Explorando Arterial Músculo Liso KV7 função dos canais de potássio utilizando electrofisiologia patch clamp e Miografia Pressão

Summary

Medidas do KV7 atividade do canal (KCNQ) de potássio em miócitos isolados arteriais (usando patch braçadeira técnicas eletrofisiológicas) em paralelo com medidas de constritores / dilatador respostas (usando Miografia pressão) pode revelar informações importantes sobre os papéis do KV7 canais em fisiologia do músculo liso vascular e farmacologia.

Abstract

Contracção ou relaxamento das células do músculo liso nas paredes das artérias de resistência determina o diâmetro da artéria e, assim, controla o fluxo de sangue através do vaso e contribui para a pressão arterial sistémica. O processo de contracção é regulado principalmente pela concentração de cálcio citosólico ([Ca ^{2 +]} _cit), que por sua vez é controlada por uma variedade de transportadores de iões e de canais. Canais iônicos são intermediários comuns em vias de transdução de sinal ativadas por hormônios vasoativas para efetuar vasoconstrição ou vasodilatação. E canais de iões são frequentemente alvo de agentes terapêuticos, quer intencionalmente (por exemplo, bloqueadores de canal de cálcio utilizado para induzir a vasodilatação e baixa pressão arterial) ou não intencionalmente (por exemplo, para induzir a indesejados efeitos secundários cardiovasculares).

KV7 (KCNQ) dos canais de potássio activados têm sido recentemente implicada como targ fisiológico e terapêutico importanteets para a regulação da contração do músculo liso. Para elucidar as funções específicas de canais em ambos KV7 transdução de sinal fisiológico e na acção dos agentes terapêuticos, é necessário estudar o modo como a sua actividade é modulada a nível celular, bem como de avaliar a sua contribuição no contexto da artéria intacta.

As artérias mesentéricas de rato proporcionar um sistema modelo útil. As artérias podem ser facilmente dissecados, limpos de tecido conjuntivo, e usada para preparar isolados miócitos arteriais em patch clamp electrofisiologia, ou canulada e pressurizado para medições de vasoconstritor / vasodilatador respostas sob condições relativamente fisiológicas. Aqui descrevemos os métodos utilizados para ambos os tipos de medições e fornecer alguns exemplos de como o projeto experimental pode ser integrado para fornecer uma compreensão mais clara dos papéis desses canais iônicos na regulação do tônus ​​vascular.

Protocol

1. Excisão cirúrgica da arcada vascular intestinal mesentérica Pequeno

1. Anestesiar um 300-400 g de rato Sprague-Dawley, com isoflurano (4%), administrada por inalação.
2. Executar uma laparotomia mediana para expor o mesentério do intestino delgado. Exteriorizar o intestino delgado e grosso através da incisão abdominal com grande cuidado, para evitar o trauma para o intestino expostos e mesentério. Gentilmente ventile o mesentério ao longo de gaze estéril.
3. Cirurgicamente excisar o intestino delgado e uma porção do intestino grosso, incluindo o ceco (vasos sanguíneos cuidadosamente cortados ao longo das margens e das origens dos ramos principais da artéria mesentérica superior / veia).
4. Transferir o tecido excisado para um copo contendo uma solução arrefecida em gelo de dissecação (Tabela 1).
5. Após excisão do intestino, o rato deve ser humanamente sacrificados sob anestesia.

2. Dissecção umd Lavagem de Artérias

1. Transferir o intestino excisados ​​e arcada mesentérica para uma câmara de refrigeração de dissecação (4-5 ° C) contendo solução de dissecação. A câmara é constituída por um prato de 100 mm de Petri de vidro, com uma base de elastómero de SYLGARD 184 para acomodar pinos de dissecação, a placa de Petri é colocada numa base de refrigeração que é mantida a 4-5 ° C por um banho de água circulante.
2. Usando uma tesoura cirúrgica cortar um segmento de aproximadamente 10-12 centímetros de todo o intestino. Cortado em cada extremidade do segmento intestinal mantendo a sua vasculatura ligado, e depois remover o intestino não utilizado a partir da câmara de saída a um segmento com a sua vasculatura anexo (arcada mesentérica) isoladamente.
3. Fechar o segmento de intestino delgado, o mesentério espalhando sobre o lado mais próximo da câmara de tal modo que o ramo principal da artéria mesentérica superior / veia está no centro e os pedidos subsequentes de irradiar ramos a partir do centro (Figura 1). Pl ace os pinos apenas nos segmentos intestinais (não sobre os vasos sanguíneos).
4. Distinguir artérias de veias pela sua cor relativamente vermelho brilhante, paredes espessas e característicos ramos em forma de V, em vez dos ramos em forma de U visto em veias.
5. Visualização através de um microscópio iluminado de dissecação, cuidadosamente limpar o tecido adiposo e do tecido conjuntivo que envolve o ^nd 2-4 artérias ^ª ordem próximos ao intestino (círculo tracejado na Figura 1) usando uma pinça micro e tesouras. Prendendo as veias adjacentes facilita a limpeza do tecido adiposo e tecido conjuntivo. Evitar desnecessária alongamento das artérias.
6. Segmentos de artérias mesentéricas desmatadas do tecido conjuntivo podem ser dissecados e utilizado para o isolamento de células (por uma única célula estudos patch clamp, Secções 3-4) ou canulada para Miografia pressão (Seção 5). Cortar os segmentos entre os pontos de ramificação, geralmente de até 1 cm de comprimento.

jove_title "Isolamento> 3. Célula de Estudos patch clamp

1. Preparar 0,5 L de solução de isolamento (Tabela 1) e dividi-lo em porções de 2 antes de ajustar o pH. A primeira porção (geralmente 100 ml), deve ser aquecida até 37 ° C e o pH deve ser ajustado para 7,2, a 37 ° C (37 ° C solução de isolamento). A segunda porção da solução de isolamento deve ser arrefecido para 4 ° C e o pH deve ser ajustado para 7,2 a 4 ° C (solução de isolamento de frio de gelo). Após ajustamento do pH, da osmolaridade das duas soluções deve ser ajustado para 298 mOsm por adição de uma quantidade apropriada de D-glucose ou ₂ H O.
2. Transferir 2 ml de 37 ° C, solução de isolamento para um frasco de vidro e incubado a 37 ° C para utilização no passo 3.4. Adicionar 20 mg de albumina de soro bovino (BSA) a 10 ml de solução de 37 ° C Isolamento, dissolver-se, re-aquecido a 37 ° C e reajustar o pH a 7,2. A 2 ml desta solução adicionar 4 mg de colagenase tipo VIII (Sigma, Lote 089K8612: 633 units / mg de actividade de colagenase, 285 unidades / mg de actividade caseinase, 1,6 unidades / mg de actividade clostripaína), 0,64 mg de elastase tipo IV (Sigma, Lote 110M7025V 5,9 unidades / mg; adicionar 40 ul de estoque de 16 mg / ml preparada em 37 ° Solução C Isolamento) e 2 ul de 1 M de DL-ditiotreitol (DTT Sigma); pré-aquecido Solution esta enzima a 37 ° C em preparação para o passo 3.5.
3. Transferir 2-3 segmentos da artéria mesentérica em uma placa de cultura de tecidos de 35 mm contendo 2 ml de solução de isolamento de gelo frio e colocar o prato no gelo. Corte segmentos de artérias mesentéricas em 3-4 mm de comprimento peças.
4. Utilizando uma pipeta de Pasteur polida a fogo ponta (para evitar danos nas artérias) transferir os segmentos arteriais para um frasco de vidro (15 x 45 mm, 1 dram) contendo 2 ml pré-aquecido a 37 ° C solução de isolamento e incubar durante 30 min a 37 ° C.
5. Após 30 minutos, aspirar cuidadosamente a 37 ° C de Soluções Isolamento utilizando uma pipeta Pasteur, adicionar 2 ml Solução de Enzima quente e incubar durante 35 mina 37 ° C.
6. Imediatamente após a incubação de 35 min em solução de enzima, coloque o frasco em gelo, aspirar a solução de enzima e juntar 2 ml de solução de isolamento de gelo frio (aspiração repetida e a adição de solução fresca de isolamento Gelo 4 vezes). Em seguida, em um volume de 1 ml de solução de isolamento de frio de gelo, cuidadosamente triturar os segmentos arteriais com pipetas de Pasteur polidas 10-20 vezes para libertar individuais da artéria mesentérica de células musculares lisas (MASMCs).
7. Verificar periodicamente aparência miócitos, colocando uma gota de suspensão de células em um prato de 35 mm e visualização sob um microscópio. MASMCs saudáveis ​​deve ter uma aparência lisa alongada. Nem todas as células da parede arterial será libertada. A suspensão de células deve ser mantido em gelo.
8. Outro indicador útil da saúde MASMC é a sua tolerância fisiológica de concentrações de Ca ^{2 +.} Preencha câmara de gravação (Ferramentas de Biociência, # CSC-25L) com banheira slução contendo CaCl2 ₂ mM (pH 7,3 à temperatura ambiente (RT), para a composição ver Tabela 1) e a posição da ponte de agar (vidro dobrado capilar cheio de agar a 2% em 2 M de KCl, inserido no eléctrodo de referência (Warner Instrument, REF -3L)) no interior da câmara. Utilizando a pipeta de Pasteur polida, transferir aproximadamente 100-200 ul de suspensão de células para uma câmara de registo e permitir que as células a aderir durante 15 min. Células não danificados não devem contrair significativamente no 2 mM CaCl solução contendo ₂ (células deve aparecer para ser alongado ou em forma de bastonete, não arredondado em bolas).
9. Depois de adicionar a primeira alíquota da suspensão de células para a câmara de registo, 0,25 ml de uma solução de banho que contém 2 mM de CaCl ₂ deve ser adicionado o restante volume de suspensão de células. Esta suspensão de células remanescente pode ser mantido nesta solução em gelo e utilizados para a gravação de patch clamp para até 6 horas.

4.Uso de Grampo Whole Cell Patch para Medir KV7 correntes de potássio ou membrana de tensão

1. Depois de miócitos aderir à base de vidro da câmara de gravação (25 mm No. 1 lamela redondo, Warner Instruments), iniciar a perfusão contínua de solução de banho (Tabela 1). Para a gravação de correntes de KV7 em isolamento a partir das correntes de potássio do retificador atraso KV1 e KV2 famílias, a solução do banho deve ser suplementado com 100 mM GdCl _3.
2. Fabricar uma pipeta patch do vidro borossilicato (Kimax-51, Kimble Chase) utilizando um extractor de pipeta e microforge; sua resistência deve ser 4-5 MQ quando preenchidos com a solução de referência interna (Tabela 1). Revestir o. ^_1/3 inferior da pipeta (~ 1-2 mm acima da ponta) com 184 SYLGARD
3. Para a gravação de correntes em KV7 MASMCs, o adesivo perfurado células inteiras técnica de fixação de tensão deve ser usado. Utilização de uma configuração de adesivo perfurado ajuda a prevenir depletion da membrana fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP ₂₎ e rápida posterior (dentro de 5 min) resumo dos KV7 correntes, que é comumente observados utilizando a configuração convencional remendo rompido. Complementar a solução interno (Tabela 1) com 120 ug / ml Anfotericina B: adicionar 3 ul de estoque 2 mg / ml de anfotericina B (preparado em DMSO e congeladas em pequenas alíquotas e protegida da luz), a 0,5 ml da solução interna. Encher a ponta da pipeta patch com solução de anfotericina B livre interno, mergulhando a ponta da pipeta na solução de anfotericina B livre interno e, em seguida, a aplicação de sucção na outra extremidade através de uma seringa de 10 ml ligado por meio de um pedaço de tubo (Tygon R- 3603). Adicionar solução de anfotericina B contendo pipeta a partir do topo usando uma pipeta Eppendorf Microloader Tip até que a pipeta é cerca de metade cheio com a solução. Remova todas as bolhas de ar batendo suavemente na pipeta. Utilizar a pipeta de imediato.
4. Insira a pipeta napara o suporte de eléctrodo e usar um micromanipulador para baixar a pipeta para a superfície de um dos miócitos alongada (perto, mas não na parte superior do núcleo, a Figura 2). Quando a resistência da pipeta aumenta para 6-10 MQ, aplicar sucção para conseguir uma giga-seal (> 10 GΩ).
5. Definir segurando tensão para 0 mV enquanto espera por perfuração da membrana. Aplicar 100 degraus de tensão ms até 10 mV e depois para -10 mV, e usar o amplificador para compensar transientes de capacitância rápidos pipeta. Concorrente com o aparecimento de fenómenos transitórios de células inteiras de capacitância, pequenas sustentados correntes positivas (geralmente 2-10 pA) indica a presença de canais funcionais KV7.
6. Perfuração de sucesso com Anfotericina B irá reduzir a resistência de acesso a 35 MQ ou menos. Actual de gravação pode então ser iniciada utilizando um protocolo de 5 seg passo de tensão da tensão de -4 mV exploração. Usamos a tensão mV -4 segurando para alcançar inactivação máxima perto de outros tipos de rec retardadacorrentes de potássio (tifier mediada predominantemente por KV1 e KV2 canais) que de outra forma contaminar a gravação das relativamente pequenas não inactivantes KV7 correntes. O tempo (5 s) protocolo de degrau de tensão é necessário para atingir de estado estacionário de activação KV7 canais, que exibem activação dependente de voltagem lenta e de desactivação. Os KV7 correntes não inactivar durante os passos de tensão prolongada.
7. Para gravar o KV7 corrente-tensão relação (IV), aplicam-se 5 passos de tensão segundo a tensões que variam de -84 mV, em que a probabilidade de abertura dos canais de KV7 é mínimo, a 16 mV em que a probabilidade de abertura dos canais de KV7 atinge um planalto; após 5 segundos em cada tensão de ensaio, o passo de volta para a tensão de manutenção (mV -4) durante 10 seg. Vai levar cerca de 3,5 min para a série completa de impulsos de teste (Figura 3A). Execute 2-3 gravações de controle IV para garantir que as correntes registradas são estáveis ​​ao longo do tempo. Lote média final pulso correntes (médiacorrentes gravados para o último 1 seg) versus tensão para criar uma curva IV (Figura 3D). As curvas de controle IV deve ser aproximadamente sobreposta se as correntes são estáveis.
8. Antes de aplicar quaisquer agentes farmacológicos iniciar um protocolo claro tempo projetado para gravar continuamente atual a -20 mV. Garantir gravação estável da corrente durante pelo menos 5 minutos antes da aplicação do fármaco. Aplicar os agentes farmacológicos para 5-15 min ou até que um estado de equilíbrio é atingido (Figura 3C), em seguida, terminar o protocolo de curso de tempo e registro duas curvas IV utilizando o protocolo de voltagem passo. Washout do fármaco e gravar o curso de tempo de lavagem de drogas, seguido de gravação de duas curvas adicionais IV.
9. No fim do experimento, aplicar 10 linopirdine uM ou 10 uM XE991, inibidores irreversíveis da KV7 canais, estes fármacos devem inibir completamente as correntes registadas em tensões negativas até -20 mV (Figura 3D).

5. Uso de segmentos da artéria intacta por Miografia Pressão

1. Um sistema myograph pressão comprado de Danish Myo Technology (DMT A / S, Dinamarca, Modelo 110P) é utilizado para a experiência Miografia pressão. Montar o segmento de artéria na câmara de aço inoxidável, inserindo a cânula de vidro horizontalmente fixada em uma das extremidades esquerda e da cânula de vidro móvel para a direita, na outra extremidade. Dois transdutores de pressão (P1 na direita e P2 no lado esquerdo) são construídos para monitorizar a pressão no interior do lúmen da artéria. Fluido a partir da cânula de vidro direita vai ser utilizado para ajustar a pressão no interior da artéria do seu nível aproximado fisiológico. Para começar, a pré-encher uma seringa ml aberta 10 (que serve como uma coluna de pressão de alimentação por gravidade), com lúmen solução (Tabela 1). Levante a seringa para pressionar soluçãoção através de tubos de polietileno para dentro da cânula de vidro para a direita, tomando cuidado para evitar bolhas de ar no tubo ou cânula. A cânula esquerda deve ser pré-cheio com a solução do lúmen através de uma seringa de 1 ml. Encher a câmara myograph pressão com 10 ml de solução do banho do reservatório (Tabela 1). Frouxamente suspender dois pré-fabricados suturas de nylon finas em cada lado adjacente à cânula de vidro.
2. Transferir cuidadosamente o segmento de artéria mesentérica dissecado (geralmente uma 3 ^ª ou 4 ^ª ordem segmento, em torno de 200-350 um de diâmetro do passo 2.6) a partir da câmara de dissecação para a câmara de pressão por myograph segurando uma extremidade do segmento utilizando micro fórceps.
3. A visualização através de um microscópio de dissecação iluminada, segurar uma extremidade do segmento da artéria e deslize-o sobre a cânula de vidro da esquerda e fixar a extremidade utilizando suturas de nylon. Lavar suavemente o fluido do lúmen através do vaso montado para remover o sangue e os detritos no interior do vaso.A válvula para a esquerda seringa deve, então, ser fechado de forma que neste lado apresenta uma coluna estática de fluido em relação ao qual a pressão é ajustada a partir do lado direito.
4. Usando o micromanipulador posição, a cânula de vidro móvel direita próximo ao segmento da artéria e puxe a extremidade direita do segmento sobre ele, finalmente prendendo-o com as suturas de nylon. Cortaria os fios de sutura em excesso.
5. Monte a unidade myograph pressão sobre o palco sobre o microscópio myograph pressão. Coloque a tampa sobre a câmara de pressão myograph. A tampa para a câmara de entrada contém a superfusão e o tubo de sucção ligado a ele. Ligue a entrada de superfusão de um colector para permitir a superfusão do banho à temperatura ambiente ou 60 mM de KCl solução para a câmara de pressão myograph pela gravidade. As substâncias de ensaio, tais como drogas ou hormonas que são encontrados nas medições de patch clamp para afetar KV7 função do canal, são geralmente aplicados directamente à solução do banho, não via o banho superfusion ou na solução do lúmen. A superfusão de solução do banho será usado para lavar a solução de KCl. Encaixe o tubo de sucção a um sistema de vácuo para remover o excesso de superfusate. Inserir o sensor de temperatura na solução do banho através da abertura proporcionada na tampa da câmara de myograph.
6. Ligar a unidade myograph pressão para o sistema de mio-interface, o hardware que permite a comunicação da unidade de myograph ao software myoview (DMT).
7. Abra o software myoview no computador. Na janela de parâmetro, definida como a temperatura alvo de 35 ° C, com uma tolerância de temperatura de 1 ° C, a pressão de entrada de alvo de 80 mmHg e a pressão de saída como alvo de 80 mmHg. Carregar o ficheiro de calibração e calibrar o diâmetro do vaso exterior, de modo que as alterações no diâmetro da artéria está correctamente registada em microns. Ajuste o contraste necessário para permitir uma boa visão do segmento montado contra o fundo. Uma descrição detalhada de como usar o softwareé fornecido no manual do utilizador a partir de DMT.
8. Aumentar gradualmente a seringa de 10 ml (servindo como uma coluna de pressão de alimentação por gravidade) durante um período de 15 min, até o transdutor de pressão P1 lê 80 mmHg. Ao levantar a coluna de pressão, verificar se há algum vazamento no reservatório. Se houver algum vazamento, descarte o segmento e montar um outro segmento da artéria (repita os passos de 5.2). Ajustar a distância entre a cânula, quando necessário. A distância deve ser ajustado de tal forma que o segmento de artéria pressurizado é aproximadamente linear (mas não esticada) e forma um ombro, como padrão, onde as ligações são feitas (Figura 4A).
9. Ligar o aquecimento da câmara de pressão, através myograph os controles do sistema mio-interface. Permitir que a solução do banho para aquecer gradualmente até atingir a 36-37 ° C.
10. Use os ajustes XYZ do objetivo no microscópio DMT quando necessário para manter o navio em foco e facilitar o acompanhamento preciso do changes no diâmetro do vaso exterior.
11. Verificar a viabilidade do recipiente montado por superfusão transiente (~ 30 seg) com 60 mM de KCl. Um navio viável contrai rapidamente na adição de KCl e dilata imediatamente após a lavagem do 60 mM de KCl (superfuse aproximadamente 60 ml de solução do banho para lavar o KCl). Após este teste, reajustar o volume da solução do banho para exactamente 10 ml. A temperatura do banho é reduzida durante o teste de lavagem de KCl e porque as soluções são, à temperatura ambiente, mas a câmara do aquecedor irá restaurar a temperatura a 36-37 ° C em poucos minutos.
12. Permitir que a artéria a equilibrar durante pelo menos 30 min (o diâmetro deve ser estável durante pelo menos 10 min a última parte deste período). Adicionar a substância de teste concentrado à solução do banho e pipetar directamente frente e para trás suavemente perto das bordas da câmara de misturar a substância de teste na solução do banho, dando origem à concentração final adequada no volume da câmara de 10 ml. Changes na adição seguinte vaso diâmetro da substância de ensaio (s) pode ser controlada na imagem de vídeo em directo e também graficamente na janela de análise de imagem, enquanto a experiência está em andamento.
13. Depois de terminada a experiência, os dados armazenados arquivo (*. Mio) pode ser aberto como um arquivo de folha de cálculo para análise posterior.

6. Os resultados representativos

Os resultados mostrados na Figura 3 ilustram as gravações típicas de KV7 correntes de miócitos artéria mesentérica, utilizando um protocolo passo de tensão antes (Figura 3A, B traços pretos) e durante o tratamento com um activador de canal de Zn KV7 piritiona (ZnPyr, 100 nM; Figura 3A, B traços vermelhos). Dados de tensão semelhantes passo de 3 células, foi usada para preparar os corrente-voltagem (IV) parcelas mostrados na Figura 3D. Um curso de tempo representativa do aumento da amplitude de corrente (medida pelo fixador de tensão contínua, a -20 mV) during o tratamento com 100 nM de piritiona de Zn é mostrado na Figura 3C Figura 4B ilustra o decurso de tempo do efeito do ZnPyr no diâmetro da artéria mesentérica exterior medido utilizando Miografia pressão,. do vaso foi pré-contraído com 100 pM a arginina-vasopressina (AVP), antes da adição de 100 nM ZnPyr. Médias de dados de dose-resposta para ZnPyr induzida por dilatação da artéria mesentérica são mostrados na Figura 4C.

Figura 1. Imagem de uma arcada mesentérica na câmara de dissecção.

Figura 2. Imagem de um dos miócitos com uma pipeta de adesivo na sua superfície.

Figura 3. Traços originais do KV7 correntes, decurso temporal de drogas aplicação, IV curvas. A. Família de vestígios sequenciais correntes (painel inferior) gravados em resposta aos passos de tensão (painel superior) antes do tratamento (controlo, preto) e estabilização seguinte, na presença de 100 nM ZnPyr (vermelho) em um único MASMC. B. traços representativos de corrente de A (como indicado pelas setas) para o controlo (preto) e 100 nM para ZnPyr (vermelho). Barras cinza indicam intervalo de tempo em que as amplitudes médias atuais foram medidos para a corrente-tensão (IV) parcelas. Tensões de passo são indicados no lado direito por pontas de seta. C. Tempo de curso de aperfeiçoamento em andamento KV7 por 100 ZnPyr nM medida com braçadeira de tensão contínua a -20 mV (bar). D. Média IV curvas (n = 3) derivado de KV7 densidades de corrente registados antes (controlo, círculos a cheio), durante o tratamento com 100 nM ZnPyr (círculos abertos), e durante o tratamento com 10 uM XE991 (triângulos a cheio). Correntes de fuga não específicos foram subtraídos como descrito por Passmore et al. ^1.

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Figura 4. ZnPyr relaxamento induzido de uma artéria mesentérica pré-contraído com 100 pM AVP. Fotografia A. de uma artéria mesentérica montado no myograph pressão set-up. B. Evolução temporal das alterações no diâmetro exterior do recipiente, em resposta à aplicação de 100 pM AVP (barras abertas), seguido pela aplicação de 100 nM a ZnPyr (barra a cheio). C. O gráfico de barras que resume os resultados de 100 nM vasodilaion ZnPyr induzida.

Discussion

Os métodos e abordagens experimentais aqui descritas são bastante robustos e podem produzir resultados claros e reprodutíveis quando aplicado com atenção meticulosa aos detalhes. Boas gravações electrofisiológicos e constrição / dilatação dos segmentos arteriais são dependentes da saúde das células e os segmentos de artéria, respectivamente. Preparações de células pode variar de dia para dia, mesmo usando o mesmo protocolo. Soluções de isolamento podem ser utilizadas durante até 2 semanas, mas, se a qualidade da preparação de células é baixo em dois dias subsequentes Soluções de isolamento devem ser preparadas novas. Nós descobrimos que as actividades enzimáticas variar de lote para lote e, por conseguinte, as condições de isolamento (os tempos de incubação e concentrações de enzimas) requerem optimização com cada novo lote de enzimas. Verificámos também que o protocolo de isolamento de células descritas aqui em artéria mesentérica de rato não é óptima para outros leitos vasculares ou outras espécies, que podem ter uma combinação diferente ou densdade de componentes da matriz extracelular. Cada preparação vascular requer sua otimização próprio para identificar as condições que produzem as células saudáveis. Os critérios que se consideram mais úteis na identificação de células saudáveis ​​são: 1) morfologia da célula: aparência lisa, alongado, mas ligeiramente apertada após trituração segmentos MA na solução de isolamento contendo 50 mM ^de Ca2 ^+, e retendo a mesma aparência quando transferido para dois ^mM de Ca2 ⁺ contendo solução externa. Nem todas as células irão manter a sua forma quase completamente relaxado alongado, mas apenas miócitos quase completamente relaxados deve ser utilizado para a gravação eletrofisiológico, 2) As células devem ser opticamente denso, o que indica uma membrana intacta não danificado, 3) tensões de repouso da membrana de miócitos saudáveis ​​usado para correntes de potássio ou de registo para a fixação de corrente gravações de tensão de membrana deve ser mais negativo do que -40 mV (normalmente na gama de -45 mV para -56 mV, nas condições iónicas described em nosso protocolo aqui).

Para assegurar o sucesso gravações eletrofisiológicas, a solução do banho e a solução da pipeta (para a composição ver Tabela 1) deve ser preparado no dia do experimento. É crucial para ajustar a osmolalidade das soluções internas e banho a ser idêntico (298-299 mOsm).

Isobáricas medições feitas em função arterial artérias pequenas (<500 mm), utilizando Miografia pressão mais se aproximam das condições fisiológicas do que fazer medições de força isométrica feita utilizando um arame myograph. Os vasos de pressão de uma myograph são tipicamente mais sensíveis aos agonistas vasoconstritores ^2-4, mais estreitamente aproximam as sensibilidades medidos in vivo ^{5, 6.} A sensibilidade aumentada a concentrações baixas de agonistas permitiu a identificação de mecanismos de transdução de sinal induzida por concentrações fisiologicamente relevantes picomolares de AVP^{7, 8.}

Miografia pressão mantém a geometria do recipiente e mantém a integridade do endotélio. Endotélio mediadas efeitos das drogas podem ser distinguidas a partir de músculo liso mediadas por efeitos através da realização de medições paralelas em vasos intactos e endotélio desnudados ^9. A perturbação intencional do endotélio pode ser realizada por danos físicos ao endotélio (por exemplo, passando um fio de cabelo humano e para trás através do lúmen) ou por perfusão de ar através do lúmen da artéria. A perda da função endotelial (mas não a função do músculo liso vascular) deve ser confirmado por medição de uma resposta vasodilatadora reduzida mediada pelo endotélio de acetilcolina nos vasos pré-contraídos com um agonista de ^9.

Medidas paralelas de correntes iônicas / tensão de membrana em miócitos artéria mesentérica usando técnicas de patch clamp e constrição arterial / dilatação de arterite mesentéricaes usando Miografia pressão pode permitir a elucidação dos papéis dos canais de íons específicos em ambas as cascatas de transdução de sinais fisiológicos e nas ações dos agentes terapêuticos. Os tratamentos destinados classes específicas de canais de iões ou intermediários de transdução de sinal específicas podem ser aplicadas de forma aditiva ou em sequência, para fornecer informações acerca dos papéis mecanicista destes canais na regulação da função dos miócitos no nível celular e da constrição / a dilatação das artérias intactas. Resultados convergentes de tratamentos que aumentam ou inibem a determinados tipos de correntes iónicas com os efeitos correspondentes no diâmetro da artéria proporcionar interpretações mais fiáveis ​​do que podem ser obtidos utilizando-se o método por si só. Idealmente, a concentração-dependência dos agentes em estudo deve ser determinada em ambos os sistemas. Para avaliar a relevância fisiológica ou terapêutica, as concentrações testadas devem estar relacionados com as concentrações medidas no ambiente fisiológico or obtida com terapias clínicas. Exemplos destes tipos de abordagens experimentais podem ser encontrados nos nossos anteriores ^8-10 publicações.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S5886	Dissecting Solution: 145 Bath solution for Electrophysiology*: 140 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 140 Bath solution for pressure myography: 145 Lumen solution for pressure myography: 145
Potassium chloride	Sigma	P5405	Dissecting Solution: 4.7 Bath solution for Electrophysiology*: 5.36 Internal solution for electrophysiology: 135 Isolation solution for myocytes*: 5.36 Bath solution for pressure myography: 4.7 Lumen solution for pressure myography: 4.7
Potassium EGTA	Sigma	E4378	Internal solution for electrophysiology: 0.05
HEPES	Sigma	H9136	Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 10 Isolation solution for myocytes*: 10
Disodium hydrogen phosphate	Sigma	S5136	Isolation solution for myocytes*: 0.34
Potassium hydrogen phosphate	Sigma	P5655	Isolation solution for myocytes*: 0.44
Magnesium Chloride	Sigma	M2393	Bath solution for Electrophysiology*: 1.2 Internal solution for electrophysiology: 1 Isolation solution for myocytes*: 1.2
Calcium Chloride	Sigma	C7902	Bath solution for Electrophysiology*: 2 Isolation solution for myocytes*: 0.05
Sodium phosphate	Fisher Scientific	BP331-1	Dissecting Solution: 1.2 Bath solution for pressure myography: 1.2 Lumen solution for pressure myography: 1.2
Magnesium Sulfate	Sigma	M2643	Dissecting Solution: 1.17 Bath solution for pressure myography: 1.17 Lumen solution for pressure myography: 1.17
MOPS	Fisher Scientific	BP308	Dissecting Solution: 3 Bath solution for pressure myography: 3 Lumen solution for pressure myography: 3
Pyruvic acid	Sigma	P4562	Dissecting Solution: 2 Bath solution for pressure myography: 2 Lumen solution for pressure myography: 2
EDTA dihydrate	Research Organics	9572E	Dissecting Solution: 0.02 Bath solution for pressure myography: 0.02 Lumen solution for pressure myography: 0.02
D-Glucose	Sigma	G7021	Dissecting Solution: 5 Bath solution for Electrophysiology*: 10 Internal solution for electrophysiology: 20 Isolation solution for myocytes*: 10 Bath solution for pressure myography: 5 Lumen solution for pressure myography: 5
Bovine serum albumin	Sigma	A3912	Dissecting Solution: 1% Lumen solution for pressure myography: 1%
pH			Dissecting Solution: 7.4 Bath solution for Electrophysiology*: 7.3 Internal solution for electrophysiology: 7.2 Isolation solution for myocytes*: 7.2 Bath solution for pressure myography: 7.4 Lumen solution for pressure myography: 7.4
Osmolarity			Dissecting Solution: 300 Bath solution for Electrophysiology*: 298 Internal solution for electrophysiology: 298 Isolation solution for myocytes*: 298 Bath solution for pressure myography: 300 Lumen solution for pressure myography: 300
*11
Table 1. Components of solutions used in the experiment.