Summary
En el parche situ clamp grabaciones se utilizan para la caracterización electrofisiológica de las neuronas en los circuitos intactos. En el modelo genético de Drosophila sujeción parche es difícil porque el SNC es pequeño y rodeado por una vaina robusta. En este artículo se describe el procedimiento para retirar las neuronas vaina y limpia para posteriores grabaciones de patch clamp.
Abstract
Los tiempos cortos de generación y fáciles técnicas genéticas que la mosca de la fruta Drosophila melanogaster un excelente modelo genético fundamental en la investigación en neurociencias. Los canales iónicos son la base de todo el comportamiento ya que median en la excitabilidad neuronal. El canal primer voltaje de iones cerrada clonado fue el canal de potasio voltaje Drosophila cerrada Shaker 1,2. Hacia la comprensión del papel de los canales iónicos y la excitabilidad de la membrana para la función del sistema nervioso es útil combinar poderosas herramientas genéticas disponibles en Drosophila in situ con grabaciones de patch clamp. Durante muchos años, estas grabaciones se han visto obstaculizados por el pequeño tamaño de las CNS Drosophila. Además, una funda robusta hecha de colágeno y células gliales constituyen obstáculos para el acceso parche pipeta a las neuronas centrales. La eliminación de esta vaina es una condición previa necesaria para las grabaciones de patch clamp de cualquier neurona en el adulto CNS Drosophila. En los últimos añoslos científicos han sido capaces de llevar a cabo in situ patch clamp grabaciones de las neuronas en el cerebro adulto y 3,4 cordón nervioso ventral embrionario de 5,6, 7,8,9,10 larval y adulto de Drosophila 11,12,13,14. Un establo giga-sello es la principal condición previa para un buen parche y depende del contacto limpio de la pipeta de parche con la membrana celular para evitar corrientes de fuga. Por lo tanto, para la célula completa in situ grabaciones de patch clamp de neuronas adultas de Drosophila se debe limpiar a fondo. En el primer paso, la vaina ganglionar tiene que ser tratada enzimáticamente y eliminar por medios mecánicos para hacer las células diana accesible. En el segundo paso, la membrana de la célula tiene que ser pulido para que ninguna capa de material de glia, colágeno u otro puede perturbar giga-sello formación. En este artículo se describe cómo preparar una neurona identificado central en el cordón nervioso ventral Drosophila, el vuelo de las motoneuronas 5 (MN5 15), para somática toda cell grabaciones de patch clamp. Identificación y visibilidad de la neurona se consigue mediante la expresión dirigida de GFP en MN5. Nuestro objetivo no es explicar la técnica de patch clamp en sí.
Protocol
La siguiente descripción no es específico para una motoneurona. Puede ser utilizado con cualquier neurona. En este ejemplo, se utiliza el vuelo motoneuron 5 (MN5) que inerva las dos fibras dorsalmost del dorsolongitudinal músculo depresor del ala (DLM). Para identificar y visualizar MN5 usamos el sistema UAS/GAL4 para expresar GFP en las neuronas motoras de vuelo (y pocas otras neuronas).
1. Disección de adultos Drosophila para acceder a la parte dorsal del cordón nervioso ventral (VNC)
- Diseccionar un adulto lado Drosophila dorsal a lo largo de su línea media dorsal en un plato Petri revestido sylgard (35 mm de diámetro) como se describe en Ryglewski y Duch (2009 13). Una película de esta disección está disponible en línea a través de Jove (Boerner y Godenschwege 16. A continuación se presenta una breve descripción de la disección.
- Las moscas adultas se anestesian por enfriamiento en hielo durante aproximadamente 1 min. Esto puede ser logrado por enfriamiento previo un vial mosca vacía (sin comida)en el hielo y la colocación de la mosca en el vial ya frío. Alas y las patas se eliminan con un par de tijeras.
- La mosca es entonces fijado lado dorsal en un plato Petri revestido sylgard (se utiliza la tapa de una placa de Petri de 35 mm llena hasta el borde con Sylgard; las Figuras 1A, B) con un anillo de plástico (diámetro interno de 9 mm, 1,3 mm de espesor ) pegado a la sylgard con vaselina.
- El uso de la tapa de una placa de Petri de 35 mm facilita el acceso a la VNC con una pipeta de parche bajo visualización con un objetivo de inmersión de agua. Esto ayuda a introducir la pipeta superficialmente sin tocar la pared de la cápsula.
- El anillo de plástico se pueden hacer por perforación de un agujero en una lámina de plástico delgada (usamos 1,3 mm de espesor). Usamos un cortador de alambre para definir el perímetro exterior del anillo de manera que se ajuste el plato.
- Sumergir la mosca en solución salina normal (Figura 1C; composición de la solución salina en mM: NaCl 128, KCl 2, CaCl 2 1,8, MgCl 2 4, HEPES 5, sacarosa ~ 35 depending en la osmolalidad de la solución, el pH se ajustó a 7,25 con NaOH 1 M, se ajusta la osmolalidad a 290 mOsm con sacarosa).
- El animal se diseca a lo largo de la línea media dorsal, y los grandes músculos dorsales vuelo longitudinales se extienden lateralmente y cubrió a exponer intestino, el esófago y la parte de abajo de VNC. Después de la eliminación del intestino y el esófago, el VNC está expuesto (Figura 1D).
- Opcionalmente, la mosca se puede decapitado en este paso (Figura 1E). Extracción de la cabeza hace que el acceso a la enzima y pipetas de parche más conveniente, y MN5 dendritas no se alteran cuando se limpia el soma (dendritas son posteriores al soma, Figuras 2B, C). Sin embargo, la cabeza también se puede dejar intacto cuando lo requiera el diseño experimental (por ejemplo, el estudio de descender de entrada a las motoneuronas torácicos). En este caso, la pipeta puede ser introducida desde posterior o lateral (Figura lateral, 2A).
- Para un rápidointercambio de solución salina durante los experimentos que el volumen de la cámara de grabación se reduce al mínimo mediante la colocación de un anillo de plástico (diámetro interno de 9 mm) alrededor del animal disecado y encolado al plato con vaselina (Figuras 1A, B; volumen de la cámara de grabación es de ~ 200 l) .
- La preparación se monta en un montante fijo microscopio de fluorescencia etapa (utilizamos Zeiss Axioskop 2 FS plus, Zeiss, Alemania) y se observaron con un alto NA (> 0,75), larga distancia de trabajo (> 2 mm), objetivo 40x de inmersión de agua. El sistema de perfusión (solución salina en, solución salina-out), el cable de tierra y la pipeta de enzima se inserta en la cámara de grabación (Figuras 1F - J, L).
2. Visualización de MN5 (Vea las Figuras 2 y 3), Jefe Off
- Monte la placa de Petri en un microscopio de epifluorescencia etapa vertical fijo.
- Coloque el plato con la mosca en ella de modo que la parte anterior se orienta al lado donde el soporte del electrodo esmontado (Figura 1).
- Utilice un gran aumento (40x o superior), lente de agua de alta inmersión NA (NA 0,75 o superior) y un filtro de buenas prácticas agrarias para iluminar el VNC. Para una buena visualización de la célula durante la limpieza se utiliza agua de inmersión 40x lentes con un NA de cualquiera de 0,8 (Olympus LUMPlanFl 40xW), o una NA de 0,75 (Zeiss W N-Achroplan 40x/0.8 M27). Para un buen acceso con el parche pipeta la distancia de trabajo debe ser de 2 mm o mayor.
- Tanto MN5 se encuentran en el neuromere mesotorácicos en la superficie dorsal del ganglio cerca de la línea media entre - y, posiblemente, cubierta en parte por - tráquea prominente (figuras 2 y 3). MN5 con sus dendritas aparecen como un área verde difuso. El somata ser más clara después de la limpieza. Sin embargo, sus dendritas no aparecerá agudo, pero siguen siendo borrosa debido a que todavía se está cubierto por tejido (Figuras 2A, B).
- En nuestra configuración se utiliza una fuente de HBO 100 de fluorescencia de luz en el que no puedes modificarcificar la intensidad de salida de luz. Nosotros usamos filtros de densidad neutra para evitar la sobre-exposición del tejido a la luz fluorescente demasiado, especialmente luz azul. Esto puede causar daños foto y finalmente matar las células. Nuestro método de densidad neutra de 0,8. No blanqueo debe ocurrir durante el curso del procedimiento de limpieza. Si blanqueamiento ocurre, lo más probable la salida de luz es demasiado fuerte. La célula es foto dañado.
- Si la iluminación LED se utiliza los ajustes de intensidad tendrá que ser determinado por el experimentador. La decoloración es un signo de daño solar y debe ser evitado.
3. Método alternativo para la visualización de MN5
Para nuestra aplicación, es importante tener la celda marcada, por ejemplo con la expresión específica de GFP. Alternativamente, DiI, un colorante lipófilo, puede ser utilizada para etiquetar retrógradamente esta neurona. En este caso, cristales de tinte se inserta en el músculo de vuelo utilizando un insecto pasador minutien, y la herida se cierra usando UV pegamento de curado.
- Hacer una solución madre disolviendo un Dil Dil pocos cristales (ninguna cantidad específica) en 100 l de etanol 70%. Esta solución se puede mantener a -20 ° C hasta su uso arriba. La congelación y descongelación repetida no es un problema.
- 5 l de la solución luego se pipeteó en una hoja de la cubierta sin tratar. Esperar hasta que el etanol se ha evaporado. Esto toma sólo unos pocos minutos.
- Colocar una mosca en un vial pre-enfriado (por pegar en hielo) y se enfría durante un corto período de tiempo (por debajo de 1 min) en hielo. Coloque la mosca frío anestesiaron en una placa de refrigeración en un estereomicroscopio de disección.
- Centro de la marcha y mantenerlo en su lugar de modo que no puede dejar de lado fácilmente al ser pinchado con un alfiler minutien.
- Utilizar dos pinzas, una para sujetar el pasador minutien, la otra para sostener la mosca abajo.
- Use pinzas gruesas para mantener un insecto pasador minutien y rayar algunos de los Dil de la hoja de la cubierta de modo que hay un cristal Dil en la punta de la clavija minutien (utilizando elcubreobjetos mismo y el mismo lugar en que la cobertura de deslizarse cada vez que ayuda a conseguir más tinte en el pin cada vez que se realiza el procedimiento). El pasador no debe ser demasiado puntiagudo, podría doblar más fácilmente y es entonces difícil de usar.
- A continuación, la punción de un orificio en el centro del tórax dorsal de la mosca con el pasador minutien con Dil en la punta. Las dos fibras dorsalmost musculares del vuelo dorsolongitudinal (DLM, las fibras musculares 5 y 6 en cada lado) están inervados por MN5. Por lo tanto, la colocación de cristales de tinte justo en el medio del tórax asegura que tanto MN5 será etiquetado porque ambas 6 fibras musculares de la DLM será herido y conseguir algo de colorante.
- El tinte debe ser colocado directamente debajo de la cutícula. Si el colorante se introduce demasiado profundamente, la mosca puede ser apuñalado o otras neuronas (por ejemplo MN1-4) pueden ser etiquetados así.
- Esto se repite hasta tinte suficiente (esto es una cuestión de práctica y experiencia) se inserta en el tórax
- Dil no es Solub aguale, por lo tanto, que no se disuelve en el citosol del músculo y tendrá que ser "relleno" por debajo de la cutícula.
- Luego, otro pasador minutien se sumerge en una gota de pegamento de curado UV (nos ponemos una gota de pegamento en un recipiente pesado).
- El pegamento que se encuentra ahora en la punta de la clavija minutien se utiliza para cerrar la herida donde los cristales de tinte se inserta.
- Después de la aplicación de un poco de cola (sólo un poco para cerrar la herida, no todo el tórax) una pistola de UV se utiliza para curar el pegamento. Usamos dos intervalos de 10 s de exposición a la luz UV.
- Las moscas tratadas se ponen en los alimentos frescos en un vial con mosca. Asegúrese de que el punto de pegamento sobre el tórax de las moscas no se pegue a las paredes del vial que atrapa la mosca.
- El colorante tiene un par de horas para llegar a la neurona diana. Se desplaza a lo largo de la membrana, no en el citosol, ya que es soluble en lípidos. Tratamos a los animales por la tarde y se dejan durante la noche.
- Experimentos de patch clamp se llevó a cabo el día siguiente. Las neuronas será menos visible en comparación con el uso de GFP expresión genética.
4. Preparación de la pipeta enzima que se utiliza para la limpieza
Es importante para asegurar un flujo constante de solución salina a través de la cámara de registro. Tener la subida y la caída volumen del baño tiene que ser evitada, ya que causa la vibración y compensar los posibles cambios durante los experimentos. Perfusión y aspiración tiene que ajustarse en consecuencia. Esto hace mucho más fácil cambio de solución, que a su vez es importante para la colada rápida de proteasa antes del experimento y el intercambio rápido de agentes farmacológicos durante el experimento.
- Asegurar la perfusión de la cámara de grabación (velocidad de flujo de aproximadamente 2 ml por min). El caudal puede ser regulado ya sea mediante el uso de un grifo o mediante el uso de tubos específicos diámetro (cuanto mayor sea el diámetro, mayor es la tasa de flujo). Tienen el volumen de la cámara tan pequeña como sea posible para garantizar el intercambio rápido de la solución en the cámara. Esto asegura la eliminación rápida de la proteasa y los bloqueadores de la cámara de registro.
- El volumen de la cámara depende de cómo la solución salina hacia fuera (Figura 1) del sistema de perfusión se inserta en la cámara de grabación (cuando el objetivo de inmersión en agua se introduce en el baño).
- Asegúrese de que la salida de solución salina se coloca en una forma que el título de la grabación de la cámara no se eleva y cae constantemente (succión, subida, aspiración, aumento), pero permanece constante (constante de succión). Nos determinar perfusión constante y estable por el sonido constante, nunca interrumpido gorgoteo que se produce constantemente por succión salina fuera de la bañera.
- Como solución salina en y fuera que utilizan agujas hipodérmicas que están dobladas y conectado a tubos estrechos y se coloca cerca de la cámara de registro utilizando plastilina (Figura 1F).
- Tire un parche pipeta y romper la punta un poco bajo control visual. Use unas pinzas finas limpias. Al visualizar el unde pipetar de la lente de inmersión en agua 40x el diámetro de punta de la pipeta debe ser de aproximadamente entre 40 y 70% del diámetro del soma de la célula. Consejos muy grande (aproximadamente célula diámetro o más) también se puede utilizar, sin embargo, la probabilidad de rasgar el cuerpo de la célula aumenta, debido a las fuerzas capilares de la pipeta. Es la pipeta muy pequeño (menos de 10% del diámetro del soma), se obstruye fácilmente que da lugar a tener que utilizar uno o más pipeta nueva (s) durante el procedimiento de limpieza.
- Llenar la pipeta con 2% de proteasa en tampón de PBS o solución salina sin obstruirlo.
- Inserte la pipeta enzima en el soporte del electrodo. Para asegurar un control adecuado de la presión aplicada, el titular necesita ser cerrado herméticamente.
- Adjuntar un tubo a la salida pequeña en el soporte de pipetas y fijarlo en una forma que tirando del extremo libre de la tubería no afecta a la pipeta que se ha insertado en el soporte de la pipeta. Verifique si hay movimiento en el microscopio.
- Inserte un p plástico ipette punta (del tipo que se usa con una pipeta automática, se utilizan los azules 1000 las mu l, pero esto es una cuestión de preferencia. Otros tamaños pueden ser utilizados también) o una jeringa con un martillo en el extremo libre de la tubería para ser capaz de aplicar presión positiva y negativa a la pipeta enzima / parche. Se aplica presión positiva por cualquiera de soplado en la punta de la pipeta (usándolo como una pieza de la boca) o empujando la jeringa hacia abajo. La presión negativa se aplica por aspiración (con la boca usando la pieza de la boca) o tirando de la jeringa.
- El propósito de las aplicaciones de presión positiva y negativa es para aflojar y remover las células y restos que rodea las células bajo investigación. La presión positiva se expulsará enzima de la pipeta de la limpieza y soplar fuera de la superficie del SNC. La presión negativa se utiliza para aspirar residuos de la VNC (como una aspiradora).
5. La limpieza de las buenas prácticas agrarias de etiquetado MN5 (Figura 3 y vídeo)
contenido "> Nota al lector: Imágenes de MN5 antes y después de la limpieza son difíciles de distinguir en la Figura 3 Esto es lo que obtienes en la vida real Tomará un poco de entrenamiento para aprender a distinguir las sutiles diferencias entre limpiar y no limpiarse.. neuronas. Tenga en cuenta que estas diferencias sutiles se puede ver mejor en las imágenes en movimiento. Por lo tanto, la película proporciona una mejor impresión que las imágenes estáticas (Figura 3).- Visualice la enzima lleno pipeta bajo la lente de 40x de inmersión de agua con luz brillante (Figura 3B, flecha blanca).
- Centrarse en la punta de la pipeta. Si está obstruido, trate de sacar la suciedad mediante la aplicación de presión positiva o negativa. Si la suciedad no sale, preparar una nueva enzima llena la pipeta.
- Cambie a la luz fluorescente (Figura 3A).
- Bajar la pipeta enzima cuidadosamente y volver a enfocar hasta que el cuerpo de la celda puede ser visto.
- Cuando la pipeta enzima está cerca de lacuerpo celular, cambiar la perfusión apagado.
- Aplicar presión positiva en ráfagas cortas hacia el cuerpo de la célula de modo que todo lo que se obstaculiza el acceso a la celda se aflojará. Esto tiene que hacerse hasta que el tejido que rodea el cuerpo de la célula se suelta.
- También mover la pipeta enzima dorsalmente para atrapar los residuos sueltos que puede ser un sobrante de la vaina que rodea la ganglionar VNC. Puede que haya sido eliminado ya por la disección antes de montar la preparación en el microscopio (esto no siempre es el caso).
- Con alternancia de aplicación de presión positiva y negativa, utilizar la pipeta enzima como un aspirador de vacío y alrededor del cuerpo de la célula. No es necesario aflojar el cuerpo de la célula entera completamente. Limpieza de la parte anterior del soma hará (o la parte posterior o lateral dependiendo de qué lado de la pipeta se acerca a la soma).
- Este procedimiento de limpieza se lleva a cabo hasta que la membrana se ve libre de residuos.
- La membrane es limpio cuando no hay "sombra" o el contraste difusa entre la célula y del tejido circundante cuando se ve con luz fluorescente solo. Esto se puede ver mejor con la luz azul de alta intensidad. Por lo tanto, aumentar la intensidad de la luz por un momento (que quitar los filtros de densidad neutra para lograr eso). Tenga en cuenta que una amplia exposición de luz azul a lo dispuesto por una bombilla normal HBO 100 mercurio puede causar daño por luz dentro de aproximadamente un minuto. Esto dará lugar a la señal de GFP a desaparecer a medida que las células mueren.
- Cambie a la luz brillante y eliminar las células y los desechos que no se podían ver con luz fluorescente. Tenga en cuenta que la visualización de la tráquea y el estado de limpieza se pueden beneficiar de cambio entre la luz brillante y la luz fluorescente.
- Cuando el procedimiento de limpieza ha finalizado y el cuerpo de la celda aparece limpia, cambiar el sistema de perfusión de nuevo (hacerlo también si el procedimiento de limpieza dura más de 3 a 5 minutos y continúe limpiando con perfusión continua) y la luz.
- Enjuague la célula for ~ 15 a 20 min con solución salina o la solución que se usará para la siguiente aplicación. No menos de 40 ml debe ir a través de la cámara de grabación para asegurarse de que la proteasa se lava. Restos de proteasa en la superficie celular causará la muerte celular súbita durante la abrazadera grabaciones de otra manera estables de parches.
6. Electrofisiología
- Convencional in situ abrazadera conjunto parche de células en tensión de la abrazadera y el modo de abrazadera de corriente se lleva a cabo utilizando un amplificador Axopatch 200B (Molecular Devices, EE.UU.); señales se digitalizan usando una Digidata 1320 (Molecular Devices, EE.UU.) y se analizaron con software pClamp 10,2.
- Pipetas de parche se sacó de borosilicato capilares de vidrio con una vertical extractor de pipeta (Narishige, PC-10).
- Pipeta resistencias punta son entre 5,8 y 6,2 mW (pinza de corriente de potasio y grabaciones actuales) y entre 2,8 y 3,5 mW (para grabaciones actuales de calcio), respectivamente. Resistencia punta dependesoluciones intra y extracelular utilizado (para más detalles véase 13, 14).
7. Los resultados representativos
Después de que el procedimiento de limpieza tanto MN5 están listos para in situ abrazadera conjunto parche de células (Figura 3). La siguiente sección muestra representativa fijación de voltaje y corriente con la pinza como huellas grabadas desde MN5 soma después de usar el procedimiento de limpieza descrito. MN5 expresa una variedad de voltaje canales iónicos (ver también 13,14). Se muestra un ejemplo de la tensión de las corrientes de calcio cerrada (Figura 4), la tensión de las corrientes cerradas potasio (Figura 5) y los rastros del potencial de acción (Figura 6). Calcio voltaje cerrada y las corrientes de potasio fueron evocados por protocolos de voltaje similares, pero las soluciones que se han utilizado diferentes con el fin de permitir que sólo los canales de iones bajo investigación para el paso de corriente (para más detalles véase 13,14). Todos los demás voltaje mayor ch ion cerradaAnnels han sido bloqueados (canales de sodio voltaje cerradas con tetrototoxin nM 100 - pipeteadas directamente en el baño, la perfusión se detuvo durante dos minutos - canales de calcio con 500 cadmiumchloride mu M, canales de potasio con 2 mm 4-aminopiridin (4-AP) y 30 mM mM tetraethylammoniumchloride extracelularmente y 0.5 4-AP, 20 tetraethylammoniumbromide mM y 144 mM cesiumchloride intracelularmente a través de la solución de parche intracelular en la pipeta de patch (para más detalles véase 13,14). rastros potenciales de acción fueron evocados por inyección de corriente en el soma MN5 (Figura 6) sin el uso de los bloqueadores de los canales de iones 12.
Figura 1. La configuración de limpieza. La mosca está inmovilizado en una tapa sylgard recubierto de una placa de Petri de 35 mm en el que nos pegan un anillo de plástico (diámetro interior de 9 mm, 1,3 mm de espesor) wi-ésimo vaselina (A, B). Después de sumergir la mosca en solución salina (C) que se abre a lo largo de la línea media dorsal. Gut y el esófago se retira para exponer el cordón nervioso ventral (D). Para una mejor accesibilidad de la torácica neuromere la cabeza se retira (E). Después de montar la preparación en un microscopio de epifluorescencia vertical, el sistema de perfusión (F, G, solución salina, solución salina-en-hacia fuera, flechas blancas de la izquierda), así como el cable de tierra se ponen en posición (F, G, flecha blanca la derecha). La enzima de limpieza pipeta llena se pone en posición después de que el objetivo de inmersión en agua (40x, NA 0,8) se ha reducido en el baño (H). Para mayor claridad lo demostramos ya antes de que el objetivo se ha reducido (F, G, flecha blanca a la derecha). El ángulo en el que la pipeta enzima que está sostenido por un soporte 1-HL-U electrodo (J) está entrando en la cámara de registro es importante ya que la pipeta no debe tocar tanto el objetivo y el anillo de plástico. Este ángulo varía de configuración para la instalación. Aquí es de aproximadamente 30 ° (ver dibujo en el J, K flecha). La disposición de la pipeta en el soporte que está unido a un headstage se muestra en (L). El headstage está unido a un micromanipulador motorizado. Haga clic aquí para ampliar la cifra .
Figura 2. MN5 en el cordón nervioso ventral. MN5 pueden ser fácilmente identificados por su ubicación en el cordón nervioso ventral de Drosophila (VNC) cuando está genéticamente GFP expresado por el uso de neuronas motoras específicas GAL4 conductores (A). El rectángulo de puntos representa el neuromere torácica. Para tener una idea de cómo los tamaños se relacionan entre sí, se muestra una pipeta de patch limpieza acercarse a la izquierda MN5 desde el lado izquierdo del músculo vuelo dorsolongitudinal. Para una mejor visualización, la pipeta de parche estaba llena de un colorante rojo (dextrano-tetrametilrodamina, A). El contralateralralmente proyectar MN5 se encuentran en la superficie dorsal de la neuromere mesotorácicos de la VNC en cada lado de la línea media (vista de proyección de una pila de imágenes confocal en B). La proyección ipsilateral MN1-4 se encuentran más lateralmente y anteriormente relacionado con MN5 (flechas en B). El círculo de puntos entre ambos MN5 representa las dendritas de las neuronas motoras de vuelo en la neuropil incluyendo MN5 (B). Etiqueta GFP en (B) se mejoró mediante tinción inmunohistoquímica con un anticuerpo contra GFP. Los detalles de MN5 morfología se hacen visibles al llenado de la neurona intracelularmente (iontoforéticamente) con el invisible neurobiotin trazador y posterior adquisición de imagen confocal (C). La tinción se hizo visible con estreptavidina acoplada a un fluoróforo. Barra de escala es de 30 m.
Figura 3. MN5 limpieza antes y después. Visualización de MN5 se logra mediante la expresión de GFP utilizando el UAS/GAL4sistema (A, C, ver etiqueta). MN5 antes (A, B) y después (C, D) el procedimiento de limpieza. Parte izquierda de cada cuadro representa anterior, lado derecho representa posterior. Las neuronas que va a grabar se limpian con una pipeta de proteasa parche llena con una punta rota. La pipeta enzima es sólo ligeramente visible (A, B, ver etiqueta). Insertado en una muestra una ampliación de la parte inferior MN5 con la pipeta enzima acercarse a la célula. MN5 no puede ser visto en luz brillante antes de que el procedimiento de limpieza (B). Tráquea necesitan ser removidos si cubren las células bajo investigación. Después de que el procedimiento de limpieza, el contraste entre la célula y el tejido circundante es más quebradizo (C, inferior MN5), y la célula se puede ver ahora en luz brillante (D). La punta de la pipeta se puede ver más claramente cuando se utiliza luz brillante. La ampliación representa el área en el cuadrado punteado con MN5 fronteras celulares del cuerpo rodeado con una línea de puntos para una mejor identificación. Visualización en luz brillante a menudo ayuda a juicio de la limpieza.
Figura 4. La corriente de calcio en MN5. Grabación Ejemplo de corrientes de células enteras de calcio como se registra desde MN5. Al menos dos corrientes diferentes de calcio se muestran, una tensión baja transitoria de calcio activado y un calcio sostenido voltaje de alta corriente. Las corrientes fueron evocados a partir de un potencial de mantenimiento de -90 mV. Pasos de voltaje de -90 mV a +20 mV se aplicaron. Los bloqueadores fueron utilizados para bloquear los canales iónicos mayoría de los otros. Los artefactos fueron omitidos por claridad (para la caracterización de las corrientes de calcio MN5 ver Ryglewski et al., 2012).
Figura 5. Corrientes de potasio en MN5. Ejemplo de grabación enteras corrientes celulares de potasio como grabados de MN5. Las corrientes que se muestran incluyen calcio activados corrientes de potasio, ya que no los antagonistas del calcio se aplicaron. Las corrientes fueron evocados de una explotaciónpotencial de -90 mV para el potasio corriente total (A) o desde un potencial de mantenimiento de -20 mV para inactivar los transitorios corrientes de potasio y mostrar solamente el potasio sostenida actual (B). Pasos de voltaje de -90 mV a +20 mV fueron aplicados en incrementos de 10 mV. Desconectado sustracción de las corrientes de potasio como evocado desde un potencial de mantenimiento de -90 mV (A) y -20 mV (B) revelan puras corrientes de potasio transitorios (C). Tensión gated canales de sodio fueron bloqueadas. Los artefactos fueron omitidos para mayor claridad (para la caracterización de MN5 voltaje y las corrientes de calcio potasio ver Ryglewski y Duch, 2009).
Figura 6. Disparando patrón exhibido por MN5. Ejemplo de grabación de patrones de activación como provocados por inyecciones en MN5 somáticos actuales (0,4 nA, negro, 0,5 nA, gris) de 200 ms de duración. Potencial de membrana en reposo fue -59 mV. No hay bloqueadores de los canales de iones se utilizaron. (Para análisis de control de corriente de disparo MN5patrones ver Duch et al., 2008).
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Discussion
Cuando la visualización de las células con proteínas fluorescentes como GFP, es importante no sobre-exponer la preparación de un exceso de luz. Esto puede resultar en el daño por luz. Nosotros utilizamos bombillas de 100W HBO cortos de arco de mercurio para la iluminación, y también utilizamos densidad neutra (ND) de 0,8 (Chroma filtros ND de 0,3 y 0,5). Para ser capaz de juzgar la calidad de la visibilidad de limpieza es crucial. Por lo tanto, filtros ND se puede eliminar por períodos cortos de aproximadamente 20 s para varias veces.
Al aplicar un poco de presión positiva, el cuerpo de la célula "flaps" un poco. Esto ayuda a juzgar la calidad de la limpieza. En contraste cordón nervioso ventral es muy baja, y el movimiento puede ser muy útil para visualizar las células. El soporte del electrodo que se utiliza para el procedimiento de limpieza (y también para la técnica de patch clamp) necesita ser cerrado herméticamente; aplicación controlada de otro modo la presión no será posible. Perder presión moleste a lograr la supresión de los tejidos y debris y evitará giga-seal formación
En el caso en las grabaciones de patch clamp in situ se realiza después de la limpieza de la célula, tenga en cuenta que no sólo hay una vaina que rodea el cordón nervioso ventral como un todo (que debe ser eliminado por cualquier grabación de patch clamp de cualquier neurona central de moscas adultas ), pero las células en sí puede estar rodeado por una vaina también. MN5, por ejemplo, está rodeado por una vaina no celular que se puede ver sólo con iluminación breve de alta intensidad. Además, las células pueden estar situados debajo de la tráquea. En caso de que la célula no se puede acceder, la tráquea que se llevó a un lado si no timo con la pipeta durante el procedimiento de limpieza (después de haber sido sacado a un lado). El procedimiento de limpieza general necesita ser hecho sin tirar el exceso de tejido. Este procedimiento requiere entrenamiento. Cuanto mejor es la limpieza, mayor será la frecuencia de inmediatos giga-sellos (dentro de 1 s después de tocar la célula y RELaliviando la presión positiva).
Según el protocolo de limpieza y la ruptura en los siguientes escenarios son posibles: En primer lugar, si las células no se limpiaban muy bien, un giga-sello no es posible y el experimento debe ser terminado. En segundo lugar, en algunos casos, la limpieza es lo suficientemente bueno para giga-sello formación, pero un remanente delgada, apenas visible de la vaina permanece alrededor del soma. Esto hará que la membrana de romperse y causar corrientes de fuga de amplitudes diferentes. Una consecuencia menos grave de la limpieza insuficiente de células es que algunos restos de la vaina causa aumentos en la resistencia de acceso. En función de los criterios de diseño experimental de calidad diferentes para el parche puede aplicarse. Para el seguimiento de patrones de acción posibles en pinza de corriente del potencial de membrana de la célula debe estar sano (-55 mV o más hiperpolarizado en el caso de MN5), pero la resistencia de acceso no es un asunto tan importante. Sin embargo, al evocar potenciales de acción por re actual acceso inyecciónresistencia se convierte en un problema. Para evocar grandes corrientes de potasio de amplitud que se originan cerca del sitio de la fuga de grabación debe ser pequeña (en el caso de MN5 resistencia de entrada debe por mayor que 80 mW) y la resistencia de acceso no debe ser mayor que 15 mW. Para la abrazadera de espacio que se necesita en las grabaciones de fijación de voltaje de las corrientes de pequeña amplitud de calcio dendríticas que se originan a bastante distancia del soma ninguna fuga se puede introducir (por MN5 resistencia de entrada debe ser superior a 120 mW) y la resistencia de acceso no puede ser superior a 12 mW. En la mayoría de las grabaciones medimos las corrientes de calcio con resistencias de acceso entre 8 y 10 MW (como leído sobre la escala del amplificador Axopatch 200B después de la resistencia serie y capacitancia de compensación de células enteras). Para cada tipo de célula para ser grabados, tales criterios de calidad debe determinarse individualmente.
Utilizando el procedimiento de limpieza descrito aquí, podemos mantener las grabaciones estables para la aproximaciónTely 90 minutos. No se observa una considerable decadencia (en concreto la prueba de CAV2 y CAV3 corrientes de calcio y de Shaker, Shal, y retrasó las corrientes de potasio rectificador). Sin embargo, no hemos tratado de mantener el parche más largo y por lo tanto no se puede afirmar si grabaciones más largas sería posible.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 | |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 | |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 | |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 | |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT | |
| ND filter set (unmounted) | Chroma Technology Corp. | 22000b series | |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
References
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