הכנה Published: October 15, 2012 doi: 10.3791/4264

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Stefanie Ryglewski¹, Carsten Duch¹

¹School of Life Sciences, Arizona State University

Summary

בתיקון אתר הקלטות מהדקות משמשות לאפיון אלקטרו של הנוירונים במעגלים ללא פגע. בדרוזופילה הגנטית מודל התיקון Clamping קשה בגלל מערכת העצבים המרכזיים היא קטנה ומוקף בנדן איתן. מאמר זה מתאר את ההליך כדי להסיר את הנדן ונקי נוירונים להקלטות מהדקות תיקון לאחר מכן.

Abstract

זמני דור קצרים וטכניקות גנטיות שטחיות להפוך זבוב דרוזופילה melanogaster מודל גנטי מצוין במחקר מדעי המוח יסודי. תעלות יונים הן בסיס לכל ההתנהגות שכן הם לתווך רגישות עצבית. הערוץ הראשון המתח מגודר היון המשובט היה ערוץ תסיסנית המתח המגודר אשלגן אכר ^1,2. לקראת הבנת תפקידו של תעלות יונים ורגישות הממברנה לתפקוד מערכת עצבים כדאי לשלב כלים גנטיים רבים עצמה זמינות בדרוזופילה בהקלטות עם מהדק תיקון באתרו. במשך שנים רבות הקלטות כאלה כבר הקשו על ידי הגודל הקטן של מערכת העצבים המרכזיים תסיסנית. יתר על כן, נדן חזק עשוי גליה וקולגן היווה מכשולים לגישת פיפטה תיקון לנוירונים מרכזיים. הסרת מעטה זו היא תנאי הכרחי להקלטות מהדקות תיקון מכל תא עצב במערכת עצבים מרכזיים תסיסנית הבוגרת. בשנים האחרונותמדענים הצליחו לבצע בהקלטות מהדקות תיקון באתרו מתא העצב במוח הבוגר ^3,4 וחוט עצב גחון של עוברי ^5,6, זחל ^7,8,9,10, ומבוגר תסיסנית ^11,12,13,14. יציב גיגה חותם הוא התנאי העיקרי לתיקון טוב ותלוי במגע נקי של פיפטה התיקון עם קרום התא, כדי למנוע דליפת זרמים. לכן, לכל תא בהקלטות מהדקות תיקון באתרו מתאי עצב בוגרים תסיסנית יש לנקות ביסודיות. בשלב הראשון, את נדן ganglionic יש להתייחס enzymatically ומכאני הוסר כדי להפוך את תאי היעד נגישים. בשלב השני, קרום התא חייב להיות מלוטש כך שאין שכבה של גליה, קולגן או חומר אחר עלולה להפריע היווצרות גיגה חותם. מאמר זה מתאר כיצד להכין נוירון המרכזי זיהה את כבל תסיסנית גחון העצב, טיסת 5 motoneuron (MN5 ^15), לסומטי השלם גהקלטות מהדקות תיקון טו. זיהוי ונראות של נוירון מושג על ידי ביטוי ממוקד של ה-GFP בMN5. אנחנו לא שואפים להסביר את טכניקת מהדק התיקון עצמו.

Protocol

התיאור הבא הוא לא ספציפי לmotoneuron אחד. ניתן להשתמש בו עם כל עצב. בדוגמה זו, אנו משתמשים טיסת motoneuron 5 (MN5) שinnervates שני הסיבים של שריר dorsalmost depressor אגף dorsolongitudinal (DLM). כדי לזהות ולדמיין MN5 אנו משתמשים במערכת UAS/GAL4 להביע GFP בתאי עצב אחראי הטיסה (וכמה נוירונים אחרים).

1. נתיחה של המבוגרים תסיסנית לניגשת לחלק הגבי של צינור העצבים הגחוני (VNC)

1. לנתח צד הגבה מבוגר תסיסנית לאורך קו האמצע הגבה בצלחת פטרי מצופית sylgard (35 מ"מ קוטר), כמתואר בRyglewski והולנדי (2009 ^13). סרט של נתיחה זה זמין באינטרנט באמצעות יופיטר (Boerner וGodenschwege ^16. להלן תיאור קצר של הנתיחה.
2. זבובים בוגרים שהם מורדמים על ידי קירור על קרח לכ 1 דקות. זו יכולה להיות מושגת על ידי זבוב בקבוקון ריק מראש קירור (ללא מזון)על קרח והצבת הזבוב בבקבוקון כבר הקר. כנפיים ורגליים יוסרו עם זוג מספרי.
3. אז לטוס הצמיד צד הגבה בצלחת פטרי מצופית sylgard (אנו משתמשים המכסה של צלחת פטרי 35 מ"מ מלא עד השפה עם sylgard; איורים 1 א ', ב') עם טבעת פלסטיק (קוטר פנימי 9 מ"מ, 1.3 מ"מ עובי ) דבוק לsylgard עם וזלין.
4. השימוש במכסה של צלחת פטרי 35 מ"מ מאפשר נגישות לVNC עם פיפטה תיקון תחת הדמיה עם עדשת מי טבילה. זה עוזר להציג את פיפטה שטחית בלי לגעת בקיר של המנה.
5. טבעת הפלסטיק יכולה להתבצע על ידי קידוח חור ל( אנו משתמשים מ"מ עובי 1.3) יריעת פלסטיק דקה. אנו משתמשים במספרי תיל כדי להגדיר את ההיקף החיצוני של הטבעת כדי שיתאים את המנה.
6. הצף את הזבוב במלח רגיל (האיור 1C; הרכב של מלח במ"מ: NaCl 128, KCl 2, CaCl ₂ 1.8, MgCl ₂ 4, 5 HEPES, סוכרוז ~ 35 depending על osmolality של הפתרון; החומציות מותאמת ל7.25 עם M NaOH 1, osmolality מותאם ל 290 mOsM עם סוכרוז).
7. החיה גזורה לאורך קו אמצע הגב, ואת שרירי התעופה הגדולים גב האורך נמתחים לרוחב והצמידו לחשוף בטן, בושט ובמתחת VNC. לאחר הסרת המעי והוושט, VNC חשוף (1D איור).
8. לחלופין, ניתן לטוס ערוף בשלב זה (האיור 1E). הסרת הראש הופכת את הגישה עם האנזים וpipettes תיקון יותר נוחה, וMN5 הדנדריטים לא מופרעים בעת ניקוי סומה (הדנדריטים הם אחוריים לסומה, האיורים 2B, C). עם זאת, הראש יכול להיות גם נותר בשלמותו אם נדרש על ידי תכנון הניסוי (למשל לומד מיורד קלט לתאי עצב אחראי בית חזה). במקרה זה ניתן פיפטה הציגה מ(, איור לרוחב 2A) אחורי או לרוחב.
9. עבור מהירחילופים מלוחים במהלך ניסויי נפח תא ההקלטה ממוזער על ידי נחת טבעת פלסטיק (9 מ"מ קוטר הפנימי) ליד בעל החיים והדבקתו המבותרים למאכל עם וזלין (איורים 1 א ', ב'; נפח תא הקלטה הוא ~ 200 μl) .
10. אז ההכנה היא רכוב על מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף קבוע במה (אנו משתמשים Zeiss Axioskop 2 FS תוספת, Zeiss, גרמניה) וצפי עם NA גבוה (> 0.75), מרחק עבודה ארוך (> 2 מ"מ), שמטרת טבילת מי 40X. מערכת זלוף (מלוח ב, מלוח החוצה), חוט הקרקע ופיפטה האנזים מוכנס לתוך תא ההקלטה (התרשימים 1F - J, L).

2. ויזואליזציה של MN5 (ראה איורים 2 ו 3), ראש כבוי

1. הר צלחת פטרי במיקרוסקופ epifluorescent שלב זקוף קבוע.
2. מקם את הצלחת עם הזבוב, כך שהחלק הקדמי פונה לצד שבו מחזיק האלקטרודה הוארכוב (איור 1).
3. השתמש בהגדלה גדולה (40X ומעלה), עדשת מי טבילה גבוהה NA (NA 0.75 או גבוה יותר) וה-GFP מסנן להאיר VNC. להדמיה טובה של התא במהלך ניקוי אנו משתמשים במי 40X טבילת עדשות עם NA של או 0.8 (אולימפוס LUMPlanFl 40xW), או NA של 0.75 (Zeiss W N-Achroplan 40x/0.8 M27). לגישה טובה עם פיפטה תיקון מרחק העבודה צריך להיות 2 מ"מ או גדול יותר.
4. שניהם MN5 נמצאים בneuromere mesothoracic על פני השטח הגבי של גנגליון הקרוב לקו האמצע בין - ואולי מכוסה בחלקה על ידי - קנה הנשימה בולט (איורים 2 ו 3). MN5 עם הדנדריטים שלהם מופיע כשטח ירוק מפוזר. Somata להיות ברור יותר לאחר הניקוי. עם זאת, הדנדריטים שלהם לא יופיעו חדים אבל נשארו מטושטש עקב עדיין מכוסה על ידי רקמה (2A דמויות, ב ').
5. בהגדרה שלנו אנו משתמשים במקור אור פלואורסצנטי 100 HBO שבו אנחנו לא יכולים modify עוצמת תפוקת האור. אנו משתמשים במסנני צפיפות ניטראליים כדי להימנע מחשיפת יתר של הרקמות לאור ניאון יותר מדי, במיוחד אור כחול. זה עלול לגרום לניזק תמונה וסופו של דבר להרוג את התאים. אנו משתמשים בצפיפות ניטראלית של 0.8. אין הלבנה צריכה להתרחש במהלך תהליך הניקוי. אם הלבנה מתרחשת, ככל הנראה תפוקת האור חזקה מדי. תא ניזוק תמונה.
6. אם תאורת LED משמשת את הגדרות העצמה תצטרכנה להיקבע על ידי הנסיין. הלבנה היא סימן לניזקי שמש ויש להימנע.

3. שיטה אלטרנטיבית וליזואליזציה של MN5

עבור היישום שלנו חשוב לי התא מסומן, למשל בביטוי ממוקד של ה-GFP. לחלופין, DiI, לצבוע lipophilic, ניתן להשתמש retrogradely לתייג נוירון זה. במקרה זה גבישי צבע מוכנסים לתוך שריר הטיסה באמצעות סיכת minutien חרקים, והפצע נסגר באמצעות Uדבק הריפוי V.

1. הפוך פתרון מניית DiI ידי המסה כמה גבישי DiI (לא סכום ספציפי) באתנול 70% 100 μl. פתרון זה יכול להיות כל זמן ב -20 ° C עד שימוש למעלה. חזרה הקפאה להפשרה היא לא בעיה.
2. 5 μl מהפתרון נמצאים אז pipetted על תלוש כיסוי שלא טופל. חכה עד אתנול התאדה. זה לוקח רק כמה דקות.
3. הנח זבוב בבקבוקון מראש מקורר (על ידי דבק אותו לקרח) וקריר לזמן קצר (להלן דקות 1) על קרח. הנח את הזבוב הרדים הקר על צלחת קירור מתחת stereomicroscope נתיחה.
4. מרכז הזבוב ולהחזיקו במקום, כך שזה לא יכול להיות נדחק בקלות כאשר שנעץ בה סיכת minutien.
5. השתמש בשני מלקחיים, אחד כדי להחזיק את סיכת minutien, השני להחזיק את הזבוב.
6. השתמש במלקחיים גסים להחזיק סיכת minutien חרקים ולגרד כמה DiI מתלוש הכיסוי כך שיש גביש DiI על קצה פין minutien (באמצעותאותו תלוש כיסוי ואותה נקודה על שהכיסוי יחליקו כל פעם עוזרת לקבל יותר צבע על הפין בכל פעם שההליך נעשה). הפינים לא צריכים להיות מודגשים מדי, זה יכול לכופף יותר בקלות ואז הוא קשה לשימוש.
7. ואז לנקב חור באמצע בית החזה הגבה של הזבוב עם סיכת minutien עם DiI על הקצה. שני סיבי השריר dorsalmost של שריר טיסת dorsolongitudinal (DLM, סיבי 5 ו 6 שרירים בכל צד) מעוצבבים על ידי MN5. לכן, הצבת גבישי צבע ממש באמצע של בית החזה מבטיחה כי הן MN5 תהיה בשם, משום ששני סיבי השריר 6 של DLM ייפגעו ולקבל קצת צבע.
8. הצבע צריך להיות ממוקם ישירות מתחת לציפורן. אם הצבע מוחדר עמוק מדי, זבובים עלולים להידקר או נוירונים אחרים (למשל MN1-4) אפשר לתייג גם כן.
9. זה חוזר על עצמו עד שמספיק לצבוע (זה עניין של תרגול וניסיון) מוכנס לתוך בית החזה
10. DiI אינו solub מיםle, ולכן זה לא מתמוסס בcytosol של השריר ויהיה חייב להיות "ממולא" מתחת לציפורן.
11. אז עוד סיכת minutien הוא טבל בטיפה של דבק הריפוי UV (אנחנו שמים טיפת הדבק בסירה במשקל).
12. הדבק שהוא עכשיו על קצה סיכת minutien משמש כדי לסגור את הפצע שבו גבישי הצבע הוכנסו.
13. לאחר יישום של דבק כלשהו (רק קצת כדי לסגור את הפצע, לא את כל בית החזה) אקדח UV משמש כדי לרפא את הדבק. אנחנו משתמשים בשני 10 מרווחי s של אור חשיפה לקרינת UV.
14. הזבובים שטופלו לשים על מזון טרי בבקבוקון לטוס. ודא שנקודת הדבק על בית החזה של הזבובים לא להיצמד לקירות של הבקבוקון שמלכודות זבובים.
15. הצבע צריך כמה שעות כדי להגיע לנוירון היעד. זה נוסע לאורך הקרום, לא בcytosol כן הוא מסיס שומן. אנחנו מתייחסים לבעלי החיים בשעתי אחר הצהריים, ולהשאירם לילה נגמר.
16. ניסויים מהדקים תיקון מתבצעים ביום שלמחרת. הנוירונים יהיו פחות גלויים לעין בהשוואה לשימוש של ה-GFP הביע גנטי.

4. הכנת פיפטה האנזים המשמשת לניקוי

זה חשוב כדי להבטיח זרימה קבועה של מי מלח דרך תא ההקלטה. לאחר עלייתו ונפילת נפח האמבטיה יש להימנע כפי שהיא גורמת רטט וקיזוז שינויים אפשריים במהלך ניסויים. זלוף ויניקה צריכים להיות מוגדרים בהתאם. זה עושה חילופי פתרון קלים בהרבה, אשר בתורו הוא חשוב למהיר לשטוף מתוך פרוטאז לפני הניסוי והחילופים מהירים של סוכנים תרופתיים במהלך הניסוי.

1. הבטח טפטוף של חדר ההקלטה (קצב זרימה בכ 2 מ"ל לדקה). קצב זרימה יכול להיות מוסדר על ידי שימוש זין או באמצעות Tubings קוטר הספציפי (הקוטר הגדול יותר, הגבוה יותר את קצב הזרימה). יש נפח של החדר קטן ככל האפשר כדי להבטיח חילופים מהירים של הפתרון בדואר קאמרי. זה מבטיח הסרה מהירה של פרוטאז וחוסמים מתא ההקלטה.
2. הנפח של החדר תלוי באופן מלוח החוצה (איור 1) של מערכת זלוף מוכנס לתוך תא ההקלטה (כאשר מטרת הטבילה במים שמוחדרת אל האמבטיה).
3. ודא שיצאו מלוח ממוקם באופן שכייל של חדר ההקלטה לא עולה ויורד כל זמן (יניקה, עלייה, יניקה, עלייה), אך נשאר קבוע (יניקה יציבה). אנו קובעים זלוף היציב וקבוע על ידי צליל הקבוע, אף פעם לא הפריע גרגור כי הוא מיוצר על ידי מציצה כל זמן מלוח שיצא מהאמבטיה.
4. כמלוחים ובהחוצה אנחנו משתמשים במחטים תת העור שקמטו וצורפו לTubings הצר והניחו בסמוך לחדר ההקלטה באמצעות פלסטלינה (האיור 1F).
5. משוך פיפטה תיקון ולשבור את הקצה קטן תחת בקרה חזותית. השתמש במלקחיים נקיים עדינים. כשמדמיין פיפטה under עדשת 40X הטבילה במי קוטר קצה פיפטה צריכה להיות כ בין 40% ו 70 מקוטר הסומא של התא. טיפים מאוד גדולים (כ תא קוטר או גדול) יכולים לשמש גם, לעומת זאת, הסבירות שקורע את גוף התא מגבירה עקב כוחות הנימים של פיפטה. האם פיפטה הקטנה מאוד (פחות מ 10% מקוטר סומה), זה סותם בקלות וכתוצאה מכך יש להשתמש בפיפטה טריה אחד או יותר (הים) במהלך תהליך הניקוי.
6. מלא פיפטה עם פרוטאז 2% במאגר או תמיסת מלח PBS מבלי לסתום אותו.
7. הכנס את פיפטה האנזים לתוך מחזיק האלקטרודה. כדי להבטיח בקרה נאותה של לחץ, הבעל צריך להיות אטום בחוזקה.
8. צרף צינורות לפורקן הקטן על מחזיק פיפטה ולאבטח אותו באופן שמושכים בקצה החופשי של הצינור לא משפיע פיפטה שהוכנס לתוך מחזיק פיפטה. בדקו לתנועה מתחת למיקרוסקופ.
9. הכנס או p פלסטיק ipette קצה (מהסוג המשמש בpipetter אוטומטי, אנו משתמשים ב 1000 אלה μl הכחולים, אבל זה עניין של העדפה. גדלים אחרים ניתן להשתמש גם כן) או מזרק עם זין אל הקצה החופשי של הצינור כדי להיות מסוגל להפעיל לחץ חיובי ושלילי לפיפטה אנזים / תיקון. לחץ חיובי מיושם על ידי נשיפה או לקצה פיפטה (שימוש בו כחתיכת פה) או על ידי לחיצה למטה את המזרק. לחץ שלילי מיושם על ידי שאיבה (עם הפה בעזרת חתיכת הפה) או על ידי תלישת המזרק.
10. המטרה של יישומים בלחץ החיוביים ושליליים היא לשחרר ולהסיר תאים ופסולת המקיפים את התאים תחת חקירה. לחץ חיובי יהיה להוציא מאנזים פיפטה ניקוי ולפוצץ פסולת מעל פני השטח של מערכת העצבים המרכזיים. לחץ שלילי משמש למצוץ שברי VNC (כמו שואב אבק).

5. ניקוי של ה-GFP-tagged MN5 (איור 3 ווידאו)

תוכן "> הערה לקורא: תמונות של לפני ואחרי MN5 ניקוי הן קשות להבחין באיור 3 זה מה שאתה מקבל בחיים אמיתיים זה ייקח כמה אימונים כדי ללמוד להבחין בהבדלים הדקים בין ניקה ולא ניקה-.. הנוירונים. שימו לב שההבדלים הדקים הללו ניתן לראות טובים יותר בתמונות נעות. לכן, הסרט מספק רושם טוב יותר מאשר תמונות סטטיות (איור 3).

1. דמיינו את האנזים מלא פיפטה מתחת לעדשת מי טבילת 40X עם אור בהיר (האיור 3B, חץ לבן).
2. פוקוס על קצה פיפטה. אם הוא סתום, לנסות להשיג את הלכלוך על ידי הפעלת לחץ חיובי או שלילי. אם הלכלוך לא יוצא, להכין אנזים חדש המלאים פיפטה.
3. לעבור לאור ניאון (איור 3 א).
4. מנמיך את פיפטה אנזים זהירות ולמקד מחדש עד שניתן לראות בגוף התא.
5. כאשר אנזים פיפטה היא קרובה לגוף תא, לעבור את זלוף.
6. להפעיל לחץ חיובי בפרצים קצרים לעבר גוף התא, כך שכל מה שמכביד על גישה לתא יהיה משוחרר וקליל. זה חייב להיעשות עד לרקמה שמסביב גוף התא מגיעה משוחררת.
7. גם להזיז את פיפטה האנזים dorsally לתפוס פסולת רופפת שעשויות להיות שמאל מעל מנדן ganglionic שמקיף את VNC. זה אולי הוסר כבר על ידי נתיחה שלפני ההרכבה על הכנת מיקרוסקופ (זה לא תמיד המקרה).
8. עם יישום של לסירוגין לחץ חיובי ושלילי, השתמש בפיפטה האנזים כמו שואב אבק ואבק סביב גוף התא. אין זה הכרחי כדי לשחרר את גוף התא השלם לחלוטין. ניקוי חלק הקדמי של סומה יעשה (או חלק האחורי או לרוחב בהתאם לצד מה פיפטה מתקרב הסומא).
9. הליך ניקוי זה נעשה עד הקרום נראה פנוי של פסולת.
10. Membrane הוא נקי כאשר אין "צל" או ניגוד מפוזר בין תאים ורקמות כאשר צפו עם אור ניאון בלבד. ניתן לראות זאת הכי טוב עם אור כחול בעצמה גבוה. לכן, להגדיל את עוצמת אור לרגע (שהסירו את מסנני צפיפות הניטראליות כדי להשיג את זה). שים לב שחשיפה לאור כחולה נרחבת כפי שנקבע על ידי נורת כספית רגילה 100 HBO יכולה לגרום ניזק תמונה בתוך כדקה. זה יגרום את אות ה-GFP לדעוך כתאים מתים.
11. מעבר לאור בהיר ולהסיר תאים ופסולת שלא ניתן לראות באור ניאון. שים לב להדמיה של קנה נשימה ומצב ניקיון יכול להפיק תועלת ממעבר בין האור החזק ואור ניאון.
12. כאשר הליך הניקוי נגמר וגוף התא מופיע נקי, לעבור למערכת זלוף שוב (לעשות את זה גם אם הליך הניקוי לוקח זמן רב יותר מאשר 3-5 דקות ולהמשיך לנקות עם זלוף היציב) ולכבות את האור.
13. שטוף את תא for ~ 15-20 דקות בתמיסת מלח או פתרון שישמש ליישום הבא. לא פחות מ 40 מ"ל צריך לעבור חדר ההקלטה כדי להיות בטוח שפרוטאז הוא שטף החוצה. שרידי Protease על פני התא יגרמו למוות פתאומי במהלך הקלטות תא מהדק תיקון אחרת יציבות.

6. אלקטרופיזיולוגיה

1. קונבנציונלי במהדק אתר כל תא בתיקון מהדק מתח ומצב מהדק הנוכחי מתנהל באמצעות מגבר 200B Axopatch (התקנים מולקולריים, ארה"ב); אותות הם דיגיטציה באמצעות Digidata 1320 (התקנים מולקולריים, ארה"ב) ונתחו עם 10.2 תוכנת pClamp.
2. pipettes תיקון הם משכו מורוסיליקט זכוכית נימים עם פיפטה חולץ אנכי (Narishige, מחשב-10).
3. התנגדויות קצה פיפטה הן בין 5.8 ל 6.2 MΩ (מהדק נוכחי והקלטות נוכחיות אשלגן) ובין 2.8 ו -3.5 MΩ (להקלטות סיד שוטפות) בהתאמה. התנגדות תלויה בעצהפתרוני תוך תאיים ומשמשים (לפרטים ראו ^{13, 14).}

7. נציג תוצאות

לאחר הליך הניקוי הוא MN5 מוכן למהדק אתר תא שלם תיקון (איור 3). הסעיף הבא מציג מהדק מתח נציג ועקבות מהדקות נוכחיות, כפי שנרשמו מMN5 סומה לאחר השימוש בהליך הניקוי תאר. MN5 מבטא מגוון של תעלות יונים מגודרות מתח (ראה גם ^13,14). אנחנו מראים דוגמה של זרמי מתח מגודרים סיד (איור 4), זרמי אשלגן מגודר מתח (איור 5) ועקבות פוטנציאליות פעולה (איור 6). סיד מגודר מתח וזרמי אשלגן היו עוררו על ידי פרוטוקולי מתח דומים, אבל את הפתרונים שהיו בשימוש שונה על מנת לאפשר רק את תעלות יונים תחת חקירה לעבור נוכחיות (לפרטים ראו ^13,14). כל הפרק האחר העיקרי המתח המגודר היוןannels נחסם (ערוצי מתח מגודר נתרן עם tetrototoxin nM 100 - pipetted ישירות לתוך האמבטיה; זלוף נעצר לשתי דקות - ערוצי סיד עם cadmiumchloride 500 מיקרומטר, ערוצי אשלגן עם 2 מ"מ 4-aminopyridin (4-AP) ו 30 mM tetraethylammoniumchloride mM extracellularly ו0.5 4-AP, tetraethylammoniumbromide 20 מ"מ וcesiumchloride mM 144 intracellularly דרך הפתרון התאי התיקון בפיפטה התיקון (לפרטים ראו ^13,14). עקבות פוטנציאל פעולה שעוררו בזריקה נוכחית לתוך MN5 סומה (איור 6) ללא שימוש באף אחת מחוסמי תעלות יוני ^12.

איור 1. התקנת הניקוי. לטוס מרותק במכסה מצופית sylgard של צלחת פטרי 35 מ"מ שבו אנחנו דבוקים טבעת פלסטיק (9 מ"מ קוטר פנימי, 1.3 מ"מ עובי) with זלין (A, B). לאחר הצללת הזבוב במלח (ג') הוא נפתח לאורך קו האמצע הגבה. גוט והוושט יוסרו לחשוף את עצב הגחון (ד '). נגישות טובה יותר של neuromere החזי הראש להסרתו (ה). לאחר ההרכבה על הכנת מיקרוסקופ epifluorescence זקוף, מערכת זלוף (F, G, מלוחים במלוחים החוצה, חיצים, לבנים בצד השמאל), כמו גם את חוט הקרקע מובאת לעמדה (F, G, חץ לבן על מימין). האנזים מלא ניקוי פיפטה הוא הביא אל עמדה האובייקטיבית לאחר הטבילה במים (40X, NA 0.8) הופחת לאמבטיה (H). לשם בהירות אנו מציגים אותה כבר לפני אובייקטיביים הופחת (F, G, חץ לבן בצד ימין). הזווית שבה פיפטה האנזים שמוחזקת על ידי מחזיק 1-HL-U האלקטרודה (J) היא להיכנס לחדר ההקלטה היא חשובה כמו פיפטה אסור לגעת גם האובייקטיבית וטבעת הפלסטיק. זווית זו משתנית מהגדרה להגדרה. הנה הוא כ 30 ° (ראה ציור ב-J, חץ בK). הסידור של פיפטה במחזיק בו אשר צורפה לheadstage מוצג ב( L). Headstage מצורף לmicromanipulator ממונע. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2. MN5 בצינור עצבי הגחון. MN5 ניתן לזהות בקלות על ידי מיקומו בצינור עצבי גחון דרוזופילה (VNC) כאשר GFP ביטוי גנטי על ידי השימוש בGAL4 נהגים ספציפיים motoneuron (). המלבן המקווקו מתאר neuromere החזי. כדי לקבל מושג על אופן שבו הגדלים מתייחסים זה לזה, אנו מראים פיפטה תיקון ניקוי מתקרבת MN5 השמאל מהצד השמאלי של שרירי טיסת dorsolongitudinal. להדמיה טובה יותר, פיפטה התיקון הייתה מלאה בצבע אדום (-dextran tetramethylrhodamine,). Contralaterally מקרין MN5 נמצאים על פני השטח הגבי של neuromere mesothoracic של VNC בכל צד של קו האמצע (תצוגת הקרנה של ערימת תמונת confocal בבוקר). Ipsilaterally מקרין MN1-4 נמצאים יותר רוחבי וanteriorly קשור לMN5 (חצים בבוקר). המעגל המקווקו בין שניהם MN5 מתאר הדנדריטים של תאי עצב האחראים על הטיסה בneuropil כולל MN5 (B). תווית ה-GFP ב( ב) הייתה משופר על ידי immunohistochemical מכתים עם נוגדנים כנגד ה-GFP. פרטי MN5 המורפולוגיה נעשים גלוי על ידי מילוי נוירון intracellularly (iontophoretically) עם נותב neurobiotin בלתי הנראים ורכישת תמונת confocal הבאה (C). צביעה נעשתה גלוי עם streptavidin מצמיד fluorophore. סרגל קנה מידה הוא 30 מיקרומטר.

איור 3. לפני ואחרי ניקוי MN5. יזואליזציה של MN5 מושג על ידי שימוש בביטוי של ה-GFP UAS/GAL4המערכת (A, C, ראה תווית). MN5 לפני (A, B) ואחרי (C, D) על תהליך הניקוי. צדו השמאלי של כל תמונה מייצגת קדמי, צד ימין מייצג אחורי. הנוירונים כדי להקליט ממנוקים עם פיפטה תיקון פרוטאז מלא בקצו שבור. פיפטה האנזים היא רק מעט גלויה (A, B, ראה תווית). בהבלעה מראה גדלה של MN5 תחתית עם פיפטה האנזים מתקרבת לתא. MN5 לא ניתן לראות באור בהיר לפני הליך הניקוי (ב '). קנה נשימה צריכה להסיר אם הם מכסים את התאים תחת חקירה. לאחר תהליך הניקוי, בניגוד שבין תאים ורקמות המקיפות אותו יותר פריך (C, MN5 תחתון), והתא עכשיו ניתן לראות באור בהיר (ד '). קצה פיפטה ניתן לראות בצורה ברורה יותר, כאשר אור חזק בשימוש. ההגדלה מתארת ​​את האזור בניקוד המרובע עם MN5 גבולות גוף תא מוקף בקו מקווקו לזיהוי טוב יותר. הדמיה באור בהיר לעתים קרובות עוזרת פסק דינו של ניקיון.

<כיתת p = "jove_content">
איור 4. סידן נוכחי בMN5. הקלטת דוגמה של זרמי סיד סלולרי שלמים כפי שנרשם מMN5. לפחות שני זרמי סידן שונים מוצגים, סידן נמוך מתח הופעל חולף וסיד מתח גבוה מתמשך נוכחי. זרמים שעוררו מפוטנציאל החזקת -90 mV. צעדי מתח מ-90 mV ל20 mV יושמו. חוסמים שמשו לחסימת תעלות יונים אחרות ביותר. חפצים הושמטו לבהירות (לאפיון של MN5 זרמי סיד לראות Ryglewski et al., 2012).

איור 5. זרמי אשלגן MN5. הקלטת דוגמה של זרמי אשלגן תא שלמים, כפי שנרשמו מMN5. זרמים המוצגים כוללים זרמי אשלגן הסיד הופעלו כלא חוסמי תעלות סידן יושמו. זרמים שעוררו מהחזקהפוטנציאל של -90 mV לאשלגן השוטף (א) או מפוטנציאל החזקת -20 mV להשבית זרמי אשלגן חולפים ולהציג רק את האשלגן הנוכחי המתמשך (B). צעדי מתח מ-90 mV ל20 mV יושמו בהפרשים קבועים של 10 mV. חיסור מנותק מזרמי אשלגן כעורר מפוטנציאל החזקת -90 mV () ו-20 (B) חושף זרמי אשלגן חולפים טהורים (C) mV. תעלות נתרן מגודרת מתח נחסמו. חפצים הושמטו לבהירות (לאפיון של MN5 מתח וזרמי אשלגן סיד לראות Ryglewski והולנדי, 2009).

איור 6. ירי דפוס שהפגין MN5. הקלטת דוגמה של ירי דפוסים שכהושרה בMN5 ידי זריקות נוכחיות סומטיים (0.4 Na, שחור, 0.5 Na, אפור) של 200 אלפיות משך. פוטנציאל הממברנה מנוחה היה -59 mV. אין חוסמי תעלות יונים היו בשימוש. (לניתוח הנוכחי של מהדק MN5 ירידפוסים רואים הולנדיים et al., 2008).

Discussion

כשמדמיינים את התאים עם חלבוני ניאון כמו GFP, חשוב לא מעל לחשוף את ההכנה ליותר מדי אור. זה עלול לגרום לניזק תמונה. אנו משתמשים בנורות 100W HBO קצרות קשת כספית לתאורה, ואנחנו משתמשים גם בצפיפות ניטראלית (ND) של 0.8 (מסנני ND Chroma 0.3 ו -0.5). כדי להיות מסוגל לשפוט על איכות הראות הטובה הניקוי הוא קריטי. לכן, מסנני ND ניתן להסיר לתקופות קצרות של כ 20 שניות למספר רבות של פעמים.

כשהחלים קצת לחץ חיובי, גוף התא "דשים" קטן. זה עוזר לשפוט את האיכות של ניקיון. בניגוד חוט עצב הגחון הוא נמוך מאוד, ותנועה יכולה להיות מאוד מועילה כדי להמחיש תאים. בעל האלקטרודה המשמש להליך הניקוי (וגם לתיקון clamping) צריך להיות סגור היטב; יישום לחץ נשלט אחרת לא יהיה אפשרי. Loosing לחץ יפריע הסרה מוצלחת של רקמות וdebris וימנע היווצרות גיגה חותם

במקרה בהקלטות של מהדק תיקון אתרו יבוצע לאחר ניקוי התא, להיות מודע לכך שיש לא רק נדן מקיף את עצב הגחון בכללותו (שצריך להיות מוסר לכל הקלטת מהדק תיקון של כל נוירון מרכזי של זבובים בוגרים ), אך תאים עצמם עשויים להיות מוקפים בנדן גם כן. MN5, למשל, מוקף בנדן בלתי תאי שניתן לראות רק בתאורה בעצמה גבוהה קצרה. בנוסף, תאים עשויים להיות ממוקמים מתחת לקנה הנשימה. במקרה התא לא ניתן לגשת, בקנה הנשימה צריך להיות משך הצידה אם לא תלש עם פיפטה במהלך הליך הניקוי (לאחר שהסיט הצידה). כל הליך הניקוי צריך להיעשות ללא משייכת הרקמה יותר מדי. הליך זה דורש הכשרה. הניקוי הטוב יותר, הגבוה יותר יהיה התדירות של גיגה-חותמות מיידיות (בתוך 1 שלו לאחר שנגע התא וrelהקלת לחץ חיובי).

בהתאם לפרוטוקול הניקוי ופריצת התרחישים הבאים אפשריים: ראשית, אם התאים לא ניקו מספיק טוב, גיגה חותם אינו אפשרי והניסוי חייב להיפסק. שנית, במקרים מסוימים ניקוי הוא מספיק טוב להיווצרות גיגה חותם אבל שריד דק, כמעט בלתי נראה לעין של הנדן נותר סביב סומה. זה יגרום לקרע בקרום ולגרום לזרמי דליפה של אמפליטודות שונות. תוצאה חמורה פחות מניקוי תא המספיק היא שחלק משרידי סיבת הנדן מגדיל בהתנגדות גישה. בהתאם לקריטריוני האיכות השונים הניסיוניים העיצוב לתיקון עשוי לחול. לניטור דפוסי פעולה פוטנציאליים במהדק נוכחי פוטנציאל הממברנה של התא חייב להיות בריא (-55 mV או יותר hyperpolarized במקרה של MN5), אבל התנגדות גישה היא לא נושא חשוב. עם זאת, כאשר לעורר פוטנציאל פעולה מחדש על ידי הזרקת גישה הנוכחיתsistance הופך לנושא. למעורר זרמי אשלגן משרעת גדולים שמקורם בסמוך לאתר הקלטת הדליפה צריכה להיות קטנה (במקרה של התנגדות הכניסה MN5 חייבת ידי יותר מ 80 MΩ) והתנגדות גישה לא צריכה להיות גדולה יותר מ 15 MΩ. לתפס המקום שיש צורך בהקלטות מהדק מתח של זרמי סיד הדנדריטים משרעת קטנים שמקורם בלמדי מרחק מה מן הסומא אין דליפה יכולה להיות הציגה (להתנגדות כניסת MN5 חייבת להיות מעל 120 MΩ) והתנגדות גישה לא יכולה להיות גבוהה יותר מ 12 MΩ. ברוב ההקלטות אנחנו מודדים זרמי סיד עם התנגדויות גישה בין 8 ל 10 MΩ (כפי שקרא מהחיוג במגבר 200B axopatch לאחר התנגדות סדרה ופיצוי קיבול תא כולו). לכל סוג תא שיירשם, קריטריוני איכות כאלה צריכים להיקבע באופן אינדיבידואלי.

באמצעות הליך הניקוי המתואר כאן, אנו יכולים להחזיק את ההקלטות היציבות לapproximately 90 דקות. אנחנו לא צופים ניכרים מוזנחים (נבדקנו במיוחד עבור Cav2 וCav3 זרמי סיד ולאכר, רדוד, וזרמי אשלגן rectifier מתעכבים). עם זאת, יש לנו לא ניסיתי להחזיק את התיקון ארוך יותר ולכן לא ניתן לקבוע האם הקלטות ארוכות יותר תהיינה אפשריות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease type XIV	Sigma Aldrich USA	P5147
Microfil flexible injection needle	World Precision Instruments USA	MF28G-5
Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament	World Precision Instruments USA	PG52151-4
DiI	Invitrogen USA	D3899
Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning)	www.ellsworth.com	184 SIL ELAST KIT
ND filter set (unmounted)	Chroma Technology Corp.	22000b series
Electrode holder 1-HL-U	Molecular Devices	1-HL-U