Summary
In situ Patch Clamp Messungen sind für elektrophysiologische Charakterisierung von Neuronen im intakten Schaltung verwendet. In der Drosophila genetische Modell Patch-Clamp ist schwierig, weil das ZNS ist klein und umgeben von einer robusten Hülle. Dieser Artikel beschreibt die Vorgehensweise, um die Scheide und sauber Neuronen für nachfolgende Patch Clamp Messungen entfernen.
Abstract
Short Generationszeiten und einfache genetische Techniken machen die Fruchtfliege Drosophila melanogaster eine hervorragende genetische Modell in grundlegenden neurowissenschaftlichen Forschung. Ionenkanäle sind die Grundlage aller Verhalten, da sie die neuronale Erregbarkeit zu vermitteln. Die erste Spannung Ionenkanal geklont war der Drosophila Spannung Kaliumkanal Shaker 1,2. Gegen das Verständnis der Rolle von Ionenkanälen und Membranerregbarkeit für die Funktion des Nervensystems ist es sinnvoll zu kombinieren leistungsfähige genetische Werkzeuge in Drosophila mit in situ Patch Clamp Messungen. Seit vielen Jahren solche Aufnahmen wurden von der geringen Größe der Drosophila CNS behindert worden. Darüber hinaus bildeten eine robuste Hülle aus Glia und Kollagen Hindernisse für Patch-Pipette Zugang zu zentralen Neuronen. Das Entfernen dieser Hülle ist eine notwendige Voraussetzung für Patch Clamp Messungen von jedem Neuron in der erwachsenen Drosophila CNS. In den letzten JahrenWissenschaftler konnten in situ Patch Clamp Messungen von Neuronen im erwachsenen Gehirn 3,4 und Bauchmark von embryonalen 5,6, Larven 7,8,9,10 und erwachsenen Drosophila 11,12,13,14 befragen. Eine stabile Giga-Dichtung ist die wichtigste Voraussetzung für eine gute Patch und hängt von sauberen Kontakt der Patch-Pipette mit der Zellmembran, um Kriechströme zu vermeiden. Daher muss für die gesamte Zelle in situ Patch Clamp Messungen von erwachsenen Drosophila Neuronen gründlich gereinigt werden. Im ersten Schritt hat der Ganglien-Hülle an enzymatisch behandelt und mechanisch entfernt, um die Zielzellen zu erreichen. Im zweiten Schritt hat der Zellmembran so poliert werden, dass keine Schicht aus Glia, Kollagen oder anderen Materials kann Giga-Dichtung Formation zu stören. Dieser Artikel beschreibt, wie Sie einen identifizierten zentralen Neuron in der Drosophila Bauchmark, die Flucht Motoneuron 5 (MN5 15), bereiten für somatische ganzen cell Patch Clamp Messungen. Identifizierung und Sichtbarkeit des Neurons wird durch gezielte Expression von GFP in MN5 erreicht. Wir zielen nicht auf die Patch-Clamp-Technik selbst zu erklären.
Protocol
Die folgende Beschreibung ist nicht spezifisch für einen Motoneuronen. Es kann mit jedem Neuron eingesetzt werden. In diesem Beispiel verwenden wir den Flug Motoneuron 5 (MN5), die die beiden dorsalsten Fasern des dorsolongitudinal wing depressor Muskel (DLM) innerviert. Zu identifizieren und zu visualisieren MN5 verwenden wir die UAS/GAL4 System GFP in den Flug Motoneuronen (und einige andere Neuronen) auszudrücken.
Ein. Dissection of Adult Drosophila Zugriff auf die Dorsal Teil der Bauchmark (VNC)
- Präparieren eines erwachsenen Drosophila Rückenseite entlang ihrer Mittellinie in einem dorsalen Sylgard beschichteten Petrischale (35 mm Durchmesser), wie in Ryglewski und Duch (2009 13) beschrieben. Ein Film dieser Sektion ist online verfügbar über JoVE (Boerner und Godenschwege 16. Nachfolgend finden Sie eine kurze Beschreibung der Dissektion.
- Erwachsenen Fliegen werden anästhesiert durch Abkühlen auf Eis für etwa 1 min. Dies kann durch Vorkühlung einem leeren fly Fläschchen (ohne Futter) erreicht werdenauf Eis und Platzierung der Fliege in der schon kalt Fläschchen. Flügel und Beine sind mit einer Schere entfernt.
- Die Fliege wird dann Dorsalseite hochgesteckt in einem Sylgard beschichtete Petrischale (wir verwenden den Deckel eines 35 mm Petrischale gefüllt bis zum Rand mit Sylgard; 1A, B) mit einem Kunststoff-Ring (Innendurchmesser 9 mm, 1,3 mm dick ) an die Sylgard mit Petrolatum verklebt.
- Die Verwendung des Deckel einer 35 mm Petrischale erleichtert den Zugang zum VNC mit einer Patch-Pipette unter Visualisierung mit einem Wasser Eintauchen Linse. Dies hilft, um die Pipette flach einzuführen, ohne die Wand berührt der Schale.
- Der Kunststoffring kann durch Bohren eines Loches in einem dünnen (wir verwenden 1,3 mm Dicke) Kunststofffolie bestehen. Wir verwenden einen Drahtschneider, um den äußeren Umfang des Rings definieren, so daß sie die Schale passt.
- Tauchen die Fliege in normaler Kochsalzlösung (1C; Zusammensetzung Kochsalzlösung in mM: NaCl 128, KCl 2, CaCl2 1.8, MgCl2 4, 5 HEPES, Saccharose ~ 35 depending zur Osmolalität der Lösung; pH wird auf 7,25 mit 1 M NaOH eingestellt wird Osmolalität bis 290 mOsM mit Saccharose eingestellt).
- Das Tier wird entlang der dorsalen Mittellinie seziert, und die großen dorsalen longitudinalen Flugmuskeln sind seitlich und streckte verstiftet Darm, Speiseröhre und die VNC unter aussetzen. Nach der Entfernung des Darms und der Speiseröhre, die VNC ausgesetzt (Abbildung 1D).
- Optional kann die bei diesem Schritt Fliege (1E) geköpft werden. Entfernen Sie den Kopf macht den Zugang mit dem Enzym und Patch-Pipetten bequemer und MN5 Dendriten nicht gestört werden, wenn die Reinigung der soma (Dendriten sind hinter dem Soma, 2B, C). Allerdings kann der Kopf auch intakt gelassen werden, wenn durch die experimentelle Design (zB Studium der absteigenden thorakalen Eingang Motoneuronen) erforderlich. In diesem Fall kann die Pipette von posterior oder lateralen (seitlichen, 2A) eingeführt werden.
- Für die schnelleKochsalzlösung Austausch während der Experimente das Volumen der Aufnahmekammer ist, indem ein Kunststoffring (Innendurchmesser 9 mm) um den eingeschnittenen tierischen und Ankleben an der Schüssel mit minimierter Petrolatum (1A, B; Volumen Ableitkammer ist ~ 200 ul) .
- Das Präparat wird dann auf eine aufrechte feste Bühne Fluoreszenzmikroskop montiert (wir verwenden Zeiss Axioskop 2 FS plus, Zeiss, Deutschland) und betrachtet mit einer hohen NA (> 0,75), lange Distanz (> 2 mm), 40x Wasser Eintauchen Ziel. Perfusionsanordnung (Kochsalzlösung-in, Salzlösung-out), werden der Erdungsdraht und das Enzym Pipette in die Aufnahmekammer (- J, L Figuren 1F) eingesetzt ist.
2. Visualisierung von MN5 (siehe Abbildungen 2 und 3), Head Off
- Montieren Sie die Petrischale auf einem aufrechten feste Bühne Epifluoreszenz-Mikroskop.
- Positionieren Sie die Schale mit der Fliege in es so, dass der vordere Teil der Seite, wo der Elektrodenhalter zugewandt istmontiert (Figur 1).
- Verwenden Sie eine hohe Vergrößerung (40x oder höher), hohe NA Wasser Eintauchen Objektiv (NA 0,75 oder höher) und eine GFP-Filter, um die VNC beleuchten. Für eine gute Visualisierung der Zelle während der Reinigung verwenden wir 40x Wasser Eintauchen Linsen mit einer NA von entweder 0,8 (Olympus LUMPlanFl 40xW) oder einer NA von 0,75 (Zeiss W N-Achroplan 40x/0.8 M27). Für einen guten Zugang mit der Patch-Pipette die Arbeiterklasse Abstand sollte 2 mm oder größer sein.
- Und möglicherweise teilweise durch bedeckt - - prominente Luftröhre (Abbildungen 2 und 3) Sowohl MN5 im mesothorakalen Neuromer auf der dorsalen Oberfläche des Ganglion in der Nähe der Mittellinie zwischen. MN5 mit ihren Dendriten erscheinen als diffuse grünen Bereich. Die Somata werden deutlicher nach der Reinigung. Jedoch wird ihre Dendriten anscheinend nicht scharf, sondern bleiben verschwommen wegen ihnen noch von Gewebe (2A, B) bedeckt.
- In unserem Setup verwenden wir eine HBO 100 Fluoreszenz-Lichtquelle in denen wir nicht modIfy die Lichtleistung Intensität. Wir verwenden Neutralfilter um Überbelichtung des Gewebes zu viel fluoreszierendes Licht, insbesondere blaues Licht zu vermeiden. Dies kann dazu führen photo Schäden und letztlich töten die Zellen. Wir verwenden neutrale Dichte von 0,8. Nr. Bleich sollte im Verlauf des Reinigungsvorgangs erfolgen. Wenn Bleichen auftritt, wahrscheinlich die Lichtausbeute ist zu stark. Die Zelle ist photo beschädigt.
- Wenn LED-Beleuchtung verwendet wird die Intensität Einstellungen müssen vom Experimentator bestimmt werden. Bleaching ist ein Zeichen von Lichtschäden und muss vermieden werden.
3. Alternative Methode zur Visualisierung von MN5
Für unsere Anwendung ist es wichtig, dass die Zelle markiert, beispielsweise durch gezielte Expression von GFP. Alternativ kann DiI, einer lipophilen Farbstoff, verwendet, um dieses Neurons retrograd beschriften werden. In diesem Fall Farbstoff Kristalle werden in die Flugmuskel Verwendung eines Insekts minutien Stift eingesetzt und die Wunde wird verschlossen mit UV Aushärten Kleber.
- Einen DiI Stammlösung durch Auflösen einige DiI Kristalle (kein bestimmter Betrag) in 100 pl 70% igem Ethanol. Diese Lösung kann bei -20 ° C aufbewahrt werden, bis aufgebraucht. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist nicht ein Problem.
- 5 ul der Lösung werden dann auf einen unbehandelten Deckglas pipettiert. Warten Sie, bis das Ethanol verdampft ist. Dies dauert nur ein paar min.
- Legen Sie eine Fliege in einem vorgekühlten Röhrchen (indem Sie es in Eis) und kühl für einen kurzen Zeitraum (weniger als 1 min) auf Eis. Legen Sie die kalte betäubt Fliege auf einer Kühlplatte unter einer Dissektion Stereomikroskop.
- Zentrieren Sie die Fliege und halten Sie sie fest, so dass sie nicht beiseite leicht werden, wenn mit einem minutien pin stocherte geschoben.
- Verwenden Sie zwei Zangen, ein, um die minutien Stift, der andere ein, um die Fliege zu halten gedrückt halten.
- Verwenden groben Zange, ein Insekt minutien Stift zu halten und kratzen einige der DiI vom Deckglas so dass es eine DiI Kristall auf der Spitze des minutien Stift (sogenanntesselben Deckglas und am selben Ort auf diesem Deckgläschen jedes Mal hilft, um mehr Farbstoff auf dem Stift jedes Mal das Verfahren durchgeführt wird). Der Stift sollte nicht zu spitz sein, könnte es leichter biegen und ist dann schwer zu bedienen.
- Dann Punktion ein Loch in der Mitte der Fliege dorsalen Thorax mit dem minutien Stift mit DiI an der Spitze. Die beiden dorsalsten Muskelfasern des dorsolongitudinal Flugmuskel (DLM, Muskelfasern 5 und 6 auf jeder Seite) werden von MN5 innerviert. Daher Anordnen Farbstoffkristalle rechts in der Mitte des Thorax gewährleistet, daß sowohl MN5 markiert wird, weil beide Muskelfasern 6 des DLM wird verletzt werden kann und etwas Farbstoff.
- Der Farbstoff sollte direkt unter der Oberhaut platziert werden. Wird der Farbstoff zu tief eingeschoben wird, kann die Fliege erstochen oder anderen Neuronen (zB MN1-4) könnte auch markiert sein.
- Dies wird solange wiederholt, bis genügend Farbstoff (das ist eine Frage der Übung und Erfahrung) in den Brustkorb eingefügt wird
- DiI ist nicht wasserdicht soluble, deshalb wird es nicht in das Cytosol des Muskels aufzulösen und müssen "gefüllt" werden unter der Cuticula.
- Dann noch minutien Stift in einem Tropfen von UV-härtenden Kleber (wir setzen einen Tropfen Kleber in einem Wägeschiffchen) getaucht.
- Der Leim, der jetzt auf der Spitze des minutien Stift verwendet wird, um die Wunde in dem die Farbstoff-Kristalle wurden eingesetzt schließen.
- Nach dem Aufbringen der etwas Klebstoff (nur ein wenig um die Wunde, nicht die gesamte Thorax schließen) ein UV Pistole verwendet wird, um den Kleber zu härten. Wir verwenden zwei 10 s Intervallen von UV-Licht ausgesetzt.
- Die behandelten Fliegen auf frische Lebensmittel in eine Fliege Phiole gefüllt. Stellen Sie sicher, dass der Klebstoff Fleck auf der Fliegen Thorax nicht an den Wänden der Ampulle die Fallen der Fliege kleben.
- Der Farbstoff muss ein paar Stunden, um das Ziel Neuron erreichen. Es bewegt sich entlang der Membran, nicht in das Cytosol da Lipid löslich ist. Wir behandeln die Tiere in den Nachmittag und lassen Sie sie über Nacht.
- Patch-Clamp-Experimente durchgeführt werden am folgenden Tag. Die Neuronen werden weniger sichtbar als die Verwendung von gentechnisch exprimiert GFP verglichen.
4. Vorbereitung der Enzyme Pipette, die zur Reinigung verwendet wird
Es ist wichtig, einen stetigen Fluss von Kochsalzlösung durch die Aufnahme Kammer sicherzustellen. Mit den Badvolumen Aufstieg und Fall muss vermieden werden, da es Vibrationen verursacht und Offset möglichen Veränderungen während der Experimente werden. Perfusion und Absaugung müssen entsprechend eingestellt werden. Dies macht den Austausch Lösung wesentlich einfacher, was wiederum zur schnellen Auswaschen der Protease vor dem Experiment und raschen Austausch von pharmakologischen Mitteln während des Experiments wichtig.
- Versichern Perfusion der Ableitkammer (Strömungsgeschwindigkeit bei etwa 2 ml pro min). Flussrate kann entweder durch einen Hahn oder durch Verwendung bestimmter Durchmesser Schläuche (je größer der Durchmesser, desto größer die Strömungsrate) reguliert werden. Haben das Volumen der Kammer so klein wie möglich, um einen schnellen Austausch der Lösung in th garantierene Kammer. Dies gewährleistet eine schnelle Entfernung von Protease und Blocker aus der Aufnahme Kammer.
- Das Volumen der Kammer davon abhängt, wie die Saline-out (Abbildung 1) des Perfusionssystem in die Aufnahmekammer (wenn das Wasser Immersionsobjektiv in das Bad gesenkt wird) eingesetzt ist.
- Stellen Sie sicher, dass die Kochsalzlösung in einer Weise, dass das der Titer der Aufnahme Kammer nicht steigen und fallen ständig (Saug-, Aufstieg, Absaugung, Anstieg) positioniert ist, sondern bleibt konstant (steady Sog). Wir bestimmen ruhigen und stabilen Perfusion durch die Konstante, nie unterbrochen Gurgeln, die durch Saugen ständig Kochsalzlösung aus der Wanne hergestellt ist.
- Als Kochsalzlösung-in und-out nutzen wir Injektionsnadeln, die gebogen und an engen Rohren und platziert in der Nähe der Aufnahme Kammer mit Plastilin (1F).
- Ziehen Sie einen Patch-Pipette und brechen die Spitze ein wenig unter visueller Kontrolle. Verwenden feinen sauberen Pinzette. Bei der Visualisierung der Pipette under die 40x Wasser Immersionslinse die Pipettenspitze Durchmesser sollte etwa zwischen 40 und 70% der Zelle soma Durchmesser. Sehr große Spitzen (etwa Zelldurchmesser oder größer) kann auch verwendet werden, jedoch erhöht sich die Wahrscheinlichkeit eines Abreißen den Zellkörper aufgrund der Kapillarkräfte der Pipette. Wird die Pipette sehr klein (weniger als 10% der soma Durchmesser), verstopft es leicht das ergibt mit einer oder mehreren frischen Pipette (n) während der Reinigung verwenden.
- Füllen Sie die Pipette mit 2% Protease in PBS-Puffer oder Kochsalzlösung, ohne zu verstopfen sie.
- Legen Sie die Enzympipetten in den Elektrodenhalter. Um eine ordnungsgemäße Steuerung des ausgeübten Drucks zu gewährleisten, muss der Halter dicht verschlossen sein.
- Bringen Sie einen Schlauch mit dem kleinen Auslauf auf dem Pipettenhalter und sichern Sie sie in einer Weise, dass zerrte an das freie Ende des Schlauchs hat keinen Einfluss auf die Pipette, dass wurde in den Pipettenhalter eingefügt. Prüfen Sie, ob die Bewegung unter dem Mikroskop.
- Legen Sie entweder eine plastische p ipette Spitze (die Art, die mit einer automatischen Pipette verwendet wird, nutzen wir die blau 1000 ul sind, aber das ist eine Frage des Geschmacks. Andere Größen sowie verwendet werden kann) oder eine Spritze mit einem Hahn in das freie Ende des Schlauches zu können positiven und negativen Druck an die Enzym / Patchpipette anzuwenden. Positiver Druck wird entweder durch Einblasen in der Pipettenspitze (Verwendung als Mundstück) oder indem Sie die Spritze aufgetragen. Unterdruck abgesaugt (mit dem Mund über das Mundstück) oder durch Herausziehen der Spritze aufgetragen.
- Der Zweck der positiven und negativen Druck Anwendungen ist zum Lösen und Entfernen von Zellen und Trümmer die Zellen umgebende untersucht. Positiver Druck wird das Enzym aus der Reinigung Pipette ausgeworfen und blasen Schmutz von der Oberfläche des ZNS. Unterdruck wird verwendet, um Schmutz aus dem VNC (wie ein Staubsauger) zu saugen.
5. Reinigung von GFP-markierten MN5 (Abbildung 3 und Video)
Inhalt "> Hinweis für den Leser: Bilder von MN5 vor und nach der Reinigung nur schwer in Abbildung 3 zu unterscheiden Dies ist, was Sie im realen Leben zu erhalten Es wird eine Ausbildung zu ergreifen, um zu lernen, die feinen Unterschiede zwischen gereinigt und ungereinigt unterscheiden.. Neuronen. Bitte beachten Sie, dass diese feinen Unterschiede besser in bewegten Bildern zu sehen. Daher bietet der Film einen besseren Eindruck als die statischen Bilder (Abbildung 3).- Visualisieren Sie das Enzym gefüllten Pipette unter dem 40x Wasser Eintauchen Objektiv mit hellem Licht (3B, weißer Pfeil).
- Konzentrieren Sie sich auf der Pipettenspitze. Wenn es verstopft ist, versuchen, den Filter zu erhalten durch Anlegen positiver oder negativer Druck. Wenn der Schmutz nicht austritt, bereiten ein neues Enzym aufgefüllt Pipette.
- Schalten von Leuchtstofflampen (Abbildung 3A).
- Senken des Enzyms Pipette vorsichtig und neu zu fokussieren, bis die Zelle Körpers gesehen werden kann.
- Wenn das Enzym Pipette ist nahe demZellkörper, schalten Sie die Durchblutung ab.
- Anwenden Überdruck in kurzen Stößen in Richtung der Zellkörper so dass alles, was behindern Zugriff auf die Zelle gelöst wird. Dies hat zu tun, bis das Gewebe rund um den Zellkörper löst.
- Auch bewegen Enzympipetten dorsal lockere Ablagerungen, die ein Überbleibsel sein kann aus der Ganglien Hülle, die VNC umgibt fangen. Es kann bereits entfernt worden sind von der Dissektion vor der Montage der Zubereitung auf das Mikroskop (dies ist nicht immer der Fall ist).
- Mit wechselnder Anwendung von positivem und negativem Druck, verwenden Sie die Enzympipetten wie ein Staubsauger und Vakuum um den Zellkörper. Es ist nicht notwendig, die gesamte Zelle Körper vollständig lösen. Reinigen der vordere Teil des Soma tun wird (oder die hinteren oder seitlichen Teil abhängig von welcher Seite die Pipette nähert Soma).
- Dieser Reinigungsvorgang erfolgt, bis die Membran aussieht frei von Rückständen.
- Die membrane ist sauber, wenn es keine "Schatten" oder diffuse Kontrast zwischen Zelle und des umgebenden Gewebes, wenn mit fluoreszierendem Licht nur eingesehen werden. Dies kann am besten mit hoher Intensität blaues Licht gesehen werden. Daher erhöhen Lichtintensität für einen Moment (entfernen wir die Neutralfilter dies zu erreichen). Beachten Sie, dass umfangreiche blaues Licht Exposition durch eine regelmäßige HBO 100 Quecksilberkugel vorgesehene Foto Schäden innerhalb von etwa einer Minute führen. Dies wird in der GFP-Signal zu verblassen, wenn die Zellen sterben führen.
- Schalten Sie auf helles Licht und Entfernen von Zellen und Trümmer, die nicht mit fluoreszierendem Licht gesehen werden konnten. Man beachte, dass Visualisierung Luftröhre und Reinigungsstatus aus Umschalten zwischen hellem Licht und Fluoreszenzlicht profitieren.
- Wenn der Reinigungsvorgang abgeschlossen ist und die Zelle Körper scheint sauber, schalten Sie die Perfusion System wieder auf (das auch tun, wenn der Reinigungsvorgang dauert länger als 3 bis 5 min und weiter Reinigung mit stetigen Perfusion) und das Licht ausgeschaltet.
- Spülen Sie die Zelle for ~ 15 bis 20 min mit Salzlösung oder der Lösung, die für die folgende Anwendung verwendet wird. Nicht weniger als 40 ml sollte durch die Aufnahme Kammer gehen, um sicher sein, dass die Protease ausgewaschen wird. Protease Überreste auf der Zelloberfläche wird plötzlichen Zelltod während ansonsten stabilen Patch Clamp Messungen verursachen.
6. Elektrophysiologie
- Konventionelle In-situ Ganzzell Patch-Clamp in Spannungsklammer und Stromklemme Modus durchgeführt wird mit Hilfe eines Axopatch 200B Verstärkers (Molecular Devices, USA);-Signale werden mit einer Digidata 1320 (Molecular Devices, USA) analysiert und mit 10,2 pClamp Software.
- Patch-Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren mit einer vertikalen Pipette Abzieher (Narishige, PC-10) gezogen.
- Pipettenspitze Widerstände sind zwischen 5,8 und 6,2 MOhm (Stromzange und Kalium aktuellen Aufnahmen) und zwischen 2,8 und 3,5 MOhm (für Calcium aktuelle Aufnahmen) bzw.. Tipp Widerstand hängtintra-und extrazellulären Lösungen verwendet (für Details 13, 14 zu sehen).
7. Repräsentative Ergebnisse
Nach dem Reinigungsvorgang sowohl MN5 bereit sind für die in situ Ganzzell Patch-Clamp (Abbildung 3). Der folgende Abschnitt zeigt repräsentative Voltage-Clamp und Stromzange Spuren ab MN5 soma nach der Verwendung der beschriebenen Reinigungsverfahren aufgezeichnet. MN5 drückt eine Vielzahl von spannungsgesteuerten Ionenkanälen (siehe auch 13,14). Wir zeigen ein Beispiel der spannungsgesteuerten Calcium Ströme (Abbildung 4), Spannung Kaliumkanal Ströme (Abbildung 5) und Aktionspotential Spuren (Abbildung 6). Spannungsgesteuerten Calcium und Kalium-Ströme wurden durch ähnliche Spannung Protokolle hervorgerufen, aber die Lösungen, die verwendet wurden unterscheiden sich damit nur die Ionenkanäle untersucht den aktuellen Pass (für Details siehe 13,14). Alle anderen großen spannungsgesteuerten Ionen channels gesperrt wurden (der Natriumkanäle mit 100 nM tetrototoxin - direkt in das Bad pipettiert; die Perfusion wurde für zwei Minuten gestoppt - Calciumkanäle mit 500 uM cadmiumchloride, Kaliumkanäle mit 2 mM 4-Aminopyridin (4-AP) und 30 mM tetraethylammoniumchloride extrazellulär und 0,5 mM 4-AP, 20 mM und 144 mM tetraethylammoniumbromide cesiumchloride intrazellulär über die intrazelluläre Patch Lösung in der Patch-Pipette (für Details siehe 13,14). Aktionspotential Spuren wurden durch Strominjektion in die MN5 Soma (Abbildung evozierten 6) ohne Verwendung irgendwelcher Ionenkanalblocker 12.
Abbildung 1. Die Reinigungs-Setup. Die Fliege ist in einem Sylgard beschichteten Deckel eines 35 mm Petrischale merken, in denen wir geklebt einen Kunststoffring (Innendurchmesser 9 mm, 1,3 mm dick) with Petrolatum (A, B). Nach Eintauchen des fly in Kochsalzlösung (C) wird entlang der dorsalen Mittellinie eröffnet. Darm und Speiseröhre werden entfernt, um die Bauchmark (D) freizulegen. Für eine bessere Zugänglichkeit der Brust Neuromer der Kopf entfernt wird (E). Nach der Montage der Zubereitung auf einer aufrechten Epifluoreszenzmikroskop werden das Perfusionssystem (F, G, Sole-in, Salzlösung-out, weiße Pfeile auf der linken Seite) sowie der Massedraht in Position gebracht (F, G, weißen Pfeil rechts). Das Enzym gefüllten Reinigungs-Pipette in die Position, nachdem das Wasser Immersionsobjektiv (40x, NA 0,8) wurde in das Bad (H) abgesenkt gebracht. Aus Gründen der Klarheit zeigen wir es schon vor dem Ziel abgesenkt wurde (F, G, weißen Pfeil auf der rechten Seite). Der Winkel, in dem das Enzym Pipette, die durch einen 1-HL-U Elektrodenhalter (J) gehaltene in das Aufzeichnungs Kammer ist wichtig, da die Pipette nicht berühren muss sowohl das Ziel und den Kunststoffring. Dieser Winkel ist von Setup, um das Setup. Hier ist es etwa 30 ° (siehe Zeichnung in J, Pfeil in K). Die Anordnung der Pipette in der Halterung, die an einen Headstage angebracht wird, wird in (L) dargestellt. Die Headstage auf einem motorisierten Mikromanipulator befestigt. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 2. MN5 im Bauchmark. MN5 kann leicht durch ihre Lage in den Drosophila Bauchmark (VNC) identifiziert werden, wenn GFP genetisch modifiziert wird durch die Verwendung von spezifischen Motoneuron GAL4-Treiber (A) ausgedrückt. Die gestrichelte Rechteck zeigt die Brustwirbelsäule Neuromer. Um eine Vorstellung davon, wie die Größen zueinander in Beziehung stehen zu bekommen, zeigen wir eine Reinigung Patchpipette nähert sich dem linken MN5 von der linken Seite des dorsolongitudinal Flugmuskel. Zur besseren Veranschaulichung wurde das Patch-Pipette mit einem roten Farbstoff (Dextran-Tetramethylrhodamin, A) gefüllt. Die kontralateralenerally vorspringenden MN5 auf der dorsalen Fläche des mesothorakalen Neuromer des VNC auf jeder Seite der Mittellinie (Projektionsansicht einer konfokalen Bildstapels in B) befindet. Die ipsilateral Projektion MN1-4 sind mehrere seitlich und befindet sich nach vorne, um MN5 (Pfeile in B) zusammen. Die gestrichelten Kreis zwischen den beiden MN5 zeigt die Dendriten der Flug Motoneuronen im Neuropil einschließlich MN5 (B). GFP Etikett in (B) wurde durch immunhistochemische Färbung mit einem Antikörper gegen GFP verbessert. Einzelheiten MN5 Morphologie sichtbar gemacht werden durch Füllen des Neurons intrazellulär (iontophoretisch) mit der unsichtbaren Tracer neurobiotin und anschließende konfokalen Bildaufnahme (C). Färbung sichtbar gemacht mit Streptavidin gekoppelt an ein Fluorophor. Maßstab ist 30 um.
Abbildung 3. MN5 vor und nach der Reinigung. Visualisierung MN5 durch Expression von GFP mit der UAS/GAL4 erreichtSystem (A, C, siehe Etikett). MN5 vor (A, B) und nach (C, D) der Reinigungsvorgang. Linken Seite jedes Bild stellt anterior, stellt rechten Seite posterior. Neuronen aus aufzuzeichnen sind mit einer Protease gefüllt Patchpipette mit gebrochenem Spitze gereinigt. Das Enzym Pipette ist nur schwach sichtbar (A, B, siehe Etikett). Einschub in A zeigt eine Vergrößerung des unteren MN5 mit dem Enzym Pipette Anfahren der Zelle. MN5 kann nicht bei hellem Licht vor der Reinigungsprozedur (B) ersichtlich ist. Trachea entfernt werden müssen, wenn sie die zu untersuchenden Zellen zu decken. Nach der Reinigung ist der Kontrast zwischen der Zelle und des umgebenden Gewebes mehr knackig (C, unten MN5), und die Zelle kann nun in hellem Licht (D) gesehen werden. Die Pipettenspitze deutlicher, wenn helles Licht verwendet wird gesehen werden. Die Erweiterung zeigt den Bereich, in dem gepunkteten Platz mit MN5 Zellkörper Grenzen mit einer gestrichelten Linie zur besseren Identifizierung umgeben. Visualisierung in helles Licht hilft oft Urteil Sauberkeit.
Abbildung 4. Calcium Strom in MN5. Beispiel Aufzeichnung der ganzen Zelle Calcium Ströme ab MN5 aufgezeichnet. Mindestens zwei verschiedene Calcium-Ströme werden gezeigt, eine niedrige Spannung aktiviert transiente Kalzium und eine anhaltend hohe Spannung Calcium Strom. Die Ströme wurden von einem Haltepotential von -90 mV hervorgerufen. Spannungsschritte von -90 mV bis +20 mV wurden angewendet. Blocker wurden verwendet, um die meisten anderen Ionenkanäle blockieren. Artefakte wurden weggelassen (zur Charakterisierung von MN5 Calcium Ströme zu sehen Ryglewski et al., 2012).
Abbildung 5. Kalium Ströme in MN5. Beispiel Aufzeichnung von Ganzzellen Kaliumströme ab MN5 aufgezeichnet. Ströme dargestellt sind Calcium aktivierten Kalium-Ströme keine Calcium-Kanal-Blocker angewendet wurden. Die Ströme wurden aus einem Betrieb hervorgerufenPotential von -90 mV für das Gesamtgewicht Kaliumstrom (A) oder von einem Haltepotential von -20 mV bis transiente Kaliumströme inaktivieren und zeigen nur die anhaltende Kaliumstrom (B). Spannungsschritte von -90 mV bis +20 mV in 10 mV-Schritten aufgebracht. Offline Subtraktion Kaliumströme wie von einem Haltepotential von -90 mV (A) und -20 mV (B) zeigen rein transienten Kalium Ströme (C) hervorgerufen wird. Spannung Natriumkanäle blockiert wurden. Artefakte wurden weggelassen (zur Charakterisierung von MN5 Spannung und Calcium Kalium-Ströme zu sehen Ryglewski und Duch, 2009).
Abbildung 6. Firing Muster ausgestellt von MN5. Beispiel die Aufnahme des Brennens Muster als hervorgerufen in MN5 durch somatische Strominjektionen (0,4 nA, schwarz, 0,5 nA, grau) von 200 ms Dauer. Ruhemembranpotential war -59 mV. Keine Ionenkanalblockern wurden verwendet. (Für Strom-Clamp-Analyse des MN5 BrennenMuster zu sehen Duch et al., 2008).
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Discussion
Wenn die Visualisierung der Zellen, die mit fluoreszierenden Proteinen wie GFP, ist es wichtig, nicht zu stark freizulegen die Herstellung zu viel Licht. Dies kann im Foto führen. Wir verwenden 100W HBO Kurzbogen Quecksilberbirnen für die Beleuchtung, und nutzen wir auch neutrale Dichte (ND) von 0,8 (Chroma ND-Filter 0,3 und 0,5). Um die Qualität des Reinigungsprozesses gute Sichtbarkeit beurteilen ist entscheidend. Daher kann ND-Filter für kurze Zeiträume von etwa 20 s für mehrere Male entfernt werden.
Bei der Anwendung einige positive Druck, der Zellkörper "Klappen" ein wenig. Dies hilft die Beurteilung der Qualität der Sauberkeit. In der Bauchmark Kontrast ist sehr niedrig, und die Bewegung kann sehr hilfreich sein, um Zellen zu visualisieren. Der Elektrodenhalter, die für die Reinigung Verfahren verwendet wird (und auch für Patch-Clamp) muss dicht verschlossen sein, sonst kontrolliert Druck Anwendung wird nicht möglich sein. Verlieren Druck stört erfolgreichen Entfernung von Gewebe-und debris und verhindert Giga-Dichtung Bildung
Bei in situ-Patch-Clamp-Aufnahmen nach dem Reinigen der Zelle durchgeführt werden soll, sich bewusst sein, dass es nicht nur eine Hülle umgebenden Bauchmark als Ganzes (was auf privatem Patch-Clamp-Aufnahme nach einem der zentralen Neuron der erwachsenen Fliegen entfernt werden ), aber Zellen selbst kann von einem Mantel umgeben ist als gut. MN5, wird beispielsweise durch eine nicht-zelluläre Hülle, die nur mit kurzen hochintensive Beleuchtung gesehen werden kann, umgeben. Darüber hinaus können Zellen unterhalb der Luftröhre angeordnet sein. Im Falle der Zelle nicht zugegriffen werden kann, müssen die Luftröhre beiseite gezogen werden, wenn er nicht mit der Pipette während der Reinigung Verfahren (nachdem sie beiseite gezogen) gerissen. Das gesamte Reinigungsvorgang muss ohne Ziehen des Gewebes zu viel getan werden. Dieses Verfahren erfordert Training. Je besser die Reinigung, wird, je höher die Frequenz der unmittelbaren Giga-Dichtungen (innerhalb von 1 s nach dem Berühren der Zelle und sein relLockerung der positive Druck).
Je nach der Reinigung Protokoll und der Bruch-in die folgenden Szenarien sind möglich: Erstens, wenn die Zellen nicht gereinigt wurden gut genug, ist eine Giga-Dichtung nicht möglich und das Experiment abgebrochen werden muss. Zweiten, in einigen Fällen Reinigung ist gut genug für Giga-Dichtung Bildung sondern ein dünnes, kaum sichtbare Rest des Mantels verbleibt um das Soma. Dadurch wird die Membran zu zerreißen und verursachen Kriechströme verschiedener Amplituden. Eine weniger schwere Folge unzureichender Zelle Reinigung ist, dass einige Reste des Mantels Ursache beim Zugang Widerstand erhöht. Abhängig von den experimentellen Designs unterschiedliche Qualitätskriterien für den Patch angewendet werden könnte. Zum Überwachen Aktionspotential Mustern in Stromklemme das Membranpotential der Zelle muss gesund (-55 mV oder mehr hyperpolarisierten bei MN5) aber zugänglich Widerstand nicht so wichtiges Thema. Allerdings, wenn evoziert Aktionspotentiale durch Strominjektion Zugang reWiderstand ein Problem wird. Zum Hervorrufen großer Amplitude Kaliumströme die nahe an der Aufnahme Ort das Leck sollte klein (im Fall von MN5 Eingangswiderstand Mostes durch höher als 80 MOhm) und Zugangswiderstand sollte nicht größer als 15 MOhm stammen. Für den Raum Klemme, die in Spannungsklammer Aufnahmen von geringer Amplitude dendritischen Calcium Ströme, die zu durchaus einigem Abstand vom Soma stammen kein Leck eingeführt werden kann (MN5 Eingangswiderstand muss oberhalb 120 MOhm sein) und Zugang Widerstand nicht höher sein als 12 benötigt wird MOhm. In den meisten Aufnahmen messen wir Calcium Ströme mit Zugang Widerstände zwischen 8 und 10 M (wie aus dem Einstellrad auf der Axopatch 200B Verstärkers nach Vorwiderstand und ganze Zelle Kapazität Entschädigung lesen). Für jeden Zelltyp aufgezeichnet werden soll, muss eine solche Qualitätskriterien individuell bestimmt werden.
Mit der Reinigung hier beschriebenen Vorgehensweise können wir halten die Aufnahmen stabil NäherungTely 90 Minuten. Wir beobachten nicht erhebliche run-down (speziell für CAV2 und CAV3 Calcium Ströme und Shaker, Shal und verzögerten Gleichrichter Kalium-Ströme getestet). Allerdings haben wir nicht versucht, den Patch mehr halten und kann daher nicht sagen, ob längere Aufnahmen möglich wäre.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 | |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 | |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 | |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 | |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT | |
| ND filter set (unmounted) | Chroma Technology Corp. | 22000b series | |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
References
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