Summary
स्वस्थानी पैच में क्लैंप रिकॉर्डिंग बरकरार circuitry में न्यूरॉन्स की electrophysiological लक्षण वर्णन के लिए किया जाता है. ड्रोसोफिला आनुवंशिक मॉडल पैच clamping में मुश्किल है क्योंकि CNS छोटे और एक मजबूत म्यान से घिरा हुआ है. इस अनुच्छेद के बाद पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए म्यान और स्वच्छ न्यूरॉन्स को दूर करने के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है.
Abstract
लघु पीढ़ी समय और सतही आनुवंशिक तकनीक फल मक्खी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर मौलिक तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के क्षेत्र में एक उत्कृष्ट आनुवंशिक मॉडल बनाने के. आयन चैनलों सभी व्यवहार के आधार पर कर रहे हैं क्योंकि वे neuronal excitability मध्यस्थता. 1 वोल्टेज gated आयन क्लोन चैनल ड्रोसोफिला वोल्टेज gated पोटेशियम चैनल 1,2 शेखर था. यह तंत्रिका तंत्र समारोह के लिए आयन चैनलों और झिल्ली excitability की भूमिका को समझने की ओर ड्रोसोफिला में शक्तिशाली आनुवंशिक उपकरण उपलब्ध स्वस्थानी पैच दबाना रिकॉर्डिंग के साथ गठबंधन करने के लिए उपयोगी है. कई सालों के लिए ऐसी रिकॉर्डिंग ड्रोसोफिला सीएनएस के छोटे आकार के द्वारा बाधा उत्पन्न की. इसके अलावा, एक मजबूत glia और कोलेजन से बना म्यान पैच विंदुक केंद्रीय न्यूरॉन्स को उपयोग के लिए बाधाओं का गठन किया है. इस म्यान हटाने के वयस्क ड्रोसोफिला CNS में किसी भी न्यूरॉन से एक पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक पूर्व शर्त है. हाल के वर्षों मेंवैज्ञानिकों स्वस्थानी पैच दबाना रिकॉर्डिंग में 3,4 वयस्क मस्तिष्क और भ्रूण 5,6, 7,8,9,10, लार्वा, और वयस्क 11,12,13,14 ड्रोसोफिला के उदर तंत्रिका कॉर्ड में न्यूरॉन्स से संचालन करने में सक्षम हो गया है. एक स्थिर giga मुहर एक अच्छा पैच के लिए पूर्व शर्त है और कोशिका झिल्ली रिसाव धाराओं से बचने के साथ पैच विंदुक की साफ संपर्क पर निर्भर करता है. इसलिए, वयस्क ड्रोसोफिला न्यूरॉन्स से यथास्थल पैच दबाना रिकॉर्डिंग में पूरे सेल के लिए अच्छी तरह से साफ किया जाना चाहिए. पहले चरण में, ganglionic म्यान enzymatically इलाज किया जा है और यंत्रवत् लक्ष्य कोशिकाओं को सुलभ बनाने के लिए हटा दिया है. दूसरे चरण में, कोशिका झिल्ली को पॉलिश किया जा है कि glia कोलेजन, या अन्य सामग्री का कोई परत giga मुहर गठन में खलल पड़ सकता है. यह लेख बताता है कि कैसे ड्रोसोफिला उदरीय तंत्रिका कॉर्ड, उड़ान 5 motoneuron (15 MN5), दैहिक पूरे ग के लिए तैयार करने के लिए एक की पहचान केंद्रीय न्यूरॉनपक्ष पैच दबाना रिकॉर्डिंग. और न्यूरॉन पहचान दृश्यता MN5 में GFP की लक्षित अभिव्यक्ति द्वारा हासिल की है. हम स्वयं पैच दबाना तकनीक की व्याख्या करने के लिए लक्ष्य नहीं है.
Protocol
निम्न वर्णन एक motoneuron के लिए विशिष्ट नहीं है. यह किसी भी न्यूरॉन के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. इस उदाहरण में, हम उड़ान 5 motoneuron (MN5) कि dorsolongitudinal विंग कष्टकारक मांसपेशी (DLM) के दो dorsalmost फाइबर innervates का उपयोग करें. की पहचान करने और कल्पना MN5 हम उड़ान motoneurons (और कुछ अन्य न्यूरॉन्स) में GFP व्यक्त UAS/GAL4 प्रणाली का उपयोग करें.
1. वयस्क ड्रोसोफिला के विच्छेदन वेंट्रल तंत्रिका कॉर्ड (VNC) के पृष्ठीय भाग का उपयोग करने के लिए
- एक वयस्क ड्रोसोफिला पृष्ठीय पक्ष काटना अपनी एक sylgard लेपित पेट्री डिश में पृष्ठीय midline (35 मिमी व्यास) के साथ के रूप में Ryglewski और Duch (2009 13) में वर्णित है. इस विच्छेदन के एक फिल्म जौव (Boerner और Godenschwege 16 के माध्यम से उपलब्ध ऑनलाइन है नीचे विच्छेदन का एक संक्षिप्त विवरण है.
- वयस्क मक्खियों के बारे में 1 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा करके anesthetized हैं. यह पूर्व ठंडा एक खाली मक्खी शीशी (भोजन के बिना) के द्वारा प्राप्त किया जा सकता हैबर्फ पर पहले से ही ठंड शीशी में मक्खी रखने. पंख और पैर कैंची की एक जोड़ी के साथ हटा रहे हैं.
- मक्खी तो पृष्ठीय ओर टिकी है एक sylgard लेपित पेट्री डिश में (हम एक 35 मिमी पेट्री sylgard के साथ रिम से भरा पकवान के ढक्कन का उपयोग करें, आंकड़े 1 ए, बी) एक प्लास्टिक की अंगूठी (भीतरी व्यास 9 मिमी, 1.3 मिमी मोटी के साथ ) वेसिलीन साथ sylgard चिपके.
- एक 35 मिमी पेट्री डिश के ढक्कन के उपयोग के दृश्य के तहत एक पानी की सूई लेंस के साथ पैच विंदुक के साथ VNC के लिए उपयोग की सुविधा है. यह पकवान की दीवार को छू के बिना विंदुक उथलेपन से शुरू करने में मदद करता है.
- प्लास्टिक की अंगूठी एक पतली (हम 1.3 मिमी मोटाई का उपयोग करें) प्लास्टिक शीट में एक छेद ड्रिलिंग द्वारा बनाया जा सकता है. हम एक तार कटर का उपयोग करने के लिए अंगूठी की बाहरी परिधि को परिभाषित इतना है कि यह पकवान फिट बैठता है.
- डूब सामान्य नमक में मक्खी (चित्रा 1C, मिमी में नमक की रचना: 128 NaCl, KCl 2, 2 CACL 1.8, 2 MgCl 4, 5 HEPES, ~ 35 depe sucroseसमाधान की osmolality पर nding, पीएच 1 एम NaOH के साथ 7.25 समायोजित किया जाता है, osmolality sucrose साथ 290 mOsM निकाला जाता है).
- पृष्ठीय midline के साथ पशु dissected है, और बड़े पृष्ठीय अनुदैर्ध्य उड़ान मांसपेशियों laterally फैला रहे हैं और पेट, घेघा, और VNC नीचे का पर्दाफाश करने के लिए टिकी. पेट और घुटकी के हटाने के बाद, VNC (चित्रा 1D) संपर्क में है.
- वैकल्पिक रूप से, मक्खी इस कदम (चित्रा 1E) में decapitated जा सकता है. सिर हटाना एंजाइम और पैच pipettes के साथ पहुंच और अधिक सुविधाजनक बनाता है, और MN5 dendrites जब सोमा सफाई (dendrites सोमा के पीछे हैं, आंकड़े 2 बी, सी) परेशान नहीं हैं. हालांकि, सिर भी बरकरार रह जा सकता है अगर प्रयोगात्मक डिजाइन (उदाहरण के अवरोही वक्ष motoneurons इनपुट का अध्ययन) के लिए आवश्यक है. विंदुक पीछे या पार्श्व (पार्श्व, 2A चित्रा) से इस मामले में पेश किया जा सकता है.
- के लिए तेजी सेप्रयोगों के दौरान खारा विनिमय रिकॉर्डिंग कक्ष की मात्रा dissected जानवर और यह gluing के चारों ओर एक प्लास्टिक की अंगूठी (भीतरी व्यास 9 मिमी) रखने के साथ डिश के लिए कम से कम है वेसिलीन आंकड़े (1 ए, बी, रिकॉर्डिंग कक्ष की मात्रा ~ 200 μl है) .
- तैयारी तो एक ईमानदार निश्चित चरण प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर मुहिम शुरू की है (हम Zeiss Axioskop 2 FS प्लस, Zeiss, जर्मनी) और एक उच्च NA (0.75), लंबे समय तक काम दूरी (> 2 मिमी), 40x पानी की सूई उद्देश्य के साथ देखा. छिड़काव प्रणाली (खारा में, खारा से बाहर), जमीन तार और एंजाइम विंदुक रिकॉर्डिंग चैम्बर (- जे, एल आंकड़े 1F) में डाला जाता है.
2. MN5 की विज़ुअलाइज़ेशन (2 और 3 आंकड़े देखें), बंद सिर
- एक ईमानदार निश्चित चरण epifluorescent खुर्दबीन पर माउंट पेट्री डिश.
- इसमें मक्खी के साथ पकवान तो स्थिति यह है कि पूर्वकाल हिस्सा ओर जहां इलेक्ट्रोड धारक है चेहरेघुड़सवार (1 चित्रा).
- VNC कोरोशनी देने के लिए एक उच्च बढ़ाई (40x या अधिक), उच्च NA पानी की सूई लेंस (NA 0.75 या अधिक) और एक GFP फिल्टर का उपयोग करने के लिए. सफाई के दौरान सेल का अच्छा दृश्य के लिए हम 40x पानी का उपयोग करें या तो 0.8 के एक NA (ओलिंप LUMPlanFl 40xW), या 0.75 (Zeiss डब्ल्यू एन Achroplan M27 40x/0.8) की एक NA साथ लेंस की सूई. पैच विंदुक के साथ अच्छा उपयोग के लिए काम कर दूरी 2 मिमी या बड़ा होना चाहिए.
- और संभवतः आंशिक रूप से कवर - प्रमुख ट्रेकिआ (2 आंकड़े और 3) MN5 दोनों के बीच midline नाड़ीग्रन्थि की पृष्ठीय सतह पर mesothoracic neuromere में स्थित हैं. MN5 उनके dendrites के साथ एक फैलाना हरी क्षेत्र के रूप में दिखाई देते हैं. somata अधिक सफाई के बाद अलग हो जाते हैं. हालांकि, उनके dendrites तेज नहीं दिखाई देते हैं, लेकिन कारण उन्हें अभी भी ऊतक (आंकड़े 2A, बी) से कवर किया जा रहा है के लिए blurry रहना होगा.
- हमारे सेटअप में हम एक एचबीओ 100 प्रतिदीप्ति प्रकाश स्रोत है जो हम नहीं mod कर सकते हैं का उपयोग करेंप्रकाश उत्पादन तीव्रता ify. हम तटस्थ घनत्व फिल्टर का उपयोग करने के लिए ऊतक के बहुत ज्यादा फ्लोरोसेंट रोशनी के लिए जोखिम से बचने के लिए, विशेष रूप से नीले प्रकाश. इस तस्वीर के नुकसान होता है और अंततः कोशिकाओं को मार सकता है. हम तटस्थ घनत्व 0.8 की का उपयोग करें. सफाई की प्रक्रिया के दौरान कोई विरंजन हो जाना चाहिए. यदि विरंजन होता है, सबसे अधिक संभावना प्रकाश उत्पादन भी मजबूत है. सेल फोटो क्षतिग्रस्त है.
- यदि एलईडी रोशनी के लिए प्रयोग किया जाता है तीव्रता सेटिंग्स experimenter द्वारा निर्धारित किया जा होगा. ब्लीचिंग photodamage का एक संकेत है और बचा जाना चाहिए.
3. MN5 के दृश्य के लिए वैकल्पिक विधि
हमारे आवेदन के लिए यह महत्वपूर्ण है कि सेल लेबल GFP की लक्षित अभिव्यक्ति के साथ उदाहरण के लिए,. वैकल्पिक रूप से, एक lipophilic डाई, DiI लिए प्रतिगमनपूर्वक इस न्यूरॉन लेबल इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मामले में डाई क्रिस्टल उड़ान एक कीट minutien पिन का उपयोग मांसपेशी में डाला जाता है, और घाव यू का उपयोग बंद कर दिया हैवी क्यूरिंग गोंद.
- 100 μl 70% इथेनॉल में कुछ DiI क्रिस्टल (कोई विशेष राशि) भंग के द्वारा एक DiI स्टॉक समाधान करें. इस समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है जब तक अप किया जाता है. दोहराया ठंड और विगलन एक समस्या नहीं है.
- समाधान के 5 μl तो एक अनुपचारित कवर पर्ची पर pipetted कर रहे हैं. रुको जब तक इथेनॉल सुखाया गया है. यह केवल कुछ ही मिनट लगते हैं.
- एक शीशी पूर्व कूल्ड में एक मक्खी (बर्फ में चिपके द्वारा) और समय की एक छोटी अवधि (1 मिनट से नीचे) के लिए बर्फ पर ठंडा रखें. एक विच्छेदन stereomicroscope के तहत एक ठंडा प्लेट पर ठंड anesthetized मक्खी रखें.
- केंद्र मक्खी और यह जगह में पकड़ इतना है कि यह अलग आसानी से धक्का नहीं कर सकते हैं जब एक minutien पिन के साथ poked किया जा रहा है.
- दो संदंश, एक का उपयोग करने के लिए minutien पिन, अन्य एक मक्खी नीचे पकड़ पकड़.
- मोटे संदंश का प्रयोग करने के लिए एक कीट minutien पिन पकड़ और कवर पर्ची से DiI के कुछ खरोंच इतना है कि वहाँ पिन minutien की नोक पर एक DiI क्रिस्टल (का उपयोग कर रहा हैबहुत ही कवर पर्ची और है कि कवर पर बहुत ही स्थान पर्ची हर बार पिन पर अधिक डाई हर समय प्रक्रिया किया जाता है) में मदद करता है. पिन भी नहीं बताया, इसे और अधिक आसानी से मोड़ और फिर उपयोग करने के लिए मुश्किल हो सकता है.
- फिर मक्खी DiI के साथ टिप पर minutien पिन के साथ पृष्ठीय छाती के बीच में एक छेद पंचर. दो dorsolongitudinal उड़ान मांसपेशी (DLM, हर तरफ मांसपेशी फाइबर 5 और 6) के dorsalmost मांसपेशी फाइबर MN5 द्वारा innervated हैं. इसलिए, छाती के बीच में सही डाई क्रिस्टल रखने का आश्वासन दिया है कि MN5 दोनों क्योंकि DLM के दोनों मांसपेशी फाइबर 6 दुख होगा लेबल किया जाएगा और कुछ डाई मिलता है.
- डाई छल्ली नीचे सीधे रखा जाना चाहिए. अगर डाई भी गहरी डाला जाता है, मक्खी या छुरा घोंपा जा सकता है अन्य न्यूरॉन्स (उदा Mn1-4) के रूप में अच्छी तरह से लेबल किया जा सकता है.
- यह जब तक पर्याप्त डाई (इस अभ्यास और अनुभव का एक मामला है) छाती में डाला जाता है दोहराया है
- DiI पानी solub नहीं हैले, इसलिए यह मांसपेशी की cytosol में भंग नहीं और छल्ली नीचे "भरवां" होगा.
- फिर एक और minutien पिन यूवी इलाज गोंद (हम एक वजन नाव में गोंद की एक छोटी बूंद डाल) की एक छोटी बूंद में डूबा हुआ है.
- गोंद है कि अब minutien पिन के सिरे पर है जहां डाई क्रिस्टल डाला गया घाव को बंद करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- कुछ गोंद (केवल एक छोटे से, पूरे छाती घाव को बंद नहीं) के आवेदन करने के बाद एक यूवी बंदूक के लिए गोंद का इलाज करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हम दो 10 यूवी प्रकाश जोखिम के अंतराल का उपयोग करें.
- इलाज मक्खियों ताजा भोजन पर एक मक्खी शीशी में डाल रहे हैं. यकीन है कि 'मक्खियों छाती पर गोंद जगह शीशी जो उड़ जाल की दीवारों के लिए छड़ी नहीं है.
- डाई लक्ष्य न्यूरॉन तक पहुँचने के लिए कुछ घंटे की जरूरत है. यह झिल्ली के साथ यात्रा नहीं cytosol में के बाद से यह लिपिड घुलनशील है. हम दोपहर में पशुओं का इलाज और उन पर रात छोड़ दें.
- पैच दबाना प्रयोगों अगले दिन आयोजित की जाती हैं. न्यूरॉन्स कम दिखाई के रूप में आनुवंशिक रूप से व्यक्त GFP का उपयोग करने के लिए तुलना.
4. एनजाइम पिपेट है कि साफ सफाई के लिए प्रयोग किया जाता है की तैयारी
यह रिकार्डिंग कक्ष के माध्यम से एक नमकीन की एक सतत प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है. स्नान मात्रा वृद्धि और गिरावट होने के रूप में यह कंपन का कारण बनता है और प्रयोगों के दौरान संभावित परिवर्तनों ऑफसेट बचा जा सकता है. छिड़काव और चूषण तदनुसार स्थापित किया जाना है. यह समाधान विनिमय बहुत आसान है, जो बारी में protease के तेजी से और प्रयोग के दौरान औषधीय एजेंटों के तेजी से आदान - प्रदान के प्रयोग से पहले धो लिए महत्वपूर्ण है बनाता है.
- रिकॉर्डिंग कक्ष (लगभग 2 मिलीलीटर प्रति मिनट में प्रवाह की दर) के छिड़काव का आश्वासन देता हूं. प्रवाह दर एक मुर्गा का उपयोग करके या विशिष्ट व्यास tubings (बड़ा व्यास, उच्च प्रवाह की दर) का उपयोग करके नियंत्रित किया जा सकता है. जितना संभव हो छोटा कक्ष की मात्रा वें में समाधान का तेजी से आदान - प्रदान की गारंटीई कक्ष. इस protease और रिकार्डिंग कक्ष से ब्लॉकर्स के तेजी से हटाने का आश्वासन दिया.
- चैम्बर की मात्रा पर निर्भर करता है कैसे छिड़काव प्रणाली की खारा (1 चित्रा) रिकॉर्डिंग चैम्बर (जब पानी विसर्जन उद्देश्य स्नान में उतारा है) में डाला जाता है.
- सुनिश्चित करें कि खारा बाहर एक तरीका है कि रिकॉर्डिंग चैम्बर के अनुमापांक वृद्धि नहीं है और लगातार गिर (चूषण, वृद्धि, चूषण वृद्धि,) में तैनात है, लेकिन स्थिर बनी हुई है (स्थिर चूषण). हम निरंतर, कभी बाधित gurgling ध्वनि कि लगातार खारा स्नान से बाहर चूसने द्वारा निर्मित है स्थिर और स्थिर छिड़काव निर्धारित करते हैं.
- खारा में और बाहर के रूप में हम चमड़े के नीचे सुई है कि तुला और संकीर्ण tubings से जुड़ी और रिकार्डिंग कक्ष के पास रखा प्लास्टिसिन (चित्रा 1F) का उपयोग का उपयोग करें.
- एक पैच विंदुक खींचो और दृश्य नियंत्रण के तहत एक छोटी सी टिप तोड़. ठीक साफ संदंश का प्रयोग करें. जब विंदुक unde visualizingr 40x पानी विसर्जन लेंस विंदुक टिप व्यास लगभग सेल सोमा व्यास के 40 और 70% के बीच होना चाहिए. बहुत बड़ा सुझावों (लगभग व्यास सेल या बड़ा) भी इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, विंदुक केशिका बलों के कारण बंद सेल शरीर तेजस्वी की संभावना बढ़ जाती है. बहुत छोटे विंदुक (सोम व्यास के कम से कम 10%), यह आसानी से मोज़री सफाई की प्रक्रिया के दौरान एक या एक से अधिक ताजा विंदुक (ओं) का उपयोग होने में जो परिणाम है.
- यह clogging बिना PBS बफर या खारा में 2% protease के साथ विंदुक भरें.
- इलेक्ट्रोड धारक में एंजाइम विंदुक डालें. लागू दबाव के समुचित नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए, धारक कसकर सील किया जाना है.
- विंदुक धारक पर छोटे आउटलेट के लिए एक टयूबिंग और संलग्न यह एक तरीका है कि टयूबिंग से मुक्त अंत में tugging विंदुक कि विंदुक धारक में डाला गया था प्रभावित नहीं करता है सुरक्षित. खुर्दबीन के नीचे आंदोलन के लिए जाँच करें.
- या तो एक प्लास्टिक पी डालें (ipette तरह है कि एक स्वचालित pipetter के साथ प्रयोग किया जाता है, हम नीले 1000 μl लोगों का उपयोग करें, लेकिन यह प्राथमिकता का मामला है अन्य आकार के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है.) टिप या टयूबिंग के मुक्त अंत में एक मुर्गा के साथ एक सिरिंज विंदुक / एंजाइम पैच सकारात्मक और नकारात्मक दबाव लागू करने में सक्षम हो. सकारात्मक दबाव या तो विंदुक टिप (यह एक टुकड़ा मुंह के रूप में उपयोग) में उड़ाने या सिरिंज नीचे धक्का द्वारा लागू किया जाता है. नकारात्मक दबाव चूषण (टुकड़ा मुंह का उपयोग करते हुए मुंह के साथ) या सिरिंज से बाहर खींच कर लागू होता है.
- सकारात्मक और नकारात्मक दबाव अनुप्रयोगों के उद्देश्य ढीला करने के लिए और कोशिकाओं और जांच के तहत कोशिकाओं के आसपास के मलबे को हटाने के लिए है. सकारात्मक दबाव सफाई विंदुक से एंजाइम बेदखल करना और सीएनएस की सतह से मलबे उड़ा देंगे. नकारात्मक दबाव VNC (एक वैक्यूम क्लीनर की तरह) बंद मलबे चूसना करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
5. MN5 GFP टैग की सफाई (3 चित्रा और वीडियो)
"सामग्री> पाठक के लिए नोट: पहले और बाद में सफाई MN5 की छवियाँ चित्रा 3 में भेद करना मुश्किल यह है कि आप क्या वास्तविक जीवन में मिलता है यह कुछ प्रशिक्षण लेने के लिए साफ और गैर साफ के बीच सूक्ष्म अंतर भेद सीखना होगा. न्यूरॉन्स कृपया ध्यान दें कि इन सूक्ष्म अंतर छवियों को हिलाने में बेहतर देखा जा सकता है इसलिए, फिल्म स्थैतिक छवियों (3 चित्रा) की तुलना में एक बेहतर प्रभाव प्रदान करता है.- कल्पना एंजाइम चमकदार रोशनी के साथ 40x पानी की सूई लेंस के तहत विंदुक (चित्रा 3B, सफेद तीर) भरा.
- विंदुक टिप पर ध्यान दें. यदि यह भरा हुआ है, सकारात्मक या नकारात्मक दबाव को लागू करने से गंदगी बाहर निकलने की कोशिश. अगर गंदगी बाहर नहीं आया है, एक नया विंदुक भरा एंजाइम तैयार करते हैं.
- फ्लोरोसेंट रोशनी (चित्रा 3 ए) के लिए स्विच.
- एंजाइम विंदुक ध्यान से कम करने के लिए और फिर से ध्यान केंद्रित सेल शरीर तक देखा जा सकता है.
- जब एंजाइम विंदुक के करीब हैसेल शरीर, छिड़काव बंद कर.
- इतना है कि सेल करने के लिए उपयोग में बाधा है कि सब कुछ ढीला हो जाएगा सेल शरीर की ओर कम फटने में सकारात्मक दबाव लागू करें. यह करने के लिए किया जा सकता है जब तक सेल शरीर के आसपास के ऊतकों ढीला आता है.
- इसके अलावा एंजाइम विंदुक ढीला मलबे कि एक पर छोड़ दिया ganglionic म्यान है कि VNC चारों ओर से हो सकता है को पकड़ने के पीछे की ओर ले जाने के लिए. यह पहले माइक्रोस्कोप पर तैयारी बढ़ते विच्छेदन द्वारा किया गया हो सकता है पहले से ही हटा दिया (यह हमेशा मामला नहीं है).
- सकारात्मक और नकारात्मक दबाव के आवेदन के साथ बारी, एक वैक्यूम क्लीनर और सेल शरीर के चारों ओर निर्वात की तरह एंजाइम विंदुक का उपयोग करें. यह पूरे सेल शरीर को पूरी तरह ढीला करने के लिए आवश्यक नहीं है. सफाई सोमा के पूर्वकाल हिस्सा (या पीछे या पार्श्व विंदुक पर निर्भर करता है क्या तरफ से हिस्सा सोमा दृष्टिकोण) करना होगा.
- जब तक मलबे से मुक्त झिल्ली लग रहा है इस प्रक्रिया सफाई किया जाता है.
- MEMBRAपूर्वोत्तर साफ है जब वहाँ कोई 'छाया' या सेल और आसपास के ऊतकों जब फ्लोरोसेंट प्रकाश के साथ ही देखा के बीच फैलाना विपरीत है. यह उच्च तीव्रता नीले प्रकाश के साथ सबसे अच्छा देखा जा सकता है. इसलिए, एक पल के लिए प्रकाश की तीव्रता में वृद्धि (हम तटस्थ घनत्व फिल्टर को दूर करने के लिए कि लक्ष्य को हासिल करने के लिए). नोट कि व्यापक नीले प्रकाश जोखिम के रूप में एक नियमित एचबीओ 100 पारा बल्ब द्वारा प्रदान की तस्वीर के बारे में एक मिनट के भीतर क्षति हो सकती है. यह GFP फीका के रूप में कोशिकाओं को मरने के संकेत में परिणाम देगा.
- चमकदार रोशनी के लिए स्विच और कोशिकाओं और मलबे कि फ्लोरोसेंट रोशनी के साथ नहीं देखा जा सकता है हटा दें. ट्रेकिआ के उस दृश्य नोट और सफाई स्थिति चमकदार रोशनी और फ्लोरोसेंट रोशनी के बीच स्विचन से लाभ प्राप्त कर सकते हैं.
- जब सफाई की प्रक्रिया समाप्त हो गया है और सेल शरीर को साफ दिखाई देता है, छिड़काव प्रणाली पीठ पर स्विच (करते हैं कि प्रक्रिया सफाई भी अगर 3 से 5 मिनट की तुलना में अब और नियमित छिड़काव के साथ सफाई जारी लेता है) और प्रकाश बंद.
- सेल के लिए कुल्लाr ~ खारा या समाधान है जो निम्न आवेदन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा के साथ 15 से 20 मिनट. मिलीलीटर कम से कम 40 रिकार्डिंग कक्ष के माध्यम से जाने के लिए यह सुनिश्चित करें कि protease बाहर धोया जाता है होना चाहिए. कोशिका की सतह पर Protease अवशेष अन्यथा स्थिर पैच दबाना रिकॉर्डिंग के दौरान अचानक कोशिका मृत्यु का कारण होगा.
6. विद्युतशरक्रिया विज्ञान
- स्वस्थानी वोल्टेज दबाना और वर्तमान क्लैंप मोड में पूरे सेल पैच दबाना में परम्परागत एक Axopatch 200B एम्पलीफायर (आण्विक उपकरण, संयुक्त राज्य अमरीका) का उपयोग किया जाता है, संकेत एक 1320 Digidata (आण्विक उपकरण, संयुक्त राज्य अमरीका) का उपयोग कर डिजीटल हैं और pClamp 10.2 सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया.
- पैच pipettes borosilicate कांच capillaries से एक ऊर्ध्वाधर विंदुक डांड़ी (Narishige, पीसी-10) के साथ खींच रहे हैं.
- पिपेट टिप resistances के बीच 5.8 और 6.2 MΩ (वर्तमान दबाना और पोटेशियम वर्तमान रिकॉर्डिंग) और 2.8 और 3.5 के बीच MΩ (कैल्शियम मौजूदा रिकॉर्डिंग के लिए) क्रमशः हैं. संकेत प्रतिरोध पर निर्भर करता हैअंतर और बाह्य समाधान (विवरण के 14 13, देखें).
7. प्रतिनिधि परिणाम
सफाई की प्रक्रिया के बाद दोनों MN5 स्वस्थानी पूरे सेल पैच दबाना (3 चित्रा) के लिए तैयार कर रहे हैं. निम्नलिखित अनुभाग प्रतिनिधि वोल्टेज क्लैंप और मौजूदा क्लैंप के रूप में वर्णित प्रक्रिया सफाई का उपयोग करने के बाद MN5 सोमा से दर्ज निशान से पता चलता है. MN5 वोल्टेज gated आयन चैनलों (13,14 भी देखें) की एक किस्म व्यक्त करता है. हम वोल्टेज gated कैल्शियम (4 चित्रा) धाराओं, वोल्टेज gated पोटेशियम धाराओं (5 चित्रा) और कार्रवाई संभावित निशान (6 चित्रा) का एक उदाहरण दिखाते हैं. वोल्टेज gated कैल्शियम और पोटेशियम धाराओं समान वोल्टेज प्रोटोकॉल के द्वारा पैदा किया गया है, लेकिन समाधान है कि इस्तेमाल किया गया है कि अलग आदेश में केवल जांच के तहत आयन चैनल वर्तमान पारित करने के लिए (विवरण के लिए 13,14 देखें) की अनुमति देने के लिए. अन्य सभी प्रमुख वोल्टेज gated आयन चर्चाannels अवरुद्ध कर दिया गया है (वोल्टेज gated सोडियम चैनल 100 एनएम tetrototoxin के साथ स्नान में सीधे pipetted, छिड़काव दो मिनट के लिए रोका गया था - कैल्शियम चैनलों को 500 सुक्ष्ममापी cadmiumchloride के साथ, 2 मिमी 4 aminopyridin (4 एपी) और 30 के साथ पोटेशियम चैनल मिमी मिमी extracellularly और 0.5 4 एपी, 20 मिमी tetraethylammoniumbromide और पैच विंदुक में intracellular पैच समाधान (13,14 के लिए विवरण देखें). कार्रवाई संभावित निशान वर्तमान इंजेक्शन द्वारा MN5 सोम (चित्रा में पैदा किया गया के माध्यम से 144 मिमी cesiumchloride intracellularly tetraethylammoniumchloride 6) किसी भी आयन चैनल 12 ब्लॉकर्स के उपयोग के बिना.
चित्रा 1. सफाई सेटअप. मक्खी नीचे एक 35 मिमी पेट्री डिश के एक sylgard लेपित ढक्कन में टिकी है जिसमें हम w एक प्लास्टिक की अंगूठी (भीतरी व्यास 9 मिमी, 1.3 मिमी मोटी) चिपकेith वेसिलीन (ए, बी). खारा में मक्खी submerging के बाद (सी) यह पृष्ठीय midline साथ खोला है. पेट और घुटकी उदरीय तंत्रिका कॉर्ड (डी) को बेनकाब करने के लिए हटा रहे हैं. वक्ष neuromere की बेहतर पहुंच के लिए सिर (ई) हटा दिया है. बाद एक ईमानदार epifluorescence माइक्रोस्कोप पर बढ़ते तैयारी, छिड़काव (एफ, जी, खारा में, खारा बाहर छोड़ दिया, सफेद तीर) प्रणाली के साथ ही जमीन तार की स्थिति में लाया जाता है (एफ, जी, सफेद तीर पर सही). भरा एंजाइम विंदुक सफाई पानी विसर्जन उद्देश्य (40x, 0.8 NA) स्नान (एच) में उतारा गया है के बाद की स्थिति में लाया जाता है. स्पष्टता के लिए हम पहले से ही यह दिखाने से पहले उद्देश्य (एफ, जी, सही पर सफेद तीर) कम कर दी गई है. कोण एंजाइम विंदुक कि 1-HL-U इलेक्ट्रोड धारक (जे) के द्वारा आयोजित किया जाता है, जिस पर रिकॉर्डिंग कक्ष में प्रवेश कर रहा है के रूप में महत्वपूर्ण है विंदुक दोनों उद्देश्य और प्लास्टिक की अंगूठी नहीं संपर्क करना चाहिए. इस कोण स्थापना से सेटअप करने के लिए बदलता है. यहाँ यह है लगभग 30 ° (कश्मीर में जम्मू, तीर में ड्राइंग देखें). अपनी धारक में विंदुक है जो एक headstage से जुड़ा हुआ है की व्यवस्था (एल) में दिखाया गया है. headstage एक motorized micromanipulator से जुड़ी है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 2. उदर तंत्रिका कॉर्ड में MN5 MN5 ड्रोसोफिला उदरीय तंत्रिका कॉर्ड (VNC) में अपने स्थान से आसानी से पहचाना जा सकता है जब GFP आनुवंशिक motoneuron विशिष्ट GAL4 ड्राइवरों (ए) के उपयोग के द्वारा व्यक्त की है. डॉटेड आयत वक्ष neuromere दर्शाया गया है. कैसे आकार एक दूसरे से संबंधित के एक विचार प्राप्त करने के लिए, हम एक सफाई पैच dorsolongitudinal उड़ान की मांसपेशी के बाईं ओर से बाईं MN5 आ विंदुक दिखा. बेहतर दृश्य के लिए, पैच विंदुक एक लाल रंग (dextran tetramethylrhodamine, ए) के साथ भरा हुआ था. contralatमौखिक रूप से MN5 पेश midline के प्रत्येक पक्ष पर VNC के mesothoracic neuromere के पृष्ठीय सतह (बी में एक confocal छवि ढेर के प्रक्षेपण को देखने) पर स्थित हैं. ipsilaterally Mn1-4 पेश laterally स्थित हैं और पूर्व से MN5 (बी में तीर) से संबंधित है. MN5 दोनों के बीच डॉटेड सर्कल MN5 (बी) सहित neuropil में उड़ान motoneurons की dendrites दर्शाया गया है. (बी) में GFP लेबल GFP के खिलाफ एक एंटीबॉडी के साथ immunohistochemical धुंधला हो जाना द्वारा बढ़ाया गया था. MN5 आकारिकी विवरण अदृश्य खोया सामानघर ट्रेसर neurobiotin और बाद छवि अधिग्रहण confocal (सी) के साथ न्यूरॉन intracellularly (iontophoretically) भरने के द्वारा दिखाई दे बना रहे हैं. धुंधला एक fluorophore मिलकर streptavidin के साथ दिखाई दिया था. स्केल बार 30 सुक्ष्ममापी है.
चित्रा 3. पहले और बाद में सफाई MN5. MN5 के दृश्य GFP की अभिव्यक्ति UAS/GAL4 का उपयोग कर के द्वारा हासिल की हैप्रणाली (ए, सी, लेबल देखें). MN5 (ए, बी) पहले और बाद में (सी, डी) सफाई प्रक्रिया. प्रत्येक चित्र के बाईं ओर पूर्वकाल का प्रतिनिधित्व करता है, दाहिने हाथ की ओर पीछे का प्रतिनिधित्व करता है. से रिकॉर्ड न्यूरॉन्स एक protease भरा एक टूटी हुई टिप के साथ पैच विंदुक के साथ साफ कर रहे हैं. एंजाइम विंदुक केवल थोड़े बल से दिखाई देता है (ए, बी, लेबल देखें). एक में इनसेट एंजाइम सेल आ विंदुक के साथ नीचे MN5 की वृद्धि को दर्शाता है. MN5 प्रक्रिया सफाई (बी) से पहले चमकदार रोशनी में नहीं देखा जा सकता. ट्रेकिआ हटाया जा करने की जरूरत है अगर वे जांच के तहत कोशिकाओं को कवर. सफाई की प्रक्रिया के बाद, सेल और आसपास के ऊतकों के बीच विपरीत अधिक कुरकुरा (सी, MN5 नीचे) है, और अब सेल उज्ज्वल प्रकाश (D) में देखा जा सकता है. विंदुक टिप जब उज्ज्वल प्रकाश किया जाता है और अधिक स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है. वृद्धि बिंदीदार वर्ग में क्षेत्र के साथ MN5 सेल शरीर सीमाओं बेहतर पहचान के लिए एक बिंदीदार रेखा के साथ घेर लिया दर्शाया गया है. चमकदार रोशनी में विज़ुअलाइज़ेशन अक्सर सफाई के निर्णय में मदद करता है.
चित्रा 4. कैल्शियम MN5 में वर्तमान पूरे सेल कैल्शियम धाराओं के उदाहरण रिकॉर्डिंग रूप में MN5 से दर्ज की गई. कम से कम दो अलग कैल्शियम धाराओं चला रहे हैं, एक कम वोल्टेज सक्रिय क्षणिक कैल्शियम और एक निरंतर उच्च वोल्टेज वर्तमान कैल्शियम. धाराओं -90 mV की होल्डिंग क्षमता से पैदा किया गया है. -90 MV से 20 mV वोल्टेज कदम लागू किया गया. ब्लॉकर्स सबसे अन्य आयन चैनल ब्लॉक करने के लिए इस्तेमाल किया गया. कलाकृतियों स्पष्टता के लिए छोड़े गए थे (MN5 कैल्शियम धाराओं के लक्षण वर्णन के लिए Ryglewski एट अल. 2012 देखें).
चित्रा 5. में MN5 पोटेशियम धाराओं पूरे सेल पोटेशियम रूप में MN5 से दर्ज धाराओं के उदाहरण रिकॉर्डिंग. दिखाया धाराओं कैल्शियम सक्रिय पोटेशियम धाराओं के रूप में लागू किया गया कोई कैल्शियम चैनल ब्लॉकर्स शामिल हैं. धाराओं एक होल्डिंग से पैदा किया गया-90 mV की संभावित कुल वर्तमान पोटेशियम (ए) के लिए या -20 mV की धारण क्षमता के लिए क्षणिक पोटेशियम धाराओं निष्क्रिय और केवल निरंतर वर्तमान पोटेशियम (बी) दिखाने से. -90 MV से 20 mV वोल्टेज कदम 10 mV वेतन वृद्धि में लागू किया गया. ऑफ़लाइन पोटेशियम धाराओं के घटाव के रूप में -90 (ए) एम वी और -20 (बी) शुद्ध क्षणिक पोटेशियम धाराओं (सी) प्रकट mV की होल्डिंग क्षमता से पैदा की. वोल्टेज gated सोडियम चैनल अवरुद्ध किया गया. कलाकृतियों स्पष्टता के लिए छोड़े गए थे (वोल्टेज MN5 कैल्शियम और पोटेशियम धाराओं के लक्षण वर्णन के लिए Ryglewski और Duch, 2009 देखें).
6 चित्रा. फायरिंग पैटर्न MN5 द्वारा प्रदर्शित पैटर्न फायरिंग के उदाहरण रिकॉर्डिंग के रूप में दैहिक 200 एमएस की अवधि का मौजूदा इंजेक्शन (0.4 ना काले, 0.5 ना ग्रे) के द्वारा MN5 में हासिल. आराम झिल्ली क्षमता -59 mV था. कोई आयन चैनल ब्लॉकर्स इस्तेमाल किया गया. वर्तमान क्लैंप विश्लेषण MN5 फायरिंग के लिए (पैटर्न Duch एट अल देखते हैं, 2008).
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Discussion
GFP जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ कोशिकाओं visualizing, यह महत्वपूर्ण है कि बहुत ज्यादा प्रकाश नहीं तैयारी पर बेनकाब. यह तस्वीर नुकसान में हो सकता है. हम रोशनी के लिए 100W एचबीओ कम चाप पारा बल्ब का उपयोग करते हैं, और हम भी 0.8 (Chroma एन डी फिल्टर 0.3 और 0.5) तटस्थ घनत्व (एनडी) का उपयोग करें. सफाई अच्छा दृश्यता की गुणवत्ता पर न्याय करने में सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण है. इसलिए, एन डी फिल्टर कई बार के लिए 20 के बारे में है की छोटी अवधि के लिए हटाया जा सकता है.
जब कुछ सकारात्मक दबाव लागू करने, सेल शरीर एक छोटी सी "फ्लैप". यह सफाई की गुणवत्ता को पहचानने में मदद करता है. के उदर तंत्रिका कॉर्ड विपरीत में बहुत कम है, और आंदोलन अत्यंत कोशिकाओं कल्पना करने के लिए सहायक हो सकता है. इलेक्ट्रोड धारक है कि सफाई की प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है (पैच clamping लिए और भी) कसकर बंद होने की जरूरत है, अन्यथा नियंत्रित दबाव आवेदन संभव नहीं होगा. दबाव खोने ऊतक के सफल हटाने और देब परेशान नहीं करेगाआरआईएस और giga मुहर गठन को रोकने जाएगा
स्वस्थानी पैच दबाना रिकॉर्डिंग में मामले में सेल की सफाई के बाद प्रदर्शन किया जाएगा, पता है कि वहाँ न केवल एक एक पूरे के रूप में उदर तंत्रिका कॉर्ड आसपास म्यान (जो वयस्क मक्खियों के किसी भी केंद्रीय न्यूरॉन के किसी भी पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए हटा दिया जाना चाहिए है ), लेकिन कोशिकाओं को स्वयं एक म्यान से घिरा हुआ जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से. MN5, उदाहरण के लिए, है कि संक्षिप्त उच्च तीव्रता रोशनी के साथ ही देखा जा सकता है एक म्यान गैर सेलुलर से घिरा हुआ है. इसके अलावा, कोशिकाओं ट्रेकिआ के नीचे जा सकता है. मामले में सेल पहुँचा नहीं जा सकता, ट्रेकिआ तरफ खींचा जा विंदुक के साथ अगर प्रक्रिया सफाई (एक तरफ खींचा गया है के बाद) के दौरान बंद फट नहीं है. पूरी प्रक्रिया सफाई ऊतक बहुत ज्यादा खींच के बिना किया जाना चाहिए. इस प्रक्रिया के प्रशिक्षण की आवश्यकता होगी. बेहतर सफाई, तत्काल (1 के भीतर सेल को छूने के बाद giga जवानों और रिलायंस एनर्जी के उच्च आवृत्ति होगासकारात्मक दबाव सहजता).
सफाई प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है और तोड़ने में निम्न परिदृश्यों संभव हैं: पहले, अगर कोशिकाओं को काफी अच्छी तरह से साफ नहीं किया गया है, एक giga मुहर संभव नहीं है और प्रयोग समाप्त किया जाना चाहिए. दूसरा, कुछ मामलों में सफाई giga मुहर के गठन के लिए काफी अच्छा है, लेकिन एक पतली, म्यान शायद ही दिखाई अवशेष सोमा चारों ओर रहता है. इस संबंध विच्छेद करने के लिए झिल्ली का कारण और विभिन्न amplitudes के रिसाव धाराओं का कारण होगा. अपर्याप्त सेल सफाई का एक कम गंभीर परिणाम है है कि म्यान कारण के कुछ अवशेष उपयोग प्रतिरोध में बढ़ जाती है. पैच के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन अलग गुणवत्ता मानदंड के आधार पर लागू हो सकता है. कोशिका की झिल्ली क्षमता वर्तमान दबाना में कार्रवाई संभावित पैटर्न की निगरानी के लिए स्वस्थ हो सकता है (-55 mV या अधिक MN5 के मामले में hyperpolarized) करना चाहिए, लेकिन उपयोग प्रतिरोध ऐसी एक महत्वपूर्ण मुद्दा नहीं है. हालांकि, जब वर्तमान इंजेक्शन का उपयोग फिर से ऐक्शन पोटेंशिअल evokingविरोध एक मुद्दा बन जाता है. बड़े आयाम पोटेशियम धाराओं जो रिकॉर्डिंग साइट के लिए करीब रिसाव छोटा हो सकता है (MΩ की तुलना में 80 अधिक MN5 इनपुट प्रतिरोध के मामले में) करना चाहिए और उपयोग प्रतिरोध 15 MΩ से बड़ा नहीं होना चाहिए जन्माना evoking. अंतरिक्ष क्लैंप कि छोटे आयाम वृक्ष के समान कैल्शियम धाराओं के वोल्टेज क्लैंप रिकॉर्डिंग है जो सोमा से काफी कुछ दूरी पर आरंभ नहीं रिसाव (के लिए MN5 इनपुट प्रतिरोध 120 से ऊपर MΩ होना चाहिए) पेश किया जा सकता है और उपयोग प्रतिरोध 12 से अधिक नहीं हो सकता है की जरूरत है MΩ. ज्यादातर रिकॉर्डिंग में हम 8 और 10 MΩ (के रूप में श्रृंखला प्रतिरोध और पूरे सेल समाई मुआवजा के बाद axopatch 200B एम्पलीफायर पर डायल से पढ़ने के लिए) के बीच का उपयोग resistances के साथ कैल्शियम धाराओं को मापने. प्रत्येक कोशिका के लिए रिकॉर्ड किया प्रकार के लिए, ऐसे गुणवत्ता मानदंड व्यक्तिगत रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए.
सफाई यहाँ वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करना, हम approxima के लिए स्थिर रिकॉर्डिंग पकड़ कर सकते हैंtely 90 मिनट. हम काफी रन नीचे (Cav2 और Cav3 कैल्शियम धाराओं के लिए और शेखर, shal, और देरी सही करनेवाला पोटेशियम धाराओं के लिए विशेष रूप से परीक्षण) का पालन नहीं करते. बहरहाल, हम पैच लंबे समय तक पकड़ का प्रयास नहीं किया है और इसलिए राज्य नहीं कर सकते हैं कि अब रिकॉर्डिंग संभव होगा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 | |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 | |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 | |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 | |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT | |
| ND filter set (unmounted) | Chroma Technology Corp. | 22000b series | |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
References
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