Utarbeidelse av Published: October 15, 2012 doi: 10.3791/4264

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Stefanie Ryglewski¹, Carsten Duch¹

¹School of Life Sciences, Arizona State University

Summary

In situ patch clamp innspillinger brukes for elektrofysiologisk karakterisering av nevroner i intakt kretser. I Drosophila genetisk modell patch clamping er vanskelig fordi CNS er liten og omgitt av en robust slire. Denne artikkelen beskriver fremgangsmåten for å fjerne kappe og rene nevroner for senere patch clamp opptak.

Abstract

Kort generasjonstid og lettvinte genetiske teknikker gjør bananflue Drosophila melanogaster en utmerket genetisk modell i grunnleggende nevrovitenskap forskning. Ionekanaler er grunnlaget for all atferd siden de megle neuronal eksitabilitet. Den første spenningen gated ionekanal klonet var Drosophila spenning gated kaliumkanaler Shaker ^1,2. Mot å forstå den rollen ionekanaler og membran eksitabilitet for nervesystemet funksjon er det nyttig å kombinere kraftige genetiske verktøy tilgjengelig i Drosophila med in situ patch clamp opptak. For mange år slike opptak har vært hemmet av den lille størrelsen på Drosophila CNS. Videre utgjorde en robust kappe laget av gliaceller og kollagen hindringer for patch pipette tilgang til sentrale nevroner. Fjerning av denne kappe er en nødvendig forutsetning for patch clamp opptak fra alle nervecelle i den voksne Drosophila CNS. I de senere åreneforskere har vært i stand til å gjennomføre in situ patch clamp opptak fra nerveceller i den voksne hjernen ^3,4 og ventral nerve ledningen av ^5,6 embryonale, larve ^7,8,9,10, og voksen Drosophila ^11,12,13,14. En stabil giga-tetning er den viktigste forutsetning for en god lapp, og avhenger ren kontakt av plasteret pipette med cellemembranen å unngå lekkasje strømninger. Derfor må for hele cellen in situ patch clamp opptak fra voksne Drosophila neurons rengjøres grundig. I det første trinn, har den Ganglionic hylse for å bli behandlet enzymatisk og mekanisk fjernet for å gjøre målet celler tilgjengelig. I det andre trinnet, har cellemembranen som skal poleres slik at ingen lag gliaceller, kollagen eller annet materiale kan forstyrre giga-forsegling formasjonen. Denne artikkelen beskriver hvordan du klargjør en identifisert sentral nervecelle i Drosophila ventrale nerve ledningen, flyturen motoneuron 5 (MN5 ^15), for somatisk hele cell patch clamp innspillinger. Identifisering og synlighet på den nervecellen oppnås ved målrettet uttrykk for GFP i MN5. Vi har ikke som mål å forklare patch clamp teknikken selv.

Protocol

Den følgende beskrivelsen er ikke spesifikk for en motoneuron. Den kan brukes med en hvilken som helst neuron. I dette eksempelet bruker vi flyet motoneuron 5 (MN5) som innervates de to dorsalmost fibrene i dorsolongitudinal fløyen depressor muskler (DLM). Å identifisere og visualisere MN5 vi bruker UAS/GAL4 system for å uttrykke GFP i flyet motoneurons (og noen andre nevroner).

1. Disseksjon av Adult Drosophila får du tilgang til Dorsal del av Ventral nerve ledningen (VNC)

1. Dissekere en voksen Drosophila ryggsiden opp langs sin dorsal midtlinjen i en sylgard belagt petriskål (35 mm diameter), som beskrevet i Ryglewski og Duch (2009 ^13). En film av denne disseksjon er tilgjengelig på nettet via Jove (Boerner og Godenschwege ^16. Nedenfor følger en kort beskrivelse av disseksjon.
2. Voksen fluer bedøves ved avkjøling på is i ca 1 min. Dette kan oppnås ved forkjølingen en tom flue hetteglass (uten mat)på is og plassere flua allerede kaldt hetteglasset. Vinger og ben fjernes med en saks.
3. Flua blir deretter festet ryggsiden opp i en sylgard belagt petriskål (vi bruker lokket på en 35 mm Petriskål fylt til randen med sylgard; Tall 1A, B) med en plastring (indre diameter 9 mm, 1,3 mm tykk ) limt til sylgard med petrolatum.
4. Bruken av lokket på en 35 mm petriskål muliggjør tilgang til VNC med en lapp pipette henhold visualisering med en vann dipping linse. Dette bidrar til å innføre pipetten shallowly uten å berøre veggen av formen.
5. Plastringen kan gjøres ved å bore et hull inn i en tynn (vi bruker 1,3 mm tykkelse) plastfolien. Vi bruker en wire cutter å definere den ytre omkrets av ringen, slik at den passer til formen.
6. Senk fly i fysiologisk saltvann (Figur 1C, sammensetningen av saltvann i mm: NaCl 128, 2 KCl, ₂ CaCl 1,8, ₂ MgCl 4, 5 HEPES, sukrose ~ 35 depending på osmolalitet av løsningen; pH justeres til 7,25 med 1 M NaOH, er osmolalitet justert til 290 mOsm med sukrose).
7. Dyret er dissekert langs dorsal midtlinjen, og de store dorsal langsgående fly muskler er strukket sidelengs og låste å avsløre gut, spiserør, og VNC under. Etter fjerning av tarmen og spiserøret, er VNC eksponert (figur 1D).
8. Eventuelt kan flua bli halshugget på dette trinnet (figur 1E). Fjerne hodet gjør tilgang med enzymet og patch pipetter mer praktisk, og MN5 dendritter ikke blir forstyrret når du rengjør soma (dendritter er posterior til soma, Tall 2B, C). Imidlertid kan hodet også være intakt hvis det kreves av den eksperimentelle design (f.eks studere i synkende innspill til thorax motoneurons). I dette tilfellet pipetten kan innføres fra posterior eller lateral (lateral, figur 2A).
9. For rasksaltvann utveksling i eksperimenter volumet av opptaket kammeret er minimert ved å plassere en plastring (indre diameter 9 mm) rundt dissekert dyret og limes til tallerken med petrolatum (Tall 1A, B, volum for opptak kammer er ~ 200 ul) .
10. Preparatet da montert på en oppreist fast scene fluorescens mikroskop (vi bruker Zeiss Axioskop 2 FS pluss, Zeiss, Tyskland) og sett med en høy NA (> 0,75), lang arbeidsavstand (> 2 mm), 40x vann dipping mål. Perfusjon systemet (saltvann-i, saltvann-out), er jordledningen og enzymet pipetten inn i opptaket kammeret (Tall 1F - J, L).

2. Visualisering av MN5 (Se figur 2 og 3), hodet av

1. Monter petriskål på en oppreist fast scene epifluorescent mikroskop.
2. Plasser parabolen med fly i den slik at den fremre delen vender den siden hvor elektrodeholderen ermontert (figur 1).
3. Bruk en høy forstørrelse (40x eller høyere), høy NA vann dipping linse (NA 0,75 eller høyere) og en GFP filter for å belyse VNC. For god visualisering av cellen under rengjøring bruker vi 40x vann dipping objektiver med en NA av enten 0,8 (Olympus LUMPlanFl 40xW) eller en NA på 0,75 (Zeiss W N-Achroplan 40x/0.8 M27). For god tilgang med lappen pipette arbeidsavstanden skal være 2 mm eller større.
4. Begge MN5 ligger i mesothoracic neuromere på dorsal overflaten av ganglion nær midtlinjen mellom - og muligens delvis dekket av - fremtredende luftrøret (Figurene 2 og 3). MN5 med sine dendritter vises som en diffus grøntområde. Den somata blitt mer tydelig etter rengjøring. Vil imidlertid deres dendritter ikke blir skarpe men forblir uklart på grunn av dem fremdeles dekket av vev (figurene 2A, B).
5. I setup vår bruker vi en HBO 100 fluorescens lyskilde som vi ikke kan modify lyseffekten intensitet. Vi bruker nøytral tetthet filtre for å unngå overeksponering av vevet for mye fluorescerende lys, spesielt blått lys. Dette kan forårsake skade bildet og til slutt vil drepe cellene. Vi bruker nøytral tetthet på 0,8. Ingen bleking bør skje i løpet av rengjøringen. Hvis bleking oppstår, mest sannsynlig lyseffekten er for sterk. Cellen er bildet skadet.
6. Hvis LED-belysning er brukt styrkeinnstillinger må bestemmes av eksperimentator. Bleking er et tegn på photodamage og må unngås.

3. Alternativ metode for visualisering av MN5

For vår søknad er det viktig å ha cellen merket, for eksempel med målrettet uttrykk av GFP. Alternativt kan DII, en lipofil fargestoff, brukes til retrogradely merke dette neuron. I dette tilfellet fargestoff krystaller er satt inn i reisen muskel bruker et insekt minutien pin, og såret er lukket ved hjelp av UV herding lim.

1. Lage en Dii stamoppløsning ved oppløsning noen DII krystaller (ingen spesifikk beløp) i 100 pl 70% etanol. Denne løsningen kan oppbevares ved -20 ° C inntil brukt opp. Gjentatt frysing og tining er ikke et problem.
2. 5 ul av løsningen blir deretter pipettert på en ubehandlet dekkglass. Vent til etanol har fordampet. Dette tar bare noen få minutter.
3. Plasser en flue i en på forhånd avkjølt hetteglass (ved å stikke den inn i is) og kul for en kort periode (under 1 min) på is. Plasser den kalde bedøvet flue på en kjøleplate under en disseksjon stereomikroskop.
4. Senter fly og holde det på plass slik at den ikke kan skyves til side lett når du blir stukket med en minutien pin.
5. Bruk to tang, en til å holde minutien pin, den andre til å holde flua ned.
6. Bruk grovt pinsett til å holde et insekt minutien pin og ripe noen av dii fra dekkglass, slik at det er en Dii krystall på spissen av minutien pin (brukersamme dekkglass og samme sted på det dekkglass hver gang bidrar til å få mer farge på pinnen hver gang prosedyren er gjort). Stiften skal ikke for spisse, det kan bøyes lettere og da er vanskelig å bruke.
7. Deretter punktere et hull i midten av fly er dorsal thorax med minutien pin med Dii på spissen. De to dorsalmost muskelfibre i dorsolongitudinal reisen muskelen (DLM, muskelfibre 5 og 6 på hver side) er innervert av MN5. Derfor plassere fargestoff krystaller rett i midten av thorax forsikrer at både MN5 merkes fordi begge muskelfibre 6 av DLM vil bli såret og få noen fargestoff.
8. Fargestoffet bør plasseres rett under cuticle. Dersom fargestoffet er satt for dypt, kan flua bli stukket eller andre nevroner (f.eks Mn1-4) kan bli merket i tillegg.
9. Dette gjentas inntil nok fargestoff (dette er et spørsmål om praksis og erfaring) settes inn i toraks
10. Dii er ikke vann soluble, derfor vil det ikke vil oppløses i cytosol av muskelen og må "fylt" under cuticle.
11. Så en annen minutien pin er dyppet i en dråpe UV-herdende lim (vi sette en dråpe lim i en veiing båt).
12. Limet som nå er på spissen av minutien pin brukes for å lukke sår, der fargestoffet krystaller ble satt inn.
13. Etter påføring av litt lim (bare litt å lukke såret, ikke hele thorax) en UV pistol brukes til å kurere limet. Vi bruker to 10 s intervaller UV lys.
14. De behandlede fluer er satt på fersk mat i et fly hetteglass. Kontroller at limet flekk på fluene 'thorax ikke holde seg til veggene i hetteglass som fanger fly.
15. Fargestoffet trenger noen timer for å nå målet neuron. Det reiser langs membranen, ikke i cytosolen siden det er lipid løselig. Vi behandler dyrene på ettermiddagen og la dem over natten.
16. Patch clamp forsøk er utført påfølgende dag. Nervecellene vil være mindre synlig i forhold til bruk av genetisk uttrykt GFP.

4. Forberedelse av enzymet Pipette som brukes til rengjøring

Det er viktig å sikre en jevn flyt av saltvann gjennom opptaket kammeret. Å ha badet volum vekst og fall må unngås da det fører til vibrasjoner og utlignet mulige endringer i løpet av eksperimenter. Perfusjon og sug må stilles tilsvarende. Dette gjør løsningen utveksling mye enklere, som igjen er viktig for rask vaske ut av protease før eksperimentet og rask utveksling av farmakologiske midler under eksperimentet.

1. Sikre perfusjon av opptaket kammeret (flow rate på ca 2 ml per minutt). Strømningshastighet kan reguleres enten ved hjelp av en hane eller ved å bruke spesifikke diameter produksjonsrør (jo større diameter, jo høyere strømningshastigheten). Har volumet av kammeret så liten som mulig for å garantere rask utveksling av løsningen i the kammer. Dette sikrer rask fjerning av protease og blokkere fra innspillingen kammeret.
2. Volumet av kammeret, avhenger av hvordan det saltvann-ut (figur 1) av perfusjons systemet er satt inn i opptaket kammeret (når vannet nedsenking målet senkes ned i bad).
3. Kontroller at saltvann-out er posisjonert på en slik måte at den titer av opptaket kammeret ikke stiger og faller stadig (suging, stige, suging, stige) men forblir konstant (stødig suging). Vi bestemmer jevn og stabil perfusjon av konstant, aldri avbrutt gurglende lyd som er produsert av stadig suger saltvann ut av badet.
4. Som saltvann-og utsjekking bruker vi sprøyte nåler som er bøyd og festet til smale produksjonsrør og plassert i nærheten av innspillingen kammer med plastelina (Figur 1F).
5. Trekk en lapp pipette og bryte spissen litt under visuell kontroll. Bruke fine rene tang. Når visualisere pipetten under den 40x nedsenking i vann objektiv pipettespissen diameter bør være ca mellom 40 og 70% av cellens soma diameter. Svært store tips (ca. celle diameter eller større) kan også brukes, imidlertid øker sannsynligheten for ripping av cellen kroppen grunnet kapillarkreftene av pipetten. Er pipetten svært liten (mindre enn 10% av soma diameter), tresko den lett som resulterer i å bruke en eller flere friske pipette (r) under rengjøringen.
6. Fyll pipette med 2% protease i PBS buffer eller saltvann uten tilstopping det.
7. Sett enzymet pipetten inn i elektrodeholderen. For å sikre riktig kontroll av det utøvede trykk, må holderen være tett tillukket.
8. Fest et slangen til lille uttaket på pipetteholder og sikre den på en måte som slite på den frie ende av slangen ikke påvirker pipetten som ble satt inn i pipetteholder. Sjekk for bevegelse under mikroskopet.
9. Sett enten en plast p ipette spissen (typen som brukes sammen med en automatisk pipetter, bruker vi de blå 1000 ul seg, men dette er et spørsmål om preferanse. Andre størrelser kan brukes i tillegg) eller en sprøyte med en hane til den frie enden av slangen å være i stand til å anvende positive og negative trykk til enzymet / patch pipette. Positivt trykk påføres enten blåser inn i pipettespissen (bruker det som en munnstykke) eller ved å skyve sprøyten ned. Undertrykk påføres ved sug (med munnen ved hjelp av munnstykke) eller ved å trekke ut i sprøyten.
10. Formålet av de positive og negative trykkbelastninger er å løsne og fjerne celler og rusk som omgir cellene som studeres. Overtrykk mates ut enzymet fra rengjøring pipette og blåse rusk fra overflaten i CNS. Undertrykk brukes til å suge rusk av VNC (som en støvsuger).

5. Rengjøring av GFP-merket MN5 (figur 3 og Video)

innhold "> Merknad til leseren: Bilder av MN5 før og etter rengjøring er vanskelig å skille i figur 3 Dette er hva du får i det virkelige liv Det vil ta litt trening for å lære å skille de subtile forskjellene mellom renset og ikke-renset.. nerveceller. Vær oppmerksom på at disse små forskjeller kan sees bedre i bevegelige bilder. Derfor gir filmen et bedre inntrykk enn de statiske bilder (figur 3).

1. Visualiser enzymet fylt pipette under 40x vann dipping objektiv med sterkt lys (Figur 3B, hvit pil).
2. Fokus på pipettespissen. Hvis det er tett, prøv å få skitt ut ved å bruke positive eller negative trykk. Hvis skitt ikke kommer ut, forberede en ny enzym fylt pipette.
3. Bytt til fluorescerende lys (figur 3A).
4. Senk enzymet pipette nøye og re-fokus til cellen kroppen kan sees.
5. Når enzymet pipetten er nærcellen kroppen, slår perfusjon av.
6. Påfør overtrykk i korte støt mot cellen kroppen slik at alt som er hindrer tilgang til cellen vil bli løsnet. Dette må gjøres før vevet rundt cellen kroppen løsner.
7. Også flytte enzymet pipette dorsally å fange løs rusk som kan være en venstre-over fra ganglieblokkere slire som omgir VNC. Det kan ha blitt fjernet allerede ved disseksjon før montering utarbeidelsen på mikroskopet (dette er ikke alltid tilfelle).
8. Med vekslende bruk av positive og negative press, bruker enzymet pipetten som en støvsuger og vakuum rundt cellen kroppen. Det er ikke nødvendig å løsne hele cellen kroppen helt. Rengjøring av fremre del av soma vil gjøre (eller bakre eller laterale delen avhengig av hvilken side pipetten nærmer seg soma).
9. Denne rengjøringen er gjort før membranen ser fri for rusk.
10. Den membrane er ren når det er ingen "skygge" eller diffuse kontrast mellom celle og omkringliggende vev sett med fluoriserende lys bare. Dette kan sees best med høy intensitet blått lys. Derfor øker lysintensitet for et øyeblikk (vi fjerner nøytral tetthet filtre for å oppnå det). Vær oppmerksom på at utstrakt blått lys eksponering som tilbys av en vanlig HBO 100 kvikksølv pære kan forårsake bilde skade innenfor omtrent et minutt. Dette vil resultere i den GFP signalet å falme som cellene dør.
11. Bytt til lys og fjerne celler og rusk som ikke kunne sees med fluorescerende lys. Vær oppmerksom på at visualisering av luftrøret og renhold status kan ha nytte av å bytte mellom lys og fluorescerende lys.
12. Når rengjøringen er ferdig og cellen kroppen vises ren, slå perfusjon systemet igjen (gjøre det også hvis rengjøringen tar lengre enn 3 til 5 min og fortsette rengjøring med jevn perfusjon) og lyset.
13. Skyll cellen for ~ 15 til 20 min med saltvannsoppløsning eller løsningen som skal brukes for følgende program. Ikke mindre enn 40 ml bør gå gjennom opptaket kammeret for å være sikker på at protease er vasket ut. Protease rester på celleoverflaten vil føre til plutselige celledød under ellers stabile patch clamp opptak.

6. Elektrofysiologi

1. Konvensjonelle i situ helcelle patch clamp i spenning klemmen og strømtang modus er utført ved en Axopatch 200B forsterker (Molecular Devices, USA); signaler blir digitalisert ved hjelp av en Digidata 1320 (Molecular Devices, USA) og analysert med pClamp 10,2 programvare.
2. Patch pipetter er trukket fra borsilikatglass kapillærer med en vertikal pipette avtrekker (Narishige, PC-10).
3. Pipettespissen motstand er mellom 5,8 og 6,2 MΩ (strømtang og kalium nåværende opptak) og mellom 2,8 og 3,5 MΩ (for kalsium dagens opptak) hhv. Tips motstand avhengerintra-og ekstracellulære løsninger brukes (for detaljer se ^{13, 14).}

7. Representant Resultater

Etter rengjøringen både MN5 er klar for in situ helcelle patch clamp (figur 3). Følgende avsnitt viser representative spenning klemme og strømtang spor som er spilt inn fra MN5 soma etter bruk den beskrevne rengjøringen. MN5 uttrykker en rekke spennings gated ionekanaler (se også ^13,14). Vi viser et eksempel på spennings gated kalsium strømmer (figur 4), spenning gated kaliumstrøm (figur 5) og aksjonspotensial spor (figur 6). Spenning gated kalsium og kalium strømmer ble fremkalt av lignende spenning protokoller, men de løsningene som har blitt brukt forskjellig for å tillate bare ionekanaler under etterforskning for å sende strøm (for mer informasjon se ^13,14). Alle andre store spenning gated ion channels har blitt blokkert (spenning natriumkanaler med 100 nM tetrototoxin - pipetteres direkte inn på badet, perfusjon ble stoppet i to minutter - kalsiumkanaler med 500 mikrometer cadmiumchloride, kalium kanaler med 2 mm 4-aminopyridin (4-AP) og 30 mM tetraethylammoniumchloride ekstracellulært og 0,5 mM 4-AP, 20 mM og 144 mM tetraethylammoniumbromide cesiumchloride intracellulært via intracellulære patch løsningen i patch pipetten (for detaljer se ^13,14). aksjonspotensiale spor ble fremkalt av gjeldende injeksjon i MN5 soma (Figur 6) uten bruk av noen ion kanal stopper ^12.

Figur 1. Rengjøring oppsett. Flua er festet ned i en sylgard belagt lokket på en 35 mm petriskål der vi limt en plastring (indre diameter 9 mm, 1,3 mm tykk) wed petrolatum (A, B). Etter submerging fly i saltvann (C) det er åpnet langs dorsal midtlinjen. Gut og spiserøret blir fjernet for å eksponere den ventrale nerve ledningen (D). For bedre tilgjengelighet i bryst neuromere hodet er fjernet (E). Etter montering av preparatet på en oppreist epifluorescence mikroskop blir perfusjon systemet (F, G, saltvann-i, saltvann-out, hvite pilene på venstre) samt jordingsledningen bringes i posisjon (F, G, hvit pil på høyre). Enzymet fylt rengjøring pipette bringes i stilling etter at vannet nedsenking objektiv (40x, NA 0,8) har blitt senket ned i badet (H). For klarhet viser vi det allerede før målet er senket (F, G, hvit pil til høyre). Vinkelen ved hvilken enzymet pipetten som holdes av en 1-HL-U elektrodeholderen (J) er inn i opptaket kammeret er viktig som pipette ikke må berøre både objektiv og plastringen. Denne vinkelen varierer fra oppsett til oppsett. Her er det ca 30 ° (se tegning i J, pil i K). Ordningen av pipetten i holderen som er festet til en headstage vises i (L). Den headstage er festet til en motorisert micromanipulator. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. MN5 i ventrale nerve ledningen. MN5 kan lett identifiseres ved sin plassering i Drosophila ventrale nerve ledningen (VNC) når GFP er genetisk uttrykt ved bruk av motoneuron spesifikke GAL4 drivere (A). Den stiplede rektangelet viser thorax neuromere. For å få en idé om hvordan størrelsene i forhold til hverandre, viser vi en rengjøring patch pipette nærmer venstre MN5 fra venstre side av dorsolongitudinal flyturen muskel. For bedre visualisering ble plasteret pipetten fylt med et rødt fargestoff (dekstran-tetramethylrhodamine, A). Den contralatligvis rager MN5 befinner på dorsal overflate mesothoracic neuromere av VNC på hver side av midtlinjen (projeksjon visning av en konfokal bildestakk i B). Den ipsilaterally prosjektering Mn1-4 er lokalisert mer sidelengs og anteriorly relatert til MN5 (piler i B). Den stiplede sirkelen mellom begge MN5 skildrer dendritter av flyturen motoneurons i neuropil inkludert MN5 (B). GFP etiketten i (B) ble forsterket av immunhistokjemisk farging med et antistoff mot GFP. Detaljer om MN5 morfologi synliggjøres ved å fylle nervecellen intracellulært (iontophoretically) med den usynlige tracer neurobiotin og påfølgende confocal bilde oppkjøp (C). Fargingen ble gjort synlig med streptavidin koblet til en fluorofor. Skala bar er 30 mikrometer.

Figur 3. MN5 før og etter rengjøring. Visualisering av MN5 oppnås ved uttrykk for GFP bruke UAS/GAL4system (A, C, se etikett). MN5 før (A, B) og etter (C, D) rengjøringsprosedyren. Venstre side av hvert bilde representerer anterior, representerer høyre bakre. Neurons å ta opp fra rengjøres med en protease fylt patch pipette med en brukket tips. Enzymet pipette er bare svakt synlig (A, B, se etikett). Innfelt i A viser en forstørrelse av bunn MN5 med enzymet pipetten nærmer cellen. MN5 kan ikke ses i lys før rengjøringsprosessen (B). Luftrøret må fjernes hvis de dekker cellene under etterforskning. Etter rengjøringen, er kontrasten mellom cellen og omkringliggende vev mer skarp (C, nederst MN5), og cellen kan nå ses i sterkt lys (D). Pipettespissen kan sees mer tydelig når lys brukes. Utvidelsen viser området i prikkete firkant med MN5 cellen kroppen grenser omkranset med en stiplet linje for bedre identifisering. Visualisering i sterkt lys ofte hjelper dom renslighet.

<p class = "jove_content">
Figur 4. Kalsium strøm i MN5. Eksempel opptak av helcelle kalsium strømmer som registreres fra MN5. Minst to forskjellige kalsium strømninger er vist, en lavspent aktivert transient kalsium og en vedvarende høyspent kalsiumstrømmen. Strømmer ble fremkalt fra et holdingselskap potensial -90 mV. Spennings trinn fra -90 mV til 20 mV ble brukt. Blokkere ble brukt til å blokkere de fleste andre ionekanaler. Gjenstander ble utelatt for klarhet (for karakterisering av MN5 kalsium strømmer se Ryglewski et al., 2012).

Figur 5. Kaliumstrømmene i MN5. Eksempel opptak av helcelle kaliumstrømmene som er tatt opp fra MN5. Strømmer vist inkluderer kalsium aktivert kaliumstrømmene som ingen kalsiumkanalblokkere ble brukt. Strømmer ble fremkalt fra en driftsenhetpotensial på -90 mV for den totale kalium strøm (A) eller fra en holder potensialet -20 mV til inaktivere transiente kaliumstrøm og vise bare vedvarende kalium nåværende (B). Spennings trinn fra -90 mV til 20 mV ble brukt i 10 mV trinn. Frakoblet subtraksjon av kaliumstrøm som fremkalles fra en holdeposisjon potensialet -90 mV (A) og -20 mV (B) viser rene transiente kaliumstrøm (C). Spennings natriumkanaler ble blokkert. Gjenstander ble utelatt for klarhet (for karakterisering av MN5 spenning og kalsium kalium strømmer se Ryglewski og Duch, 2009).

Figur 6. Firing mønster utstilt ved MN5. Eksempel innspillingen av avfyring mønstre som oppnår MN5 av somatiske nåværende injeksjoner (0,4 nA, svart, 0,5 nA, grå) på 200 ms varighet. Resting membranpotensiale var -59 mV. Ingen ionekanal blokkere ble brukt. (For strømtang analyse av MN5 avfyringmønstre se Duch et al., 2008).

Discussion

Når visualisere cellene med fluorescerende proteiner som GFP, er det viktig å ikke over-utsett preparatet som for mye lys. Dette kan resultere i bilde skade. Vi bruker 100W HBO korte arc kvikksølv pærer til belysning, og vi bruker også nøytral tetthet (ND) på 0,8 (Chroma ND filter 0.3 og 0.5). Å være i stand til å bedømme om kvaliteten av renhold god synlighet er avgjørende. Derfor kan ND filter tas ut for korte perioder av ca 20 s for flere ganger.

Ved søknad noen overtrykk, cellen kroppen "flaps" litt. Dette bidrar bedømme kvaliteten av renhet. I ventrale nerve ledningen kontrasten er svært lav, og bevegelse kan være svært nyttig å visualisere celler. Elektrodeholderen som brukes for rengjøring prosedyren (og også for patch clamping) må være tett tillukket, ellers kontrollert press søknad vil ikke være mulig. Å miste trykket vil forstyrre vellykket fjerning av vev og debRIS og vil hindre giga-forsegling formasjon

I tilfelle in situ patch clamp opptak skal utføres etter rengjøring cellen, være oppmerksom på at det ikke bare er en kappe rundt ventrale nerve ledningen som helhet (som må fjernes for noen patch clamp opptak av noen sentrale neuron av voksne fluer ), men cellene selv kan være omgitt av en kappe i tillegg. MN5, for eksempel, er omgitt av en ikke-cellulær kappe som kan sees bare med kort høyintensitets belysning. I tillegg kan celler bli plassert under luftrøret. I tilfelle cellen ikke kan nås, trachea må trekkes til side hvis ikke dratt av med pipette under rengjøringsprosessen (etter å ha blitt trukket til side). Hele rengjøringsprosedyren må gjøres uten å trekke vevet for mye. Denne prosedyren vil kreve trening. Jo bedre rengjøring, desto høyere blir frekvensen av umiddelbare Giga-pakninger (innenfor en s etter berøring av cellen og rellettelser overtrykk).

Avhengig av renhold protokollen og innbruddet i følgende scenarier er mulige: Først, hvis cellene ikke ble renset godt nok, er en giga-forsegling ikke er mulig og eksperimentet må avbrytes. Sekund, i noen tilfeller rengjøring er god nok for giga seal formasjon men en tynn, knapt synlig rest av kappen forblir rundt soma. Dette vil føre til at membranen til å sprekke og forårsake lekkasje strømninger av forskjellige amplituder. En mindre alvorlig konsekvens av utilstrekkelig celle rengjøring er at noen rester av kappen årsaken øker i access motstand. Avhengig av eksperimentell design forskjellige kvalitetskriterier for oppdateringen kan gjelde. For overvåking aksjonspotensial mønstre i strømtang membranen potensialet av cellen må være sunn (-55 mV eller mer hyperpolariserte i tilfelle av MN5), men tilgang motstand er ikke så viktig sak. Men når fremkaller aksjonspotensialer av nåværende injeksjon tilgang remotstand blir et problem. For fremkaller stor amplitude kaliumstrøm som stammer nær opptaket nettstedet lekkasjen skal være liten (i tilfelle av MN5 inngangsmotstand must av høyere enn 80 MΩ) og adgang motstanden bør ikke være større enn 15 MW. For plassen klemmen som er nødvendig i spenning klemme innspillinger av liten amplitude dendrittiske kalsium strømninger som stammer på ganske litt avstand fra soma ingen lekkasje kan introduseres (for MN5 inngangsmotstand må være over 120 MΩ) og adgang motstand kan ikke være høyere enn 12 MW. I de fleste innspillinger måler vi kalsium strømmer med tilgang motstand mellom 8 og 10 MO (som leses fra skiven på axopatch 200B forsterker etter seriemotstand og hele celler kapasitans kompensasjon). For hver celle for å bli registrert, må slike kvalitetskriterier fastsettes individuelt.

Bruke rengjøringsprosedyren beskrevet her, kan vi holde opptakene stabile for approximately 90 minutter. Vi ikke observerer betydelig kjøre ned (spesielt testet for Cav2 og Cav3 kalsium strømmer og for Shaker, Shal, og forsinkende korrigerende kaliumstrømmene). Imidlertid har vi ikke forsøkt å holde plasteret lengre og kan derfor ikke opplyse om lengre opptak ville være mulig.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protease type XIV	Sigma Aldrich USA	P5147
Microfil flexible injection needle	World Precision Instruments USA	MF28G-5
Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament	World Precision Instruments USA	PG52151-4
DiI	Invitrogen USA	D3899
Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning)	www.ellsworth.com	184 SIL ELAST KIT
ND filter set (unmounted)	Chroma Technology Corp.	22000b series
Electrode holder 1-HL-U	Molecular Devices	1-HL-U