאן הן די חזקות ויכולות להניב תוצאות ברורות ולשעתק כאשר מיושמות עם תשומת לב קפדנית לכל פרט. הקלטות אלקטרו טובות והצרה / רחבה של מגזרים עורקים תלויות בבריאותם של התאים ומגזרים עורקים, בהתאמה. הכנות סלולריות יכולות להשתנות מיום ליום, גם באמצעות אותו הפרוטוקול. פתרוני בידוד ניתן להשתמש עד 2 שבועות, אבל אם האיכות של הכנת התא היא נמוכה בימים נובעים מכך פתרוני בידוד חדשים צריכים להיות מוכנים. אנחנו גילינו שפעילות אנזים משתנית מקבוצה לתנאי בידוד יצווה (ולכן זמנים של דגירה וריכוזים של אנזימים) דורשת אופטימיזציה עם כל קבוצה חדשה של אנזימים. יש לנו גם מצאו כי פרוטוקול בידוד התא שתואר כאן לעורק mesenteric עכברוש אינו אופטימלי עבור מיטות אחרות בכלי דם או מינים אחרים, אשר עשויים להיות תמהיל או מאורות שוניםity של רכיבים תאיים מטריקס. כל הכנת כלי דם דורשת אופטימיזציה שלו כדי לזהות את התנאים שמייצרים את התאים הבריאים. הקריטריונים שאנו מוצאים מועילים ביותר בזיהוי תאים בריאים הם: 1) מורפולוגיה תא: חלקה, מוארכת, אבל מעט מכווצת הופעה לאחר triturating מגזרי MA בפתרון הבידוד המכיל 50 מיקרומטר Ca 2 +, ושמירה על אותה ההופעה, כאשר הועבר ל2 mM Ca 2 + פתרון המכיל חיצוני. לא כל התאים יישמרו על צורתו המוארכת כמעט הרגועה לחלוטין שלהם, אבל רק כמעט myocytes רגוע לחלוטין צריך לשמש עבור הקלטת אלקטרו, 2) תאים צריכים להיות אופטי צפופים, המצביע על קרום ניזוק ללא פגע; 3) מתח קרום מנוחה של myocytes הבריא נהג זרמי אשלגן להקליט או להקלטות של מהדק הנוכחי של מתח קרום צריכים להיות שליליים יותר מאשר mV -40 (בדרך כלל בטווח של -45 mV לmV -56 תחת התנאים היוניים described בפרוטוקול שלנו כאן).
כדי להבטיח את הקלטות מוצלחות אלקטרו, פתרון האמבטיה ופתרון פיפטה (להרכב ראה טבלת 1) צריך להיות מוכן ביום של הניסוי. זה חיוני כדי להתאים osmolality מהפתרונים הפנימיים ואמבטיה כך שיהיה זהה (298-299 mOsM).
מדידות תפקוד עורקת Isobaric נעשו בעורקים קטנים (<500 מיקרומטר) באמצעות myography לחץ יותר קרוב בתנאים פיסיולוגיים, מאשר מדידת כוח איזומטרי נעשו באמצעות myograph תיל. הכולים בmyograph לחץ הם בדרך כלל רגישים יותר לאגוניסטים vasoconstrictor 2-4, דומים באופן הדוק יותר את הרגישויות נמדדות בvivo 5, 6. הרגישות המוגברת לריכוזים נמוכים של אגוניסטים אפשרה זיהוי של מנגנוני העברת אותות הנגרם על ידי ריכוזי picomolar פיסיולוגי רלוונטיים של AVP7, 8.
myography לחץ משמר את הגיאומטריה של כלי הדם ושומר על שלמות האנדותל. ניתן להבחין בין השפעות האנדותל בתיווך של תרופות מהשפעות השריר חלק בתיווך על ידי ביצוע מדידות מקבילות בכולים שלמים והאנדותל נכרתים-9. השיבוש המכוון של האנדותל יכול להתבצע על ידי פגיעת האנדותל (למשל על ידי העברת שיער אדם הלוך ושוב בלומן) פיזי או על ידי מרוסס אוויר דרך החלל של העורק. אובדן התפקוד האנדותל (אבל תפקוד שריר חלק של כלי דם לא) חייב להיות מאושר על ידי מדידת תגובת vasodilator האנדותל בתיווך מופחתת לאצטילכולין בכולים מראש מכווצים-עם אגוניסט 9.
מדידות מקבילות של זרמים יוניים / מתח קרום בmyocytes העורקים mesenteric באמצעות טכניקות מהדקות תיקון והצרת עורקים / התרחבות של arteri mesenterices באמצעות myography לחץ יכול לאפשר הבהרת התפקידים של תעלות יונים מסוימות בשני מפלי העברת אותות פיסיולוגיים ובפעולות של סוכנים טיפוליים. טיפולי מיקוד מחלקות ספציפיות של תעלות יונים או ביניים העברת אותות ספציפיים יכולים להיות מיושמים additively או ברצף כדי לספק מידע מכניסטית על התפקידים של ערוצים אלה ברגולציה של תפקוד myocyte ברמה התאית ובהתכווצות / התרחבות של עורקים ללא פגע. תוצאות מתכנסות של טיפולים המשפרים או לעכב סוגים מסוימים של זרמים יוניים עם תופעות מקבילות בקוטר עורק לספק פרשנות אמינה יותר מאשר ניתן להשיג בשתי שיטות על ידי עצמו. באופן אידיאלי, ריכוז התלות של הסוכנים תחת מחקר צריכה להיקבע בשתי המערכות. על מנת להעריך את הרלוונטיות פיסיולוגיות או טיפוליות, שנבדקו הריכוזים צריכים להיות קשורים לריכוזים שנמדדו בסביבת o הפיזיולוגיתr הושג בטיפולים קליניים. דוגמאות לסוגים אלה של גישות ניסיוניות ניתן למצוא ב8-10 הפרסומים הקודמים שלנו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענק מהלאומי ללב, ריאות ודם מכון (NIH R01-HL089564) לKLB ומלגות קדם דוקטורט מאיגוד הלב האמריקאי (09PRE2260209) וארתור השמיט הקרן לBKM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | Dissecting Solution: 145 Bath solution for Electrophysiology*: 140 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 140 Bath solution for pressure myography: 145 Lumen solution for pressure myography: 145 |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | Dissecting Solution: 4.7 Bath solution for Electrophysiology*: 5.36 Internal solution for electrophysiology: 135 Isolation solution for myocytes*: 5.36 Bath solution for pressure myography: 4.7 Lumen solution for pressure myography: 4.7 |
| Potassium EGTA | Sigma | E4378 | Internal solution for electrophysiology: 0.05 |
| HEPES | Sigma | H9136 | Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 10 |
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma | S5136 | Isolation solution for myocytes*: 0.34 |
| Potassium hydrogen phosphate | Sigma | P5655 | Isolation solution for myocytes*: 0.44 |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2393 | Bath solution for Electrophysiology*: 1.2 Internal solution for electrophysiology: 1 Isolation solution for myocytes*: 1.2 |
| Calcium Chloride | Sigma | C7902 | Bath solution for Electrophysiology*: 2 Isolation solution for myocytes*: 0.05 |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | BP331-1 | Dissecting Solution: 1.2 Bath solution for pressure myography: 1.2 Lumen solution for pressure myography: 1.2 |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | Dissecting Solution: 1.17 Bath solution for pressure myography: 1.17 Lumen solution for pressure myography: 1.17 |
| MOPS | Fisher Scientific | BP308 | Dissecting Solution: 3 Bath solution for pressure myography: 3 Lumen solution for pressure myography: 3 |
| Pyruvic acid | Sigma | P4562 | Dissecting Solution: 2 Bath solution for pressure myography: 2 Lumen solution for pressure myography: 2 |
| EDTA dihydrate | Research Organics | 9572E | Dissecting Solution: 0.02 Bath solution for pressure myography: 0.02 Lumen solution for pressure myography: 0.02 |
| D-Glucose | Sigma | G7021 | Dissecting Solution: 5 Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 20 Isolation solution for myocytes*: 10 Bath solution for pressure myography: 5 Lumen solution for pressure myography: 5 |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3912 | Dissecting Solution: 1% Lumen solution for pressure myography: 1% |
| pH | Dissecting Solution: 7.4 Bath solution for Electrophysiology*: 7.3 Internal solution for electrophysiology: 7.2 Isolation solution for myocytes*: 7.2 Bath solution for pressure myography: 7.4 Lumen solution for pressure myography: 7.4 |
||
| Osmolarity | Dissecting Solution: 300 Bath solution for Electrophysiology*: 298 Internal solution for electrophysiology: 298 Isolation solution for myocytes*: 298 Bath solution for pressure myography: 300 Lumen solution for pressure myography: 300 |
||
*11 |
|||
Table 1. Components of solutions used in the experiment. |
|||
References
- Passmore, G. M. KCNQ/M Currents in Sensory Neurons: Significance for Pain Therapy. J. Neurosci. 23, 7227-7236 (2003).
- Falloon, B. J. Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 268, H670-H678 (1995).
- Dunn, W. R. Enhanced resistance artery sensitivity to agonists under isobaric compared with isometric conditions. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 266, H147-H155 (1994).
- Buus, N. H. Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations. Br. J. Pharmacol. 112, 579-587 (1994).
- Abdelhalim, M. A. Effects of big endothelin-1 in comparison with endothelin-1 on the microvascular blood flow velocity and diameter of rat mesentery in vivo. Microvasc. Res. 72, 108-112 (2006).
- Altura, B. M. Dose-response relationships for arginine vasopressin and synthetic analogs on three types of rat blood vessels: possible evidence for regional differences in vasopressin receptor sites within a mammal. J. Pharmacol. Exp. Ther. 193, 413-423 (1975).
- Henderson, K. K. Vasopressin-induced vasoconstriction: two concentration-dependent signaling pathways. J. Appl. Physiol. 102, 1402-1409 (2007).
- Mackie, A. R. Vascular KCNQ potassium channels as novel targets for the control of mesenteric artery constriction by vasopressin, based on studies in single cells, pressurized arteries, and in vivo measurements of mesenteric vascular resistance. J. Pharmacol. Exp. Ther. 325, 475-483 (2008).
- Brueggemann, L. I. Differential effects of selective cyclooxygenase-2 inhibitors on vascular smooth muscle ion channels may account for differences in cardiovascular risk profiles. Mol. Pharmacol. 76, 1053-1061 (2009).
- Patch Clamp Technique. Kaneez, F. S. , Intech. (2012).
- Berra-Romani, R. TTX-sensitive voltage-gated Na+ channels are expressed in mesenteric artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, H137-H145 (2005).
