Summary
その場でパッチクランプ記録をそのまま回路内の神経細胞の電気生理学的特性評価のために使用されます。中枢神経系が小さく、堅牢な鞘に囲まれているため、ショウジョウバエ遺伝モデルパッチクランプ法では困難である。この記事では、後続のパッチクランプ記録用のシースときれいなニューロンを削除する手順について説明します。
Abstract
短い世代時間と容易な遺伝学的手法は、 ショウジョウバエの基本的な神経科学の研究に優れた遺伝的モデルを作る。彼らは神経細胞の興奮性を媒介するので、イオンチャネルは、すべての行動の基礎となるものです。クローニングされた第一の電圧依存性イオンチャネルは、 ショウジョウバエの電位依存性カリウムチャネルシェーカー1,2だった。神経系の機能のためのイオンチャネルと膜興奮性の役割を理解することに向かって、それはその場でパッチクランプ記録内でショウジョウバエの遺伝可 能な強力なツールを組み合わせることが有用である。長年にわたり、このような録音がショウジョウバエ中枢神経系の小型によって妨げられた。また、グリア細胞とコラーゲンから作ら堅牢なシースは中枢神経へのパッチピペットのアクセスのための障害を構成した。このシースの除去が成人ショウジョウバエ中枢神経系内の任意の神経細胞からパッチクランプ記録のために必要な前提条件である。近年の科学者たちは、成人の脳3,4と5,6胚、幼虫7,8,9,10、および成体ショウジョウバエ 11,12,13,14の腹側神経索のニューロンから現場パッチクランプ記録で行うことができました。安定したギガシールは良いパッチのための主要な前提条件であるとリーク電流が流れるのを回避するために、細胞膜とパッチピペットのきれいな接触に依存します。したがって、成人のショウジョウバエのニューロンから in situパッチクランプ記録で全細胞を徹底的に洗浄しなければならない。最初のステップでは、神経節シースは酵素的に処理する必要があり、機械的に標的細胞にアクセスできるようにするために削除されます。第二段階では、細胞膜は、グリア、コラーゲンまたは他の材料のない層はギガシール形成を邪魔しないことができるように研磨する必要があります。この記事では、体全体のcに対してショウジョウバエ腹神経索、飛行運動ニューロン5（MN5 15）で特定された中枢ニューロンを準備する方法について説明しますエルのパッチクランプ記録。ニューロンの同定と可視性がMN5におけるGFPの発現を標的とすることにより達成される。我々は、パッチクランプ法自体を説明することを目的としない。
Protocol
以下の説明は、1運動ニューロンに特異的ではない。これは、任意のニューロンを使用することができます。この例では、dorsolongitudinal主翼下制筋（DLM）の2 dorsalmost繊維を神経支配する運動ニューロン飛行5（MN5）を使用します。 MN5を識別し、視覚化するために、我々は飛行運動ニューロン（および他のいくつかの神経細胞）にGFPを発現するUAS/GAL4システムを使用しています。
1。腹神経索の背部分にアクセスするアダルトショウジョウバエの郭清（VNC）
- Ryglewskiとダッチ（2009 13）で説明したようにSYLGARDコーティングされたペトリ皿（直径35mm）でその背側正中線に沿って大人のショウジョウバエの背側を上にして解剖する。この清の映画はJoveの（BoernerとGodenschwege 16を介してオンラインで入手可能です。以下解剖の簡単な説明です。
- アダルトハエは約1分間、氷上で冷却することにより麻酔する。これは、予冷空飛ぶバイアル（食品の有無に関係なく）することによって達成することができる氷の上で、すでに冷えたバイアルにフライを置く。翼と脚ははさみで除去されます。
- プラスチックリング（内径9ミリメートル、厚さ1.3ミリメートルで、フライは、その後、（ 図1A、Bの我々はSYLGARDとリムに満ち35mmペトリ皿の蓋を使用してください）SYLGARDコーティングされたペトリ皿に背側を上にして固定されている）ワセリンでSYLGARDにくぎ付け。
- 35ミリメートルペトリ皿のふたの使用は水浸レンズを用いた可視化の下でのパッチピペットでVNCへのアクセスを容易にします。これは皿の壁に触れることなく、浅くピペットを導入するのに役立ちます。
- プラスチック製のリングは、薄い（私たちは1.3ミリメートルの厚さを使用します）プラスチックシートに穴をあけることによって行うことができる。我々は、それが皿に合うように、リングの外周を定義するためにワイヤカッターを使用しています。
- 水没生理食塩水のフライ（ 図1C; mMで生理食塩水の組成：NaClを128、KClの2、CaCl 2の 1.8、MgCl 2の 4、HEPES 5〜35 DEPEスクロースソリューションの浸透圧にnding、pHを1M NaOHで7.25に調整され、浸透圧）はショ糖で290 mOsMに調整されます。
- 動物は、背側正中線に沿って切開し、大背側縦飛翔筋は、横方向に引き伸ばされ、腸、食道、およびVNCの下を露出するように固定されます。腸と食道を除去した後、VNCが（ 図1D）公開されています。
- 必要に応じて、フライは、この工程（ 図1E）に断頭することができます。頭を削除すると、酵素とパッチピペットを使用してアクセスがより便利になり、（樹状突起細胞体の後方にあり、 図2B、C）のソーマを清掃するときは、MN5デンドライトは乱されません。実験デザイン（ 例えば胸部運動ニューロンへの入力の降順の勉強）で要求される場合には、頭もそのままにすることができます。この場合、ピペットは後部または横方向（横方向、 図2A）から導入することができる。
- 急速なため実験中に生理食塩水の交換は、記録室の容積と皿に解剖した動物や糊付けその周りにプラスチックリング（内径9ミリメートル）を置くことによって最小化されているワセリン（ 図1A、B、録音室の容積は約200μlである） 。
- 準備は、その後直立固定ステージ蛍光顕微鏡に取り付けた（我々はツァイスAxioskop 2 FSプラス、ツァイスを使用し、ドイツ）と高NA（> 0.75）、長作動距離（> 2mm）を、40倍の水浸対物レンズを使用しております。灌流系（生理食塩水で、生理食塩水アウト）は、アース線と酵素ピペットは、記録室（ - J、L図1F）に挿入されます。
2。 MN5の可視化（ 図2及び図3を参照）、ヘッドオフ
- 直立固定ステージ落射蛍光顕微鏡でシャーレをマウントします。
- 前方部分が電極ホルダーである側を向くように、その中にフライで皿を置きマウントされた（ 図1）。
- VNCを照らすために高倍率（40倍以上）、高NAの水浸レンズNA（0.75以上）とGFPフィルターを使用しています。我々はどちらかの0.8のNA（オリンパスLUMPlanFl 40xW）、または0.75のNA（ツァイスW N-Achroplan 40x/0.8 M27）と40倍の水浸レンズを使用し、洗浄時のセルの良好な可視化のため。パッチピペットとの良好なアクセスのために作動距離は2mm以上でなければなりません。
- ことによると部分的にで覆わ- -著名気管（ 図2及び図3）の両方がMN5間の中間線に近い神経節の背側表面にmesothoracic神経分節に位置しています。それらの樹状突起とMN5はびまん緑色領域として表示されます。細胞体は、洗浄後のより明瞭になる。しかし、それらの樹状突起はシャープに見えるが、まだ組織（ 図2A、B）で覆われ、それらに起因するぼやけたままではありません。
- 我々のセットアップでは、我々はmodができないHBOの100蛍光光源を使用光出力強度をify。我々はあまりにも多くの蛍光灯への組織の過剰暴露、特に青色光を避けるために、NDフィルターを使用しています。これは、光損傷を引き起こす可能性があり、最終的に細胞を殺すでしょう。我々は0.8の中性密度を使用しています。無漂白、クリーニング手順の過程で発生するべきではありません。漂白が発生した場合、最も可能性の高い光出力が強すぎる。セルが破損した写真です。
- LED照明が使用されている場合は強度設定は、実験によって決定しなければならないでしょう。漂白は、光損傷の兆候であり、避けなければなりません。
3。 MN5の可視化のための代替方法
私たちのアプリケーションにとっては、GFPの発現を標的と例えば、細胞が標識しておくことが重要です。別の方法として、DII、親油性染料は、逆行このニューロンを標識するために使用することができます。この場合、染料の結晶が昆虫minutienピンを使用して飛翔筋に挿入され、傷口は、Uを使用して閉じられているVは、接着剤を硬化させる。
- 100μlの70％エタノール中で少数のDIIの結晶（特定の量）を溶解させることによってDIIの原液を作る。使い切るまで、この溶液を-20℃に保つことができる。繰り返し凍結融解することは問題ではありません。
- 溶液5μlを次に未処理カバースリップ上にピペットで入れる。エタノールが蒸発するまで待ちます。これは、ほんの数分かかります。
- 氷の上に短時間（1分以下）のために、あらかじめ冷却したバイアル内のフライ（氷にそれを貼り付けることによって）とクールを置きます。解剖実体顕微鏡下で冷却板上に冷たい麻酔フライを置きます。
- センターでは、フライとminutienピンで突いたときは、これを簡単に追い込まれることができないような場所にそれを保持します。
- フライを押したままにするために2つの鉗子、minutienピンを保持する1つは、他のいずれかを使用します。
- 使用minutienピンの先端（上のDIIの結晶があるように昆虫minutienピンを保持し、カバースリップからDiIの一部に傷を付け粗い鉗子を使用して、非常に同じカバースリップとそのカバーに非常に同じ場所が毎回スリップ）ピンに手続きが行われるたびに、より多くの染料取得するのに役立ちます。ピンは、あまりにもそれがより容易に曲げ、次に使用するのは難しいかもしれませんが、指摘されるべきではない。
- その後、穿刺先端にDIIでminutienピンとハエの背側胸部の真ん中に穴。 dorsolongitudinal飛翔筋（DLMは、それぞれの側の筋肉繊維5と6）の2 dorsalmost筋繊維はMN5によって支配されています。したがって、右胸部の真ん中に染料の結晶を配置すると、MN5両方がDLMの両方の筋線維6が傷つくことになるので、ラベル付けされ、いくつかの染料を入手されることを保証します。
- 染料はキューティクルの真下に配置する必要があります。染料が深すぎる挿入されている場合は、フライは刺されてもよく、または、他のニューロン（ 例えば 、MN1-4）同様にラベルを付けることができた。
- 十分な染料（これは練習と経験の問題である）胸部に挿入されるまで、これが繰り返されます
- DIIは水solubないleは、そのためには筋肉の細胞質ゾルに溶解せず、キューティクルの下に "詰め"されなければならないでしょう。
- その後、別のminutienピンはUV硬化接着剤の液滴（私たちが秤量ボートに接着剤の液滴を入れて）に浸漬される。
- minutienピンの先端に今ある接着剤は染料結晶が挿入された傷を閉じるために使用されます。
- いくつかの接着剤の塗布（傷口を閉じて少しだけ全体ではなく、胸部）の後、UVガンは、接着剤を硬化させるために使用されます。我々は、紫外線暴露の2つの10秒間隔を使用します。
- 処理されたハエはハエバイアル中に生鮮食品に置かれます。ハエの胸部に接着剤スポットがどのトラップハエをバイアルの壁面に付着しないことを確認してください。
- 染料は、ターゲットニューロンに到達するために数時間を必要とします。それは脂溶性であるため、それは細胞質に存在しない、細胞膜に沿って移動する。我々は午後に動物を治療し、一晩そのままにしておきます。
- パッチクランプ実験は、次の日行っています。遺伝的に発現したGFPの使用と比較して、神経細胞が見えにくくなります。
4。クリーニングに使用される酵素ピペットの作製
記録室を通って生理食塩水の定常流を確保することが重要です。風呂ボリュームの立ち上がりと立ち下がりを持つことは、それが振動の原因となり、実験中に潜在的な変動を相殺するように避けなければならない。灌流および吸引に応じて設定する必要があります。これは、順番に迅速に実験中の実験的および薬理学的薬剤の迅速な交換前にプロテアーゼの洗い流すために重要である、溶液交換が容易になります。
- 記録室（分あたり約2ミリリットルの流量）の血流を確保する。流量は、コックを使用するか、または特定の直径のチューブ（大きな直径、高流量）を使用することによって、調節することができる。目の中の溶液の速い交換を保証するために、できるだけ小さくチャンバの容積を持っている電子室。これは録音室からのプロテアーゼとブロッカーの迅速除去を実現しています。
- 室の容積は灌流システムの（ 図1）生理食塩水アウトが記録室（水浸対物レンズは、浴中に降下されている場合）に挿入されている方法によって異なります。
- 生理食塩水アウトはレコーディング室の力価が上昇すると（吸引、上昇、吸引、上昇）常に下がらないように配置されますが、一定に保たれていることを確認します（定常吸引）。私たちは常にお風呂の生理食塩水を吸い出すことにより製造される定数、中断されたことはありませんゴボゴボという音で、安定的かつ安定した血流を決定します。
- 生理食塩水とアウトとして、私たちは曲がって細いチューブに接続されている油粘土を（ 図1F）を使用して、記録室の近くに配置されている皮下注射針を使用しています。
- パッチピペットを引き、少し視覚的なコントロールの下のヒント破る。細かいきれいなピンセットを使用しています。ピペット未定義を可視化するとR 40X水浸レンズピペット先端径は、セルのソーマの直径の間に約40〜70％であるべきである。非常に大きなヒントが（約直径セル以上）を使用することもできるが、細胞体をリッピングする可能性がピペットの毛管力が上昇する。ピペットが非常に小さい（SOMA径の10％未満）の場合は、クリーニング手順中に1つ以上の新鮮なピペット（s）を使用することで、その結果が容易に目詰まり。
- それを詰まらせることなく、PBS緩衝液または生理食塩水で2％のプロテアーゼでピペットを埋める。
- 電極ホルダーに酵素ピペットを挿入します。印加された圧力の適切な制御を保証するために、ホルダーがしっかりと密封する必要があります。
- ピペットホルダーの小さな出口にチューブを取り付け、チューブの自由端に揺さぶると、ピペットホルダに挿入されたピペットに影響を与えないような方法で固定します。顕微鏡下での動きを確認してください。
- どちらプラスチックpを挿入 ipetteチップ（自動ピペッターと共に使用される種類は、我々が青1000μlのものを使用しますが、これは好みの問題です。他のサイズも同様に使用することができます）またはチューブの自由端にコックとシリンジ酵素/パッチピペットに正と負の圧力を適用することができます。正圧はどちらピペットチップ（マウスピースとしてそれを使用して）に吹き付けることによって、またはシリンジを押し下げることにより適用されます。負圧が吸引（マウスピースを用いて口で）によって、またはシリンジを引き抜くことにより適用されます。
- 正と負圧アプリケーションの目的は、細胞や調査中の細胞を取り巻く残骸を緩め、取り除くことです。正圧は、CNSの表面から洗浄ピペットとブロー破片から酵素を排出します。負圧は、VNC（掃除機など）からゴミを吸うために使用されます。
5。 GFPタグMN5（ 図3およびビデオ）のクリーニング
読者へのコンテンツは、 ">注意：清掃前後MN5の画像は、 図3に区別することが困難であるこれは、あなたが実際の生活の中で得るものですそれは掃除と非洗浄の微妙な違いを区別することを学ぶためにいくつかの訓練がかかります。ニューロンは、これらの微妙な違いを利用して画像を移動するには良い見ることができることに注意してくださいますので、ムービーが静的な画像（ 図3）よりも良い印象を提供しています。- 明るい光（ 図3B、白い矢印）で40倍の水浸レンズの下にピペットを埋め尽くした酵素を視覚化します。
- ピペットの先端に焦点を当てる。それが目詰まりしている場合は、正または負の圧力をかけて汚れを取得しようとします。汚れが出てこない場合は、ピペット埋め新しい酵素を準備します。
- 蛍光灯（ 図3A）に切り替えます。
- 細胞体が見られるまで、慎重に酵素ピペットを下げて、再度焦点を当てています。
- 酵素ピペットに近い場合細胞体は、血流をオフにします。
- セルへのアクセスを妨げている、すべてが緩めることができるようになるので、細胞体に向かって短いバーストで正圧を適用します。細胞体の周囲の組織が緩んでくるまで、これが行われなければならない。
- また、VNCを取り囲む神経節鞘から左オーバーかもしれない埃や塵をキャッチするために背酵素ピペットを移動します。これは、（これは必ずしもそうではありません）事前に準備顕微鏡を装着する切開によって既に削除されている可能性があります。
- 正と負の圧力の印加を交互に、細胞体の周りに掃除機、真空のような酵素ピペットを使用しています。それは完全に全体の細胞体を緩める必要はありません。ソーマの前方部分を清掃する（またはピペットがソーマに近づく何側からに応じて後方又は横方向の一部）を行います。
- 膜は異物が見えるまでこのクリーニング手順が行われます。
- membra蛍光のみで見た場合には "影"あるいは細胞と周囲の組織との間の拡散コントラストがないときはきれいですね。これは、高輝度青色光で最もよく示される。したがって、（我々はそれを達成するためにNDフィルターをはずして）一瞬の光強度を増加させる。レギュラーHBO 100水銀電球によって提供されるような大規模な青色光暴露が約分以内に写真の損傷を引き起こす可能性があることに注意してください。これは細胞が死ぬとしてフェードアウトするGFPシグナルになります。
- 明るい光に切り替え、蛍光灯の光では見ることができなかった細胞やホコリを取り除きます。気管のその可視化をメモして、清掃状態は、明るい光や蛍光灯の切り替えの恩恵を受けることができます。
- クリーニング手順が終了し、細胞体がきれいに表示されている場合、上に戻って灌流システムを切り替える（ないことをクリーニング手順は、3〜5分より長く、安定した血流による洗浄を続けるかかりすぎている場合）、ライトオフ。
- セルfoをすすぎR〜生理食塩水または次のようなアプリケーションに使用されるソリューションで15から20分。下回らない40ミリリットルは、プロテアーゼが洗い流されていることを確認するために録音室を通って行く必要があります。細胞表面でプロテアーゼの残党は、そうでなければ安定したパッチクランプ記録中に急激な細胞死を引き起こします。
6。電気生理学
- 電圧クランプおよび電流クランプモードでその場で全細胞パッチクランプにおいて、従来は、Axopatch 200Bアンプ（Molecular Devices社、米国）を用いて行われる。信号がDigidata 1320（Molecular Devices社、米国）を用いてデジタル化し、pClamp 10.2ソフトウェアで解析されています。
- パッチピペットは垂直ピペットプラー（ナリシゲ、PC-10）とのホウケイ酸ガラスキャピラリーからプルされます。
- ピペットチップ抵抗は5.8と6.2MΩ（電流クランプとカリウム電流録音）の間で、それぞれ2.8と3.5MΩ（カルシウム電流録音用）の間である。チップ抵抗はに依存細胞内および細胞外溶液（詳細は図13、図14を参照のこと ）を使用しました。
7。代表的な結果
清掃した後は、両方のMN5はその場で全細胞パッチクランプ（ 図3）のための準備が整いました。次のセクションでは、前述のように洗浄手順を使用した後、MN5ソーマから記録されている代理人の電圧クランプと電流クランプトレースを示しています。 MN5は電位依存性イオンチャネル（また、13,14を参照）の様を表現しています。我々は、電位依存性カルシウム電流（ 図4）、電位依存性カリウム電流（ 図5）と、活動電位トレース（ 図6）の例を示す。電位依存性カルシウムやカリウム電流は、同様の電圧プロトコルにより誘発されるが、使用されているソリューションは、調査中の唯一のイオンチャネル（詳細については、13,14を参照）電流を流すことを可能にするために異なっていた。他のすべての主要な電位依存性イオンチャンネル灌流が2分間停止した - 500μMのcadmiumchloride持つカルシウムチャネル、2 mMの4 - アミノピリジン（4-AP）と30とカリウムチャネル、お風呂に直接ピペット - annels（100 nMのtetrototoxinと電位依存性ナトリウムチャネルをブロックされているmMの細胞外tetraethylammoniumchlorideとパッチピペットで細胞内のパッチ液（詳細は13,14を参照のこと ）を介して細胞内に0.5mMの4-APは、20mMのtetraethylammoniumbromideと144 mMのcesiumchloride。アクション潜在的なトレースがMN5ソーマ（ 図に電流注入によって誘発された6）任意のイオンチャネルブロッカー12の使用なし。
図1。クリーニングセットアップ。フライを35mmペトリ皿のSYLGARDコーティングされた蓋に釘付けにされている我々はワットプラスチックリング（内径9ミリメートル、厚さ1.3ミリメートル）を接着しているi番目のワセリン（A、B）。生理食塩水にハエを沈める（c）の後には、背側正中線に沿って開かれます。腸、食道は腹神経索（D）を露出するために除去されています。胸部神経分節のより良いアクセシビリティのためにヘッドは（E）が削除されます。直立落射蛍光顕微鏡に準備をマウントした後、灌流システム（F、G、左の生理食塩水で、生理食塩水アウト、白矢印）と同様にアース線が（F、G、白い矢印が上の位置に持って来られる右）。ピペットが水浸対物レンズの後に位置させ、クリーニング埋め酵素（40倍、NA 0.8）を浴（H）に引き下げられました。明確にするために、我々は目的が（F、G、右側の白い矢印）が低下している前にそれを既に示している。ピペットは、客観的かつプラスチックリングの両方に触れてはならないように1-HL-Uの電極ホルダー（J）で開催された酵素ピペットは記録室に入るされる角度が重要となります。この角度は、セットアップから設定ごとに異なります。ここでは、約30°（J、Kの矢印で描画を参照してください）。ヘッドステージに取り付けられるホルダーにピペットの配置は（L）に示されています。ヘッドステージは電動マイクロマニピュレーターに装着されている。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。 GFPは遺伝子的に運動ニューロン特異的GAL4ドライバー（）を使用することにより発現させたとき腹神経索でMN5。MN5は容易ショウジョウバエ腹神経索内の場所（VNC）で識別することができます。点線の矩形は、胸部神経分節を示しています。サイズが互いにどのように関連するかのアイデアを得るために、我々はdorsolongitudinal飛翔筋の左側から左MN5に近づいてクリーニングパッチピペットを示しています。より良い視覚化のために、パッチピペットは、赤い色素（デキストラン-テトラメチルローダミン、）で満たされた。 contralat公正妥当MN5は正中線の両側にあるVNCのmesothoracic神経分節（Bの共焦点画像スタックの投影図）の背面に配置されて突出している。同側、MN1-4を投影するより横方向に位置しており、前方にMN5（Bの矢印）に関連しています。両方MN5間の点線の円はMN5（B）を含む神経網の飛行運動ニューロンの樹状突起を示しています。 （B）におけるGFPのラベルがGFPに対する抗体を用いた免疫組織化学的染色により増強された。 MN5形態の詳細が見えないトレーサーneurobiotinとその後の共焦点画像取得（C）とニューロン細胞内の（イオン泳動）を充填することによって見えるようになっています。染色は蛍光団に結合されたストレプトアビジンと見えるようにしました。スケールバーは30μmである。
図3。 MN5前後のクリーニング。MN5の可視化はUAS/GAL4を使ってGFPの発現により達成されるシステム（A、C、ラベルを参照）。 MN5クリーニング手順の前に（A、B）と後（C、D）。各画像の左側が前方を表し、右側は後部表します。から録音するニューロンが壊れた先端を持つプロテアーゼ埋めパッチピペットで洗浄される。酵素ピペットはかすかに見えている（A、B、ラベルを参照してください）。の挿入図は、セルに近づい酵素ピペットで底MN5の拡大図を示す。 MN5は、クリーニング手順（B）の前に明るい光の中で見ることができません。彼らは調査中のセルをカバーする場合に気管を削除する必要があります。清掃した後、細胞と周囲の組織との間のコントラストは、（C、底MN5）より鮮明であり、そして細胞は現在、明るい光（D）で見ることができます。明るい光が使用されるとき、ピペットチップは、よりはっきりと見ることができます。拡大は、識別しやすくするための点線で囲まれMN5細胞体の境界線と点線の四角の領域を示しています。明るい光の中で可視化は、多くの場合、清浄度の判断に役立ちます。
図4。カルシウムMN5の現在の。MN5から記録された全細胞のカルシウム電流の例の記録。少なくとも二つの異なるカルシウム電流は、過渡的なカルシウムと持続的な高電圧カルシウム電流をアクティブに低電圧を示します。電流は-90 mVの保持電位から誘発した。 -90 mVから20 mVの電圧ステップを適用した。ブロッカーは、他のほとんどのイオンチャネルをブロックするために使用されていました。成果物（MN5カルシウム電流の特性評価のためのRyglewski ら 、2012を参照）わかりやすくするために省略されました。
図5。 MN5におけるカリウム電流。MN5から記録された全細胞カリウム電流の例の記録。示される電流は、カルシウムチャネル遮断薬が適用されなかったとして、カルシウム活性化カリウム電流が含まれています。電流は保持から誘発された現在の全カリウム（）のためのまたは一時的なカリウム電流を不活性化し、現在の唯一の持続的なカリウム（B）を示すために-20 mVの保持電位から-90 mVの電位である。 -90 mVから20 mVの電圧ステップが10 mV刻みで適用された。オフライン-90 mVの（）の保持電位から誘発としてカリウム電流を減算し、-20 mVの（B）は、純粋な過渡カリウム電流（C）を明らかにする。電位依存性ナトリウムチャネルをブロックした。成果物（MN5電圧とカルシウムカリウム電流の特性評価のためのRyglewskiとダッチ、2009を参照）わかりやすくするために省略されました。
図6。 MN5によって示されるパターンを発射。例は、200 msの期間の体電流注入によってMN5において誘発として発火パターンの記録（0.4 NA、黒、0.5 NA、グレー）。静止膜電位は-59 mVであった。いいえイオンチャネルブロッカーは、使用していません。 （MN5焼成の電流クランプ解析用パターンはダッチらを参照、2008）。
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Discussion
GFPのような蛍光タンパク質を持つ細胞を可視化すると、それはあまりにも多くの光に準備をオーバー露出させないことが重要です。これは写真が損傷する恐れがあります。我々は、照明用100W HBOの短アーク水銀灯を使用しており、我々はまた、0.8（クロマNDフィルター0.3と0.5）の中性密度（ND）を使用しています。清掃良好な視認性の質で判断することができるようにすることはきわめて重要です。そこで、NDフィルターは複数回の場合は20秒程度の短い期間のために削除されることがあります。
いくつかの肯定的な圧力をかけて、細胞体は "フラップ"を少し。これは、清浄度の品質を判断するのに役立ちます。腹神経索のとは対照的に非常に低く、動きが細胞を可視化するのに非常に役に立ちます。 （また、パッチクランプ用）クリーニング手順に使用されている電極ホルダーは、密閉する必要がある、そうでない場合は圧力制御アプリケーションが可能にならないでしょう。圧力を緩めることは成功した組織の除去やdebの障害になることがありますRISとギガシール形成を防ぐことができます
細胞を洗浄した後、行わなければならない現場パッチクランプ記録の場合には、全体として腹神経索を取り巻く鞘（成人ハエの任意の中枢ニューロンの任意のパッチクランプ記録のために削除する必要があるだけでなく、がありますのでご注意ください）が、細胞自体も同様にシースによって囲まれていてもよい。 MN5は、例えば、短時間の高強度の照明でしか見ることができ、非細胞鞘に囲まれています。また、細胞は気管の下に配置することができる。セルにアクセスできない場合には、気管洗浄手順（脇に引っ張られた後の）中にピペットで食い物にされていない場合はさておき引っ張らなければならない。全体のクリーニング手順は、あまりにも多くの組織を引っ張ることなく行われる必要があります。この手順は、訓練を必要とするでしょう。クリーニングより良い、より即時ギガシール（1秒以内電池に触れた後とrelの周波数になります）正圧を緩和。
クリーニング·プロトコルに応じて、ブレークインは、次のシナリオが考えられます：まず、細胞が十分に洗浄されなかった場合、ギガシールは不可能であり、実験が終了しなければなりません。第二に、いくつかのケースではクリーニングがギガシール形成のために十分であるが、シースの薄い、ほとんど見えレムナントはソーマの周りに残っています。これが破裂する膜を引き起こし、様々な振幅のリーク電流が発生します。不十分な細胞洗浄の重症度の低い結果は、シースの原因のいくつかの残党は、アクセス抵抗が増加することである。パッチごとに異なる品質基準が適用される可能性のある実験的なデザインによって異なります。電流クランプの活動電位パターンを監視するための細胞の膜電位（MN5の場合には-55 mV以上過分極）健康でなければなりませんが、アクセス抵抗は、このような重要な問題ではありません。しかし、電流注入アクセスREで活動電位を想起させるときsistanceが問題となる。リークが小さいはず記録部位の近くに由来する大振幅のカリウム電流喚起のためとアクセス抵抗（MN5入力抵抗の場合には80MΩより大きいことでなければなりません）MΩ15より長くなることはありません。全く漏れが導入することはできません（MN5の入力抵抗がMΩ120以上でなければならないため）とアクセス抵抗が12以上であることはありませんソーマからかなりの距離に由来する小振幅樹カルシウム電流の電圧クランプ記録で必要とされるスペースのクランプ用MΩ。ほとんどの録音では8と10MΩ（として直列抵抗と細胞全体の容量補正後のaxopatch 200Bアンプのダイヤルからの読み取り）との間のアクセス抵抗とカルシウム電流を測定します。記録される各細胞型については、このような品質基準を個別に決定する必要があります。
ここで説明するクリーニング手順を使用して、我々は近似のための安定した録音を保持することができますtely 90分。我々は（特にCAV2とCav3カルシウム電流やシェーカー、シャル、および遅延整流カリウム電流のテスト）を実行してダウンはかなり守らない。しかし、我々は長いパッチを保持しようとしていないため、長い録音が可能かどうかを述べることはできません。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 | |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 | |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 | |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 | |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT | |
| ND filter set (unmounted) | Chroma Technology Corp. | 22000b series | |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
References
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