Summary
Dans le patch situ enregistrements de serrage sont utilisés pour la caractérisation électrophysiologique des neurones dans les circuits intacts. Dans le modèle de la drosophile génétique patch-clamp est difficile, car le système nerveux central est petite et entourée d'une gaine robuste. Cet article décrit la procédure pour retirer les neurones gaine et propre pour la suite des enregistrements de patch-clamp.
Abstract
Temps de génération courts et faciles techniques génétiques faire la mouche du vinaigre Drosophila melanogaster un excellent modèle génétique dans la recherche en neurosciences fondamentales. Les canaux ioniques sont la base de tout comportement depuis qu'ils médiation excitabilité neuronale. Le canal d'ions première tension fermée cloné était la tension Drosophila canaux potassiques Shaker 1,2 fermée. La compréhension du rôle des canaux ioniques et excitabilité membranaire pour la fonction du système nerveux, il est utile de combiner puissants outils génétiques disponibles chez la drosophile in situ avec des enregistrements de patch-clamp. Pendant de nombreuses années ces enregistrements ont été entravés par la petite taille du SNC chez la drosophile. En outre, une gaine robuste en cellules gliales et de collagène constituent des obstacles pour l'accès pipette de patch pour les neurones centraux. La suppression de cette gaine est une condition préalable nécessaire pour les enregistrements de patch-clamp de toute neurone dans le SNC chez la drosophile adulte. Ces dernières années,les scientifiques ont été en mesure d'effectuer in situ des enregistrements de patch-clamp de neurones dans le cerveau adulte et 3,4 cordon nerveux ventral embryonnaire de 5,6, 7,8,9,10 larves et adultes Drosophila 11,12,13,14. Une étable giga-joint est la principale condition préalable à un bon patch et dépend de contact net de la pipette de patch avec la membrane de la cellule pour éviter les courants de fuite. Par conséquent, pour toute cellule in situ des enregistrements de patch-clamp de neurones de drosophile adulte doivent être soigneusement nettoyés. Dans la première étape, la gaine ganglionnaire doit être traitée par voie enzymatique et enlevées mécaniquement de rendre les cellules cibles accessible. Dans la seconde étape, la membrane de la cellule doit être polie de façon qu'aucune couche de matériau glie, le collagène ou d'autres peuvent perturber giga-joint formation. Cet article décrit comment préparer un neurone central identifié dans le cordon nerveux ventral chez la drosophile, le motoneurone vol 5 (MN5 15), pour tout c somatiqueenregistrements ell patch clamp. Identification et visibilité du neurone est obtenue par l'expression ciblée de la GFP dans MN5. Nous n'avons pas pour but d'expliquer la technique de patch-clamp lui-même.
Protocol
La description qui suit n'est pas spécifique d'un motoneurone. Il peut être utilisé avec n'importe quel neurone. Dans cet exemple, nous utilisons les 5 vol (MN5) motoneurone qui innerve les deux fibres dorsalmost du muscle dépresseur dorsolongitudinal aile (DLM). D'identifier et de visualiser MN5 nous utilisons le système UAS/GAL4 pour exprimer la GFP dans les motoneurones de vol (et quelques autres neurones).
1. La dissection des adultes Drosophila accéder à la partie dorsale de la chaîne nerveuse ventrale (VNC)
- Disséquer un côté drosophile adulte dorsale le long de sa ligne médiane dorsale dans une boîte de Petri revêtue Sylgard (35 mm de diamètre), comme décrit dans Ryglewski et Duch (2009 13). Un film de cette dissection est disponible en ligne via JoVE (Boerner et Godenschwege 16. Voici une brève description de la dissection.
- Les mouches adultes sont anesthésiés par refroidissement sur de la glace pendant environ 1 min. Ceci peut être réalisé par un pré-refroidissement d'un flacon vide volée (sans nourriture)sur la glace et placer la mouche dans le flacon déjà froid. Ailes et les pattes sont enlevées avec une paire de ciseaux.
- La mouche est ensuite tombé face dorsale dans une boîte de Petri Sylgard couché (nous utilisons le couvercle d'une boîte de Petri de 35 mm rempli à ras bord avec du Sylgard; figures 1A, B) avec un anneau en plastique (diamètre intérieur 9 mm, 1,3 mm d'épaisseur ) collé à la Sylgard avec de la vaseline.
- L'utilisation du couvercle d'une boîte de Petri de 35 mm facilite l'accès à la VNC avec une pipette de patch sous visualisation avec un verre d'eau de trempage. Cela contribue à introduire la pipette superficiellement sans toucher la paroi de la cuvette.
- L'anneau en plastique peut être fait en perçant un trou dans une feuille de plastique (que nous utilisons 1,3 mm d'épaisseur) mince. On utilise un coupe-fil pour définir le périmètre extérieur de la bague de sorte qu'il s'adapte le plat.
- Immerger la volée dans une solution saline normale (Figure 1C; composition de solution saline en mM: NaCl 128, KCl 2, CaCl 2 1,8, MgCl 2 4, 5 HEPES, le saccharose ~ 35 depending sur l'osmolalité de la solution; pH est ajusté à 7,25 avec NaOH 1 M, de l'osmolalité est ajustée à 290 mOsm avec du saccharose).
- L'animal est disséqué le long de la ligne médiane dorsale, et les grands dorsaux muscles de vol longitudinales sont tendus latéralement et épinglé à exposer l'intestin, l'œsophage et les sous VNC. Après le retrait de l'intestin et de l'œsophage, le VNC est exposée (figure 1D).
- En option, la mouche peut être décapité à cette étape (figure 1E). Démontage de la tête rend l'accès à l'enzyme et pipettes de patch plus commode, et MN5 dendrites ne sont pas perturbés lors du nettoyage du soma (dendrites sont postérieures au soma, les figures 2B, C). Cependant, la tête peut également être laissé intact si requis par la conception expérimentale (par exemple, l'étude de descendre d'entrée à motoneurones thoraciques). Dans ce cas, la pipette peut être introduit à partir postérieur ou latéral (latéraux, figure 2A).
- Pour rapideéchange saline au cours d'expériences le volume de la chambre d'enregistrement est réduite au minimum en plaçant un anneau en plastique (diamètre intérieur de 9 mm) autour de l'animal disséqué et le collage à plat avec la vaseline (figures 1A, B, volume de la chambre d'enregistrement est d'environ 200 pl) .
- La préparation est ensuite monté sur un microscope droit de scène fixe fluorescence (Zeiss, nous utilisons Axioskop 2 FS plus, Zeiss, Allemagne) et affiché avec une grande ouverture numérique (> 0,75), longue distance de travail (> 2 mm), objectif 40x eau de trempage. Le système de perfusion (solution saline dans, une solution saline de départ), le fil de terre et la pipette enzyme sont introduits dans la chambre d'enregistrement (figures 1F - J, L).
2. Visualisation de MN5 (voir les figures 2 et 3), Head Off
- Montez la boîte de Pétri sur un microscope à épifluorescence étape montant fixe.
- Positionner le récipient avec la volée en elle de telle sorte que la partie antérieure tournée vers le côté où le porte-électrode estmonté (figure 1).
- Utilisez un fort grossissement (40x ou plus), grande lentille d'eau plongeant NA (NA 0,75 ou plus) et un filtre GFP pour éclairer la VNC. Pour une bonne visualisation de la cellule pendant le nettoyage que nous utilisons de l'eau 40x tremper les lentilles avec un NA soit 0,8 (Olympus LUMPlanFl 40xW), ou un NA de 0,75 (Zeiss W N-Achroplan 40x/0.8 M27). Pour un bon accès à la pipette de patch la distance de travail doit être de 2 mm ou plus.
- Deux MN5 sont situés dans la neuromere mésothoracique sur la face dorsale du ganglion près de la ligne médiane entre - et peut-être partiellement couverte par - trachée importante (figures 2 et 3). MN5 avec leurs dendrites apparaissent comme une zone diffuse vert. Le corps cellulaires deviennent plus distinctes après le nettoyage. Cependant, leurs dendrites n'apparaîtra pas forte, mais reste floue à cause de leur toujours recouvert de tissu (figures 2A, B).
- Dans notre configuration, nous utilisons une source de fluorescence HBO 100 lumière dans laquelle nous ne pouvons pas modifier l'intensité de sortie de la lumière. Nous utilisons des filtres de densité neutre pour éviter la sur-exposition du tissu à la lumière fluorescente trop, en particulier la lumière bleue. Cela peut causer des dommages photo et finira par tuer les cellules. Nous utilisons de densité neutre de 0,8. Pas de blanchiment devrait avoir lieu au cours de la procédure de nettoyage. Si blanchiment se produit, le plus souvent l'intensité lumineuse est trop forte. La cellule photo est endommagé.
- Si l'éclairage LED est utilisé, les réglages d'intensité devra être déterminée par l'expérimentateur. Le blanchiment est un signe de photovieillissement et doit être évitée.
3. Autre méthode pour la visualisation de MN5
Pour notre application, il est important d'avoir la cellule marquée, par exemple avec l'expression de la GFP ciblée. En variante, DII, un colorant lipophile, peut être utilisé pour étiqueter rétrograde ce neurone. Dans ce cas, des cristaux de colorant sont insérées dans le muscle vol à l'aide d'une goupille d'insectes minuties, et la plaie est fermée à l'aide de UDurcissement de la colle V.
- Préparer une solution mère en dissolvant une Dil cristaux DiI peu (aucun montant spécifique) dans 100 ul d'éthanol à 70%. Cette solution peut être conservée à -20 ° C jusqu'à leur utilisation vers le haut. Congélation et de décongélation répétée n'est pas un problème.
- 5 ul de la solution sont alors à la pipette sur une lamelle couvre non traitée. Attendez jusqu'à ce que l'éthanol soit évaporé. Cela ne prend que quelques min.
- Placer une mouche dans un flacon pré-refroidi (en le collant dans la glace) et refroidir pendant une courte période de temps (moins de 1 min) sur de la glace. Placez la volée froid anesthésié sur une plaque de refroidissement sous un stéréomicroscope dissection.
- Centre de la mouche et maintenez-le en place afin qu'il ne peut pas être écarté facilement quand se faire piquer avec une épingle minuties.
- Utiliser deux pinces, l'un pour tenir la broche minuties, l'autre pour maintenir la volée vers le bas.
- Utiliser une pince secondaires pour maintenir une broche insecte minuties et gratter une partie de la DiI de la lamelle couvre-objet de sorte qu'il existe un cristal DiI sur la pointe de la broche de minuties (en utilisant lalamelle même et même endroit sur cette lamelle à chaque fois permet d'obtenir plus de teinture sur la broche chaque fois que la procédure est terminée). La broche ne doit pas être trop pointu, il peut se plier plus facilement et est donc difficile à utiliser.
- Puis percer un trou dans le milieu du thorax dorsal de la mouche à l'axe de minuties avec DiI sur la pointe. Les deux fibres musculaires du muscle dorsalmost vol dorsolongitudinal (DLM, les fibres musculaires 5 et 6 de chaque côté) sont innervés par MN5. Par conséquent, en plaçant des cristaux de colorant en plein milieu du thorax assure que les deux MN5 seront étiquetés parce que les deux 6 fibres musculaires de la DLM se faire du mal et tu auras un peu de colorant.
- Le colorant doit être placé directement sous la cuticule. Si le colorant est inséré trop profondément, la mouche peut être poignardé ou d'autres neurones (par exemple MN1-4) pourrait être qualifiée ainsi.
- Cette opération est répétée jusqu'à ce que suffisamment de colorant (il s'agit d'une question de pratique et de l'expérience) est inséré dans le thorax
- Dil n'est pas solub l'eaule, par conséquent, il ne se dissout pas dans le cytosol du muscle et devra être «bourré» sous la cuticule.
- Puis une autre broche minuties est plongé dans une gouttelette de colle durcissant aux UV (on met une goutte de colle dans une nacelle de pesée).
- La colle qui se trouvent sur l'extrémité de la broche minuties est utilisé pour fermer la plaie où les cristaux de colorant ont été insérés.
- Après l'application d'un peu de colle (seulement un peu pour fermer la plaie, pas l'ensemble du thorax) un pistolet UV est utilisée pour durcir la colle. Nous utilisons deux intervalles de 10 s d'exposition à la lumière UV.
- Les mouches sont traités mis sur les produits frais dans un flacon à la mouche. Assurez-vous que la goutte de colle sur le thorax des mouches ne colle pas aux parois du flacon qui piège les mouches.
- Le colorant besoin de quelques heures pour atteindre le neurone cible. Il se déplace le long de la membrane, et non pas dans le cytosol car il est soluble dans les lipides. Nous traitons les animaux dans l'après-midi et les laisser toute la nuit.
- Expériences de patch-clamp sont effectuées le lendemain. Les neurones sera moins visible par rapport à l'utilisation de la GFP exprimé génétiquement.
4. Préparation de la pipette enzyme qui est utilisée pour le nettoyage
Il est important d'assurer un flux constant de solution saline à travers la chambre d'enregistrement. Avoir la hausse le volume du bain et la chute doit être évitée car elle provoque des vibrations et compenser les changements potentiels au cours des expériences. De perfusion et d'aspiration doivent être fixés en conséquence. Cela rend beaucoup plus facile l'échange solution, qui à son tour est important pour les laver rapidement de la protéase avant l'expérience et l'échange rapide d'agents pharmacologiques pendant l'expérience.
- Assurer la perfusion de la chambre d'enregistrement (débit d'environ 2 ml par minute). Le débit peut être réglé soit en utilisant un robinet ou en utilisant tuyaux de diamètre précis (plus le diamètre, plus le débit). Ayez le volume de la chambre aussi petite que possible pour garantir l'échange rapide de la solution en ee chambre. Ceci assure l'élimination rapide de la protéase et les inhibiteurs de la chambre d'enregistrement.
- Le volume de la chambre dépend de la façon dont la solution saline de départ (figure 1) du système de perfusion est inséré dans la chambre d'enregistrement (lorsque l'objectif à immersion en eau est abaissée dans le bain).
- Assurez-vous que la sortie de solution saline est positionné de façon que le titre de l'enregistrement de la chambre ne pas augmenter et diminuer constamment (aspiration, montée, l'aspiration, la hausse), mais reste constante (aspiration constante). Nous déterminons la perfusion continue et stable par la constante, gargouillement jamais interrompue qui est produite par une solution saline aspire constamment hors de la salle de bain.
- Comme solution saline et de départ, nous utilisons des aiguilles hypodermiques qui sont pliés et attachés à tubes étroits et placé à proximité de la chambre d'enregistrement en utilisant la pâte à modeler (figure 1F).
- Tirez une pipette de patch et de briser la pointe un peu sous contrôle visuel. Utilisez fines pinces propres. Lors de la visualisation de la pipette under de la lentille à immersion 40x eau le diamètre de la pointe de pipette doit être approximativement entre 40 et 70% du diamètre de la cellule soma. Conseils très grandes (environ cellule de diamètre ou plus) peut également être utilisé, cependant, la probabilité d'arrachant le corps de la cellule augmente en raison des forces capillaires de la pipette. La pipette est très faible (moins de 10% du diamètre soma), il obstrue facilement, ce qui se traduit par avoir à utiliser un ou plusieurs nouvelle pipette (s) au cours de la procédure de nettoyage.
- Remplir la pipette avec la protéase 2% dans du tampon PBS ou de solution saline sans l'obstruer.
- Insérer la pipette enzyme dans le porte-électrode. Pour assurer un contrôle adéquat de la pression appliquée, le titulaire doit être hermétiquement fermés.
- Fixer un tuyau à la sortie du petit support de pipette et le fixer de manière à tirer sur l'extrémité libre du tuyau n'a pas d'incidence que la pipette a été insérée dans le porte-pipette. Vérifier le mouvement sous le microscope.
- Insérez soit un p en plastique ipette pointe (le type qui est utilisé avec une pipette automatique, nous utilisons les 1000 bleu ceux ul, mais c'est une question de préférence. D'autres tailles peuvent être utilisés aussi bien) ou une seringue avec une bite dans l'extrémité libre de la tubulure pour pouvoir appliquer une pression positive et négative de la pipette enzyme / patch. Une pression positive est appliquée par soufflage soit dans la pointe de pipette (de l'utiliser comme une pièce de bouche) ou en appuyant sur la seringue. Une dépression est appliquée par aspiration (avec la bouche à l'aide de la pièce de bouche) ou en retirant la seringue.
- Le but des applications de pression positive et négative est de desserrer et enlever les cellules et les débris entourant les cellules étudiées. Une pression positive est éjecté enzyme de la pipette de nettoyage et de souffler des débris de la surface du SNC. Une pression négative est utilisée pour aspirer les débris de la VNC (comme un aspirateur).
5. Nettoyage de la GFP-étiqueté MN5 (figure 3 et la vidéo)
contenu "> Note au lecteur: Images de MN5 avant et après le nettoyage sont difficiles à distinguer dans la figure 3 C'est ce que vous obtenez dans la vie réelle Il faudra une formation pour apprendre à distinguer les différences subtiles entre nettoyés et non nettoyés.. neurones. S'il vous plaît noter que ces différences peuvent être mieux vu dans les images en mouvement. Par conséquent, le film donne une meilleure impression que les images statiques (Figure 3).- Visualisez l'enzyme rempli pipette sous la lentille d'eau plongeant 40x avec lumière (figure 3B, flèche blanche).
- Concentrez-vous sur la pointe de la pipette. S'il est bouché, essayez d'obtenir la saleté en appliquant une pression positive ou négative. Si la saleté ne sort pas, préparer une nouvelle enzyme rempli pipette.
- Passez à la lumière fluorescente (figure 3A).
- Abaissez la pipette enzyme avec soin et recentrer jusqu'à ce que le corps de la cellule peut être vu.
- Lorsque la pipette est à proximité de l'enzyme de l'corps de la cellule, passez la perfusion hors tension.
- Appliquer une pression positive sur de courtes distances vers le corps cellulaire de sorte que tout ce qui fait obstacle à l'accès à la cellule sera desserrés. Ce qui doit être fait jusqu'à ce que le tissu qui entoure le corps de la cellule se détache.
- Également déplacer la pipette enzyme dos pour attraper les débris qui peut être un reliquat de la gaine qui entoure le ganglionnaire VNC. Il a peut-être déjà été supprimé par la dissection avant le montage de la préparation sur le microscope (ce n'est pas toujours le cas).
- Avec une alternance application d'une pression positive et négative, utilisez la pipette enzyme comme un aspirateur et le vide autour du corps cellulaire. Il n'est pas nécessaire de desserrer le corps de la cellule entière complètement. Le nettoyage de la partie antérieure de la soma se faire (ou la partie postérieure ou latérale selon de quel côté de la pipette se rapproche le soma).
- Cette procédure de nettoyage est effectué jusqu'à ce que la membrane semble exempt de débris.
- La membrane est propre quand il n'y a pas de "shadow" ou le contraste diffuse entre la cellule et les tissus environnants lorsqu'on la visionne à la lumière fluorescente. Ceci peut être vu mieux avec la lumière bleue d'intensité élevée. Par conséquent, augmenter l'intensité lumineuse pour un moment (on enlève les filtres de densité neutre pour réaliser cela). Notez que vaste exposition à la lumière bleue fournie par une régulière HBO 100 ampoule au mercure peut causer des dommages photo dans environ une minute. Cela se traduira par le signal de la GFP à s'estomper à mesure que les cellules meurent.
- Passez à la lumière et éliminer les cellules et les débris qui n'ont pas pu être observés avec une lumière fluorescente. Notez que la visualisation de la trachée et de l'état de nettoyage peuvent bénéficier de la commutation entre lumière et de la lumière fluorescente.
- Lorsque la procédure de nettoyage est terminé et que le corps de la cellule semble propre, mettez le système de perfusion en marche (le faire aussi si la procédure de nettoyage dure plus de 3 à 5 min et continuer le nettoyage avec une perfusion continue) et la lumière éteinte.
- Rincer la cellule de for ~ 15 à 20 min avec une solution saline ou de la solution qui sera utilisée pour la demande suivante. Pas moins de 40 ml doit passer par la chambre d'enregistrement pour être sûr que la protéase est lavé. Restes de protéase sur la surface de la cellule provoque la mort des cellules soudaine pendant autrement stables enregistrements de patch-clamp.
6. Électrophysiologie
- Conventionnel in situ pince cellule patch entier dans la pince de tension et le mode pince de courant est effectuée à l'aide d'un amplificateur Axopatch 200B (Molecular Devices, Etats-Unis), les signaux sont convertis par un Digidata 1320 (Molecular Devices, Etats-Unis) et analysées avec le logiciel pClamp 10,2.
- Pipettes de patch sont tirés de capillaires en verre borosilicate avec un extracteur vertical pipette (Narishige, PC-10).
- Pipette à pointe résistances sont comprises entre 5,8 et 6,2 MQ (pince de courant et de potassium enregistrements actuels) et entre 2,8 et 3,5 MQ (pour les enregistrements en cours de calcium), respectivement. Résistance à la pointe dépendsolutions intra-et extracellulaire utilisé (pour plus de détails voir 13, 14).
7. Les résultats représentatifs
Après la procédure de nettoyage à la fois MN5 sont prêts à pince in situ de cellules patch entier (figure 3). La section suivante présente pince de tension représentant et des traces de serrage actuelles enregistrées à partir de MN5 soma après avoir utilisé la procédure de nettoyage décrite. MN5 exprime une variété de canaux ioniques dépendants de tension (voir aussi 13,14). Nous montrons un exemple de tension courants calciques dépendants (figure 4), la tension des courants potassiques dépendants (figure 5) et des traces de potentiels d'action (figure 6). Tension de calcium fermé et les courants potassiques ont été évoqués par les protocoles de tension semblables, mais les solutions qui ont été utilisées diffèrent de manière à permettre que les canaux ioniques objet d'une enquête pour faire passer le courant (voir détails 13,14). Tous les autres ch majeur ion Tension ferméeannels ont été bloqués (canaux sodiques dépendants avec 100 nM tetrototoxin - pipetés directement dans le bain; la perfusion a été arrêtée pendant deux minutes - les canaux calciques de 500 uM, cadmiumchloride canaux potassiques avec 2 mM de 4-aminopyridine (4-AP) et 30 tetraethylammoniumchloride mM mM et 0,5 extracellulaire 4-AP, 20 tetraethylammoniumbromide mM et 144 mM cesiumchloride intracellulaire via la solution de patch intracellulaire dans la pipette de patch (pour plus de détails voir 13,14). traces potentiels d'action ont été évoqués par injection de courant dans le soma MN5 (Figure 6) sans utilisation de tous les bloqueurs de canaux ioniques 12.
Figure 1. La configuration de nettoyage. La mouche est coincé dans un couvercle Sylgard enduit d'un plat de Pétri de 35 mm dans lequel nous avons collé un anneau en plastique (diamètre intérieur 9 mm, 1,3 mm d'épaisseur) wième vaseline (A, B). Après immersion dans une solution saline à la volée (C), il est ouvert le long de la ligne médiane dorsale. Gut et l'œsophage sont retirés pour exposer la corde nerveuse ventrale (D). Pour une meilleure accessibilité de l'neuromere thoracique est enlevé de la tête (E). Après le montage de la préparation sur un microscope droit à épifluorescence, le système de perfusion (F, G, une solution saline, une solution saline, en-dehors, flèches blanches sur la gauche), ainsi que le fil de terre sont mis en position (F, G, flèche blanche à droite). L'enzyme de nettoyage rempli pipette est amené en position après immersion dans l'eau de l'objectif (40x, NA 0,8) a été abaissé dans le bain (H). Pour plus de clarté nous le montrent déjà avant que l'objectif a été abaissé (F, G, flèche blanche sur la droite). L'angle auquel la pipette enzyme qui est maintenu par un porte-HL-1-U électrode (J) entre dans la chambre d'enregistrement est important que la pipette ne doit pas toucher à la fois l'objectif et la bague en plastique. Cet angle varie de configuration de l'installation. Ici, il est d'environ 30 ° (voir dessin à J, K flèche). L'agencement de la pipette dans son support qui est fixé à un headstage est représentée sur la (L). Le headstage est attaché à un micromanipulateur motorisé. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. MN5 dans la chaîne nerveuse ventrale. MN5 peut être facilement identifié par son emplacement dans le cordon nerveux ventral chez la drosophile (VNC) lorsque la GFP est génétiquement exprimé par l'utilisation des motoneurones spécifiques GAL4 conducteurs (A). Le rectangle en pointillé représente la neuromere thoracique. Pour avoir une idée de la façon dont les tailles se rapportent les uns aux autres, nous montrons une pipette de patch de nettoyage approche de la MN5 gauche sur le côté gauche du muscle vol dorsolongitudinal. Pour une meilleure visualisation, la pipette de patch a été rempli avec un colorant rouge (dextrane-tétraméthylrhodamine, A). Le contralatralement saillie MN5 sont situés sur la surface dorsale de la neuromere mésothoracique du VNC sur chaque côté de la ligne médiane (vue de projection d'une image confocale à pile B). La saillie ipsilatérale MN1-4 sont situés plus en avant et latéralement en rapport avec MN5 (flèches B). Le cercle en pointillé entre les deux MN5 représente les dendrites des motoneurones de vol dans le neuropile y compris MN5 (B). Étiquette GFP en (B) a été renforcée par la coloration immunohistochimique avec un anticorps contre la GFP. Détails de MN5 morphologie sont rendus visibles en remplissant le neurone intracellulaire (iontophorèse) avec le traceur et invisible neurobiotin subséquente d'acquisition d'image confocale (C). La coloration a été rendue visible avec la streptavidine couplée à un fluorophore. La barre d'échelle est de 30 um.
Figure 3. MN5 nettoyage avant et après. Visualisation des MN5 est obtenue par expression de la GFP en utilisant le UAS/GAL4système (A, C, voir l'étiquette). MN5 avant (A, B) et après (C, D) de la procédure de nettoyage. Côté gauche de chaque image représente antérieure, côté droit représente postérieure. Pour enregistrer des neurones sont nettoyés avec une pipette de patch protéase remplie d'un bout cassé. La pipette enzyme n'est que faiblement visible (A, B, voir l'étiquette). Un médaillon en montre un agrandissement de MN5 fond avec la pipette enzyme s'approche de la cellule. MN5 ne peut pas être vu en pleine lumière avant que la procédure de nettoyage (B). Trachée doivent être enlevées si elles couvrent les cellules étudiées. Après la procédure de nettoyage, le contraste entre la cellule et le tissu environnant est plus nette (C, inférieure MN5), et la cellule peut maintenant être vu dans la lumière vive (D). La pointe de la pipette peut être vu plus clairement lorsque la lumière vive est utilisée. L'élargissement représente la zone dans le carré en pointillé avec MN5 frontières du corps cellulaire entouré par une ligne pointillée pour une meilleure identification. Visualisation en pleine lumière contribue souvent un jugement de la propreté.
Figure 4. Courant calcique dans MN5. Exemple d'enregistrement entières courants calciques cellulaires enregistrés à partir de MN5. Au moins deux courants calciques différents sont représentés, d'une basse tension de calcium activé transitoire et une tension continue élevée de calcium courant. Les courants ont été évoqués à partir d'un potentiel de maintien de -90 mV. Échelons de tension de -90 mV à +20 mV ont été appliquées. Bloquants ont été utilisés pour bloquer les canaux ioniques plupart des autres. Les artefacts ont été omis pour plus de clarté (pour la caractérisation des courants calciques MN5 voir Ryglewski et al., 2012).
Figure 5. Les courants potassiques dans MN5. Exemple d'enregistrement entières courants potassiques cellulaires enregistrés à partir de MN5. Les courants indiqués incluent calcium activés courants potassiques, car aucun des inhibiteurs calciques ont été appliquées. Les courants ont été évoqués d'une exploitationpotentiel de -90 mV pour le courant total de potassium (A) ou d'un potentiel de maintien de -20 mV à inactiver transitoires des courants potassiques et montrer que le courant continu de potassium (B). Échelons de tension de -90 mV à +20 mV ont été appliquées par incréments de 10 mV. Déconnecté de la soustraction des courants de potassium comme évoqué à partir d'un potentiel de maintien de -90 mV (A) et -20 mV (B) révèlent purs courants transitoires de potassium (C). Canaux sodiques dépendants ont été bloqués. Les artefacts ont été omis pour plus de clarté (pour la caractérisation des MN5 tension et les courants potassiques calcium voir Ryglewski et Duch, 2009).
Figure 6. Firing modèle exposé par MN5. Exemple d'enregistrement de tirer des modèles comme suscité par des injections dans MN5 somatiques actuels (0,4 nA, noir, 0,5 nA, gris) de 200 ms durée. Potentiel membranaire de repos est -59 mV. Pas de bloqueurs de canaux ioniques ont été utilisés. (Pour analyse pince de courant de mise à feu MN5schémas vu Duch et al., 2008).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lors de la visualisation des cellules avec des protéines fluorescentes comme la GFP, il est important de ne pas trop exposer la préparation à trop de lumière. Il peut en résulter des dommages photo. Nous utilisons 100W HBO ampoules au mercure à arc court pour l'éclairage, et nous utilisons aussi de densité neutre (ND) de 0,8 (filtres ND Chroma 0,3 et 0,5). Pour être en mesure de juger de la qualité de la visibilité de nettoyage efficace est primordial. Par conséquent, les filtres ND peut être retiré pour de courtes périodes d'environ 20 s pour plusieurs fois.
Lors de l'application une pression positive, le corps cellulaire «volets» un peu. Cela permet de juger de la qualité de la propreté. Dans le contraste corde nerveuse ventrale est très faible, et le mouvement peut être extrêmement utile pour visualiser les cellules. Le support d'électrode qui est utilisé pour la procédure de nettoyage (et aussi pour le patch de serrage) doit être hermétiquement fermés; demande par ailleurs contrôlée par la pression ne sera pas possible. Perdre la pression va perturber le déplacement réussi de tissus et debris et permettra d'éviter giga-joint formation
En cas in situ des enregistrements de patch-clamp doit être effectué après le nettoyage de la cellule, il faut savoir qu'il n'y a pas seulement une gaine entourant le cordon nerveux ventral dans son ensemble (qui doit être retiré pour tout enregistrement patch clamp de n'importe quel neurone central des mouches adultes ), mais les cellules elles-mêmes peuvent être entourés par une gaine de même. MN5, par exemple, est entourée d'une gaine non cellulaire qui peut être vue seulement avec une grande intensité d'illumination brève. En outre, les cellules peuvent être situés en dessous de la trachée. Dans le cas où la cellule ne sont pas accessibles, la trachée doivent être pris à part si ce n'est pas arraché avec la pipette lors de la procédure de nettoyage (après avoir été tiré sur le côté). La procédure de nettoyage tout doit être fait sans tirer sur le tissu trop. Cette procédure nécessitera une formation. Le meilleur est le nettoyage, la plus élevée sera la fréquence des immédiats giga-joints (moins de 1 s après avoir touché la cellule et relalléger la pression positive).
Selon le protocole de nettoyage et la rupture dans les scénarios suivants sont possibles: d'abord, si les cellules n'ont pas été nettoyées assez bien, un giga-joint n'est pas possible et l'expérience doit être interrompue. Deuxièmement, dans certains cas, le nettoyage est assez bon pour giga-joint formation, mais une mince reste à peine visible de la gaine reste autour du soma. Cela entraînera la membrane à se rompre et provoquer des courants de fuite de différentes amplitudes. Une conséquence moins grave de nettoyage des cellules est insuffisante que certains vestiges de la cause gaine augmente la résistance d'accès. Selon les critères de conception expérimentales de qualité différents pour le patch pourrait s'appliquer. Pour la surveillance des modes d'action potentiels en pince de courant du potentiel de membrane de la cellule doit être en bonne santé (-55 mV ou plus hyperpolarisé dans le cas de MN5), mais la résistance d'accès n'est pas une question aussi importante. Cependant, en évoquant des potentiels d'action en ré injection d'accès actueltance devient un problème. Pour évoquer grands courants potassiques qui sont originaires d'amplitude à proximité du site d'enregistrement de la fuite devrait être faible (dans le cas de MN5 résistance d'entrée doit par plus de 80 MQ) et la résistance d'accès ne doit pas être supérieure à 15 MQ. Pour la pince espace qui est nécessaire dans les enregistrements de potentiel imposé des courants de faible amplitude de calcium dendritiques qui proviennent tout à fait à une certaine distance du soma aucune fuite ne peut pas être mis en place (pour MN5 résistance d'entrée doit être supérieure à 120 MQ) et la résistance d'accès ne peut pas être supérieure à 12 MQ. Dans la plupart des enregistrements, nous mesurons les courants calciques avec des résistances d'accès entre 8 et 10 MW (comme lue sur le cadran de l'amplificateur Axopatch 200B après une résistance série et toute rémunération capacité cellulaire). Pour chaque type de cellule à enregistrer, les critères de qualité doivent être déterminés individuellement.
En utilisant la procédure de nettoyage décrite ici, nous pouvons tenir des enregistrements stables pour les approximationsTely 90 minutes. Nous n'observons pas considérable run-down (spécifiquement testés pour CAV2 et CAV3 courants calciques et pour Shaker, Shal, et un retard courants potassiques redresseur). Cependant, nous n'avons pas tenté de maintenir le patch plus longtemps et ne peut donc pas dire si longs enregistrements ne serait possible.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 | |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 | |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 | |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 | |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT | |
| ND filter set (unmounted) | Chroma Technology Corp. | 22000b series | |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
References
- Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila. Science. 237, 749-753 (1987).
- Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila. Science. 237, 770-775 (1987).
- Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (6), e248 (2007).
- Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O'Dowd, D. K. Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain. J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).
- Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
- Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current. J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).
- Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).
- Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons. J. Neurophysiol. , (2011).
- Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system. J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).
- Pulver, S. R., Griffith, L. C. Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics. Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).
- Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS Biol. 4, e63 (2006).
- Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability. J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).
- Ryglewski, S., Duch, C. Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron. J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).
- Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons. J. Physiol. , (2011).
- Ikeda, K., Koenig, J. H. Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection. J. Vis. Exp. (52), e3080 (2011).
