Summary
In situ yama kelepçe kayıtları bozulmamış devresi nöronların elektrofizyolojik karakterizasyon için kullanılır. MSS küçük ve sağlam bir kılıf ile çevrili olduğundan Drosophila genetik model yama klemp ise zordur. Bu makale sonraki yama klemp kayıtları için kılıf ve temiz nöronlar kaldırmak için prosedürü açıklar.
Abstract
Kısa üretim süreleri ve basit genetik teknikler meyve sineği Drosophila melanogaster temel sinirbilim araştırması mükemmel bir genetik model olun. Onlar nöronal uyarılabilirliği arabuluculuk yana İyon kanalları tüm davranışların temelini oluşturur. Klonlanmış birinci voltaj kapılı iyon kanalı Drosophila voltaj bağımlı potasyum kanalı Shaker 1,2 idi. Sinir sistemi fonksiyonu için iyon kanalları ve membran eksitabilite rolünü anlamak doğru yerinde yama klemp kayıtları ile Drosophila güçlü genetik mevcut araçları birleştirmek için yararlıdır. Uzun yıllar boyunca bu kayıtlar Drosophila MSS küçük boyutu nedeniyle zorlanıyor. Ayrıca, glia ve kollajen yapılmış sağlam bir kılıf merkezi nöronlara yama pipet erişimlerinde engeller oluşturmuştur. Bu kılıf kaldırılmasını yetişkin Drosophila CNS herhangi bir nörondan yama kelepçe kayıt için gerekli bir ön koşuldur. Son yıllardabilim adamları yetişkin beyin 3,4 ve embriyonik 5,6, larva 7,8,9,10 ve yetişkin Drosophila 11,12,13,14 ventral sinir kablosunu nöronlardan yerinde yama klemp kayıtları yapmak mümkün olmuştur. İstikrarlı giga-mühür iyi bir yama için temel ön ve kaçak akımları önlemek için hücre zarı ile yama pipet temiz bir temas bağlıdır. Bu nedenle, erişkin Drosophila nöronların yerinde yama klemp kayıtları tüm hücre için iyice temizlenmesi gerekir. İlk adım olarak, ganglionik kılıf enzimatik olarak tedavi edilmesi için olan ve mekanik olarak hedef hücrelere erişilebilir hale getirmek için kaldırılmıştır. İkinci adımda, zar glia hücre, kolajen ya da diğer herhangi bir malzeme tabakası giga yapışma oluşumunun bozabilir, böylece cilalı gerekir. Bu makalede, somatik bütün c Drosophila ventral sinir kablosu, uçuş motonöron 5 (MN5 15), bir tespit merkez nöron nasıl hazırlanacağını anlatırell yama klemp kayıtları. Nöron tanımlanması ve görünürlük MN5 içinde GFP hedeflenen ifade ile elde edilir. Biz yama klemp tekniği kendisini açıklamak amacı yoktur.
Protocol
Aşağıdaki açıklama bir motor nöron için özel değildir. Herhangi bir nöron birlikte kullanılabilir. Bu örnekte, biz dorsolongitudinal kanat depressor kas (DLM) iki dorsalmost lifleri innerve uçuş motonöron 5 (MN5) kullanın. Biz uçuş motonöronlar (ve birkaç diğer nöronlar) GFP ifade UAS/GAL4 sistemi kullanmak MN5 belirlemek ve görselleştirmek için.
1. Yetişkin Drosophila Diseksiyon Ventral Sinir Kablosu (VNC) arasında Dorsal Bölüm Erişim
- Ryglewski ve Duch (13, 2009) 'de açıklanan gibi bir Sylgard kaplı Petri kabı içindeki dorsal orta hat (35 mm çap) üzerinde bir Drosophila ergin sırt tarafında yukarı teşrih. Bu diseksiyon Bir film Jove (Boerner ve Godenschwege 16 üzerinden online kullanılabilir. Aşağıda diseksiyon kısa bir açıklamasıdır.
- Yetişkin sinek yaklaşık 1 dakika boyunca buz üzerinde soğutma ile anestezi uygulanmıştır. Bu, ön-soğutma boş bir uçucu şişesine (gıda olmadan) ile elde edilebilirbuz üzerinde ve zaten soğuk flakon sinek yerleştirerek. Kanatlar ve bacaklar bir makas ile kaldırılır.
- Plastik bir halka (iç çapı 9 mm kalınlığında 1.3 mm; sinek sonra (Şekil 1A, B biz Sylgard ile ağız dolu bir 35 mm Petri kabı kapağını kullanın) Sylgard astarlı Petri kabındaki dorsal tarafına kadar tutturulmuş olduğu ) vazelin ile Sylgard yapıştırılmış.
- 35 mm Petri kabı kapağının kullanımı su daldırma lens ile görüntü altında bir yama pipet ile VNC erişimi kolaylaştırır. Bu yemeğin duvarına dokunmadan sığ pipet tanıtmak için yardımcı olur.
- Plastik halka ince (biz 1,3 mm kalınlık kullanabilirsiniz) plastik levha içine bir delik tarafından yapılabilir. Biz bu çanak sığacak şekilde halkanın dış çevre tanımlamak için bir tel kesici kullanın.
- Batmak normal salin içinde sinek (Şekil 1C; mM tuz bileşimi: NaCl 128, KCl 2, CaCl2 1.8, MgCl2 4, HEPES 5 ~ 35 depe sukrozçözeltisinin üzerine ozmolalitesi nding; pH 1 M NaOH ile 7,25 'e ayarlanır, ozmolalite) sakaroz ile 290 mOsm şekilde ayarlanır.
- Hayvan dorsal orta hat boyunca diseke edilir ve büyük dorsal longitudinal uçuş kaslarını yanal gergin ve bağırsak, yemek borusu ve VNC altında ortaya çıkarmak için sabitlenir. Gut ve yemek borusu çıkarılmasından sonra, VNC (Şekil 1B) maruz kalır.
- İsteğe bağlı olarak, sinek bu adımı (Şekil 1E) de dekapite edilebilir. Baş kaldırma enzim ve yama pipetler ile erişim daha kolay hale getirir ve (dendritler soma posterior vardır, Şekil 2B, C) soma temizlerken MN5 dendritler rahatsız değil. Deney tasarımı (örneğin göğüs motonöronlar girdi inen okuyan) tarafından isteniyorsa Ancak, kafa da sağlam bırakılabilir. Bu durumda pipet posterior veya lateral (yanal, Şekil 2A) bulaşmasına neden olabilir.
- Hızlı içindeneyler sırasında salin değişimi kayıt odasının hacmi ile çanak disseke hayvan ve yapıştırma etrafında plastik bir halka (iç çapı 9 mm) koyarak minimize petrolatum (Şekil 1A, B; kayıt odasının hacmi ~ 200 ul olduğunu) .
- Hazırlık sonra dik duran aşamada floresan mikroskop üzerine monte (biz Zeiss Axioskop 2 FS plus, Zeiss kullanın, Almanya) ve yüksek NA (> 0.75), uzun çalışma mesafesi (> 2 mm), 40x su daldırma amacı ile izlenebilir. Perfüzyon sistemi (salin-in, tuzlu-out), topraklama kablosu ve enzim pipet kayıt odasına (- J, L Şekil 1F) eklenir.
2. MN5 Görselleştirme (Şekil 2 ve 3'e bakınız), Kapalı Kafa
- Dik duran sahnede epifluorescent mikroskop Petri kabı monte edin.
- Ön kısım elektrot tutucu tarafına bakmaktadır, böylece de sinek ile çanak yerleştirinmontajlı (Şekil 1).
- VNC aydınlatmak için yüksek bir büyütme (40x veya daha yüksek), yüksek NA su daldırma lens (NA 0.75 veya daha yüksek) ve bir GFP filtresi kullanın. Temizleme esnasında hücrenin iyi görselleştirme için biz ya da 0.8 NA (Olympus LUMPlanFl 40xW) veya 0.75 (Zeiss W N-Achroplan 40x/0.8 M27) bir NA ile lensler daldırma 40x su kullanın. Yama pipet ile iyi erişim için çalışma mesafesi 2 mm veya daha büyük olmalıdır.
- Ve muhtemelen kısmen kaplı - - belirgin trakea (Şekil 2 ve 3) MN5 ikisi arasında orta hat yakın bir ganglionun dorsal yüzeyi üzerinde mesothoracic neuromere bulunmaktadır. Onların dendritler ile MN5 diffüz yeşil alan olarak görünür. Somata temizledikten sonra daha belirgin hale geliyor. Ancak, dendritler keskin görünür ancak bunların hala doku (Şekil 2A, B) ile kaplanarak bulanık kalmayacak.
- Bizim ayarda biz mod neden olan bir HBO 100 floresan ışık kaynağı kullanınışık çıkışı yoğunluğunu ify. Biz çok fazla floresan ışığı için doku aşırı maruz kalma, özellikle mavi ışık önlemek için nötral yoğunluk filtreleri kullanın. Bu fotoğraf hasara neden olabilir ve sonuçta hücreleri öldürür. Biz 0.8 nötr yoğunluk kullanın. Resim ağartma temizleme prosedürü sırasında meydana gelmelidir. Ağartma oluşursa, büyük olasılıkla ışık çıkışı çok güçlü. Hücre fotoğraf hasarlı olduğunu.
- LED aydınlatma kullanılırsa yoğunluğunu ayarlar deneyci tarafından belirlenecek olacak. Beyazlatma fotohasar bir işaretidir ve kaçınılması gerekir.
3. MN5 Görselleştirme için Alternatif Yöntem
Bizim uygulama için bu GFP hedeflenen ifade ile, örneğin, hücre etiketli olması önemlidir. Alternatif olarak, DII, bir lipofilik boya, retrograd bu nöron etiketlemek için de kullanılabilir. Bu durumda boya kristalleri bir böcek minutien pimi kullanılarak uçuş kas içine eklenir ve yara U kullanarak kapalıV kür yapıştırıcı.
- 100 ul% 70 etanol içinde bir az uçucu, kristaller (belirli bir miktar) çözülmesi, bir uçucu, stok solüsyonu edin. Tükenmiş kadar Bu çözelti -20 ° C de muhafaza edilebilir. Tekrarlanan dondurma ve çözme bir sorun değildir.
- Çözelti 5 ul sonra tedavi edilmemiş bir kapağı kayma üzerine pipetlenir. Etanol çekinceye kadar bekleyin. Bu sadece bir kaç dakika sürer.
- A önceden soğutulmuş şişe içinde sinek (buz içine sokarak) ve buz üzerinde kısa bir süre (aşağıda 1 dk) için serin yerleştirin. Bir diseksiyon stereomikroskop altında bir soğutma plakası üzerine soğuk anestezi sinek yerleştirin.
- Bir minutien iğne ile dürttü edilirken kolayca kenara itti olamaz böylece Merkezi sinek ve yerinde tutun.
- Minutien pimi, sinek aşağı tutmak için diğeri tutmak için iki forseps, birini kullanın.
- Minutien pin ucunda bir Dii kristal (kullanarak böylece orada bir böcek minutien pimi tutun ve kapağı kayma gelen Dii bazı çizik iri forseps kullanınçok aynı kapak kayma ve kapak üzerindeki aynı noktada her zaman) prosedürü yapılır her zaman pimini fazla boya almak için yardımcı olur slip. Pin çok daha kolayca bükülür ve daha sonra kullanmak zordur olabilir, sivri olmamalıdır.
- Sonra ponksiyon ucunda DII minutien pim ile sinek dorsal toraks ortasına bir delik. Dorsolongitudinal uçuş kası (DLM, her iki tarafta kas lifleri 5 ve 6) iki dorsalmost kas lifleri MN5 inerve edilmektedir. Dolayısıyla, sağ göğüs ortasında boya kristalleri vermek MN5 her ikisi de DSB her iki kas lifleri 6 zarar görür çünkü etiketlenir ve bir boya elde edilmesi garanti eder.
- Boya üst deri altına direkt olarak yerleştirilir. Boya çok derin yerleştirildiğinde ise, uçucu bıçaklayacaktı olabilir ya da farklı nöronlar (örn. MN1-4) iyi olarak etiketlenmiş olabilir.
- Yeterli boya (Bu uygulama ve deneyim meselesi) toraks takılana kadar tekrarlanır
- DII su SOLUB değildirle, bu nedenle kas sitoplazmada çözülmez ve manikür altına "doldurulmuş" gerekmektedir.
- Sonra başka minutien pin UV yapıştırıcı bir damlacık (biz bir tartı tekne tutkal bir damla koymak) daldırılır.
- Minutien pim ucunda artık tutkal boya kristalleri eklenmiş yara kapatmak için kullanılır.
- Bir zamk (sadece yara değil, tüm göğüs kapatmak için bir küçük) uygulanmasından sonra bir UV silah yapıştırıcı tedavi etmek için kullanılır. Biz UV ışığına maruz iki 10 sn aralıklarla kullanın.
- Tedavi sinekler sinek flakonda taze gıda üzerine konur. Sineklerin toraks üzerine tutkal noktaya hangi tuzaklar sinek flakon duvarları sopa olmadığından emin olun.
- Boya hedef nöron ulaşmak için birkaç saat gerekir. Bu çözünür lipid beri sitoplazmada değil, membran boyunca geziyor. Biz öğleden sonra hayvanların tedavi ve aşırı gece bırakın.
- Yama kelepçe deneyler bir sonraki gün gerçekleştirilmiştir. Genetik olarak ifade GFP kullanımı ile karşılaştırıldığında olarak nöronlar daha az görünür olacaktır.
4. Temizleme için Kullanılan Enzim Pipet hazırlanması
Bu kayıt odasına vasıtasıyla salin sürekli bir akış sağlamak için önemlidir. Banyo hacminin yükseliş ve düşüş olması titreşim nedenleri ve deneyler sırasında potansiyel değişiklikleri ofset olarak kaçınılmalıdır. Perfüzyon ve emme buna göre ayarlanması gerekir. Bu da hızlı bir deney sırasında deney ve farmakolojik ajanların hızlı değişim öncesi proteaz yıkamak için önemli olan, çözüm alışverişi çok daha kolay hale getirir.
- Kayıt odasına (dakika başına yaklaşık 2 ml akış hızı) ve perfüzyon Assure. Akış hızı ya da bir horoz kullanarak veya spesifik çap borular (daha büyük çap, daha yüksek akış hızı) kullanılarak kontrol edilebilir. Th çözelti hızlı değişimi sağlamak için mümkün olduğu kadar küçük odasının hacmiE odası. Bu proteaz ve kayıt odasından gelen bloker hızlı kaldırma sağlar.
- Odanın hacmi perfüzyon sisteminin (Şekil 1) salin çıkış kayıt odasına (suya daldırma hedefi banyoya indirildiğinde) takıldığında nasıl bağlıdır.
- Salin-out kayıt odasının titresi yükselebilir ve (emme, yükselişi, emme, yükselme) sürekli düşmemesi bir şekilde konumlandırılmış ama sabit kalır emin olun (sabit emme). Biz sürekli banyo tuzlu emmek suretiyle üretilen sürekli, asla kesintiye gurgling sesi ve istikrarlı perfüzyon belirler.
- Salin-in ve check-out gibi biz eğildi ve dar borulara bağlı ve plasticine (Şekil 1F) kullanarak kayıt odasına yakın yerleştirilir derialtı iğneler kullanın.
- Bir yama pipet çekin ve küçük bir görsel kontrol altında ucu bölünürler. Güzel, temiz forseps kullanın. Pipet unde imgelerkenr 40x suya daldırma objektif pipet ucu çapı hücrenin soma çapı 40 ve% 70 arasında, yaklaşık olmalıdır. Çok büyük uçları (yaklaşık olarak çap hücre ya da daha fazla) da kullanılabilir, fakat, hücre gövdesinden ripping olasılığını pipet içindeki kılcal güçler nedeniyle artar. Çok küçük bir pipet (soma çapının% 10'dan daha az), bu, hangi temizleme işlemi sırasında bir ya da daha fazla taze pipet (ler) kullanmak zorunda sonuçlanır kolayca tıkayan edilir.
- Bu tıkanma olmaksızın PBS veya serum fizyolojik içinde% 2 proteaz ile pipet doldurun.
- Elektrot tutucu içine enzim pipet takın. Uygulanan basınç uygun bir şekilde kontrolünü sağlamak için, tutucu sıkıca kapatılmış olması gerekir.
- Pipet tutucu küçük çıkışına bir hortum takın ve hortumun serbest ucunda asılarak pipet tutucu içine yerleştirilmiş olduğundan emin pipet etkilemez bir şekilde sabitleyin. Mikroskop altında hareketini kontrol edin.
- Ya bir plastik p ekleme ipette uç (otomatik pipetter ile birlikte kullanılır tür, mavi 1000 ul olanları kullanılır, ancak bu bir tercih meselesidir. Diğer boyutlar da kullanılabilir) ya da hortumun serbest ucu içine bir horoz ile bir şırınga enzim / yama pipet pozitif ve negatif basınç uygulamak mümkün. Pozitif basınç ya pipet ucu (bir ağız parçası olarak kullanarak) içine üfleme veya şırınga aşağı iterek uygulanır. Negatif basınç emme (ağız parçası kullanarak ağız) veya şırınga çekerek uygulanır.
- Pozitif ve negatif basınç uygulamaları amacı hücreleri ve soruşturma altında hücreleri çevreleyen artıkları gevşetip çıkarmak için. Pozitif basınç temizlik pipetle enzim çıkarmak ve MSS yüzeyinden enkaz esecek. Negatif basınç VNC (bir elektrikli süpürge gibi) kapalı artıkları emmek için kullanılır.
5. (Şekil 3 ve Video) MN5 GFP etiketli Temizlenmesi
okuyucusuna içerik "> Not: temizlik öncesi ve sonrası MN5 Görüntüleri Şekil 3'te ayırt etmek zordur Bu gerçek hayatta ne elde olarak temizlenmeli ve non-temizlenmiş arasındaki ince farkları ayırt öğrenmek için bazı eğitim alacaktır.. nöronlar. bu ince farkları hareketli görüntüler daha iyi görülebilir unutmayın. Dolayısıyla, filmin statik görüntüler (Şekil 3) daha iyi bir izlenim sağlar.- Enzim (Şekil 3B, beyaz ok) parlak ışık ile 40x suya daldırma mercek altında pipet dolu gözünüzde canlandırın.
- Pipet odaklanın. Tıkanmış ise, pozitif veya negatif basınç uygulayarak kiri dışarı almaya çalışın. Kir dışarı çıkmazsa, pipet dolu yeni bir enzim hazırlamak.
- Floresan ışığı (Şekil 3A) geçin.
- Dikkatle enzim pipet indirin ve hücre gövdesi görülene kadar tekrar odaklanmak.
- Enzim pipet yakın olduğundahücre gövdesi, perfüzyon kapatın.
- Hücre gövdesi doğru öbekler böylece hücre erişimi engellediği her şeyi gevşetti olacak pozitif basınç uygulayın. Hücre gövdesi çevreleyen doku gevşeyene kadar bu yapılmalıdır.
- Ayrıca VNC çevreleyen ganglionik kılıfından bir sol-over olabilir gevşek enkaz yakalamak için dorsal enzim pipet hareket ettirin. O önce mikroskop üzerine hazırlık montaj için diseksiyon tarafından zaten kaldırılmış olabilir (bu her zaman böyle değildir).
- Pozitif ve negatif basınç uygulaması alternatif ile, hücre gövdesi etrafında bir elektrikli süpürge ve vakum gibi enzim pipet kullanın. Bu, tam olarak bütün hücre gövdesi gevşetmek için gerekli değildir. Soma ön parçası Temizleme (veya ne taraftan pipet bağlı posterior veya lateral parçası soma yaklaşır) yapacağız.
- Membran enkaz ücretsiz görünüyor kadar bu temizleme yordamını yapılır.
- Membrahayır "gölge" ya da hücre ve sadece flüoresan ışıkla bakıldığında çevreleyen doku arasındaki diffüz kontrast olduğunda ne temiz. Bu yüksek yoğunluklu mavi ışık ile en iyi şekilde görülmektedir. Bu nedenle, (biz bunu elde etmek nötral yoğunluk filtreleri kaldırabilirsiniz) bir an için ışık yoğunluğunu artırır. Düzenli bir HBO 100 cıva ampul tarafından sağlanan kapsamlı mavi ışığa maruz kalma yaklaşık bir dakika içinde fotoğraf hasara neden olabilir unutmayın. Bu hücreler ölür olarak solmaya GFP sinyali neden olur.
- Parlak ışığa geçin ve flüoresan ışık ile görülebilir değildir hücreleri ve enkaz kaldırmak. Trakea bu görselleştirme unutmayın ve temizlik durumu parlak ışık ve floresan ışık arasındaki geçiş yararlanabilir.
- Temizleme işlemi bitmiş ve hücre gövdesi temiz görünür olduğunda, geri perfüzyon sistemi geçiş (yaptığınız temizlik prosedürü 3 ila 5 dakika daha uzun ve istikrarlı perfüzyon ile temizlemeye devam sürer çok varsa) ve ışık.
- Hücre fo durulayınR ~ salin ya da aşağıdaki uygulama için kullanılacak çözelti ile 15 ila 20 dak. Değil az 40 ml proteaz yıkanmış olduğundan emin olmak için kayıt odasına geçmesi gerekir. Hücre yüzeyi üzerindeki Proteaz artıkları başka sabit parça klemp kayıt sırasında ani hücre ölümüne neden olur.
6. Elektrofizyoloji
- Gerilim kelepçe ve akım kelepçe modunda yerinde tüm hücre yama klemp Konvansiyonel bir Axopatch 200B amplifikatör (Moleküler Cihazlar, ABD) kullanılarak gerçekleştirilir; sinyaller Digidata 1320 (Moleküler Cihazlar, ABD) kullanılarak sayısallaştırılmış ve pClamp 10.2 yazılım programı ile analiz edilmiştir.
- Patch pipetler dikey bir pipet çektirmesi (Narishige, PC-10) ile borosilikat cam kapilerleri çektiği.
- Pipet ucu dirençleri 5.8 ila 6.2 MΩ (akım pensi ve potasyum güncel kayıtları) ile 2.8 arasında ve sırasıyla MΩ 3,5 (kalsiyum akımı kayıtları için) vardır. İpucu direnci bağlıdırintra ve ekstraselüler çözümleri (ayrıntılar 13, 14 bakınız) kullanılır.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Temizleme işleminden sonra hem MN5 in situ tüm hücre yama klemp (Şekil 3) için hazırız. Aşağıdaki bölüm temsilcisi gerilim kelepçe ve benzeri gibi açıklanan temizleme yordamını kullandıktan sonra MN5 soma kaydedilen akım pensi izlerini gösterir. MN5 voltaj kapılı iyon kanalı (ayrıca bkz 13,14) çeşitli ifade eder. Biz gerilim kapılı kalsiyum akımları (Şekil 4), voltaj bağımlı potasyum akımı (Şekil 5) ve aksiyon potansiyeli izleri (Şekil 6) bir örneğini gösterir. Voltaj geçitli kalsiyum ve potasyum akımlarının benzer voltaj protokolü ile uyarılmış, fakat kullanılmış olan çözümler inceleme altında sadece iyon kanalları (ayrıntılar için bakınız 13,14) akım geçmesine izin vermek üzere farklıdır edildi. Tüm diğer büyük voltaj kapılı iyon kanalperfüzyon iki dakika durduruldu - 500 uM cadmiumchloride ile kalsiyum kanalları, 2 mM 4-aminopiridin (4-AP) ve 30 ile potasyum kanalları; banyoya doğrudan pipetle - annels (100 nM tetrototoxin gerilim bağımlı sodyum kanallarının bloke edilmiş mM tetraethylammoniumchloride yama pipet içinde intrasellüler yama çözümü (ayrıntılar 13,14 bakınız). Aksiyon potansiyeli izleri MN5 soma (Şekil içine akım enjeksiyonu ile uyarılmış edildi aracılığıyla intraselüler ekstraselüler ve 0.5 mM 4-AP, 20 mM tetraethylammoniumbromide ve 144 mM cesiumchloride 6) Herhangi bir iyon kanal blokerleri 12 kullanımı olmadan.
Şekil 1. Temizlik kurulum. Sinek 35 mm Petri kabı bir Sylgard kaplamalı kapağının aşağı sabitlenmiş olan biz w plastik bir halka (iç çapı 9 mm, kalın 1,3 mm) yapıştırılmış olani'inci vazelin (A, B). Tuzlu su içinde uçucu daldırarak sonra (C) dorsal orta hat boyunca açılır. Gut ve özefagus ventral sinir kablosu (D) açığa çıkarılır. Torasik neuromere daha iyi erişilebilirlik için kafa (E) kaldırılır. Bir dik Epifloresans mikroskop üzerine hazırlama montajından sonra, perfüzyon sistemi (F, G, soldaki tuzlu-de, tuzlu su çıkışı, beyaz oklar) yanı sıra, topraklama kablosu (F, G, beyaz ok açık konuma getirildiğinde sağ). Pipet temizlik dolu enzimi su immersiyon objektif (NA 0.8, 40x) banyo (H) içine indirdi sonra pozisyona getirilir. Anlaşılır olması için biz objektif (F, G, sağdaki beyaz ok) düşürülmüştür önce zaten bunu göstermek. Pipet objektif ve plastik halka hem temas etmemelidir olarak 1-HL-U elektrot tutucu (J) tarafından düzenlenen enzim pipet kayıt odasına girerken hangi açı önemlidir. Bu açıdan kurulumdan kuruluma değişir. Burada yaklaşık 30 ° (K, J, ok çizim bakınız). Bir headstage bağlı tutucuya pipetin düzenleme (L) 'de gösterilmiştir. Headstage bir motorlu mikromanipülatör takılır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Ventral sinir kordon içinde MN5. GFP genetik olarak motonöron spesifik gal4 sürücüleri (A) kullanımı ile ifade edildiği zaman, MN5 kolayca Drosophila ventral sinir kablosu (VNC) içindeki konumuna göre tanımlanabilir. Noktalı dikdörtgen torasik neuromere gösteriyor. Boyutlar birbirleriyle ilişkilerini nasıl bir fikir edinmek için, biz dorsolongitudinal uçuş kas sol tarafındaki sol MN5 yaklaşan bir temizlik yama pipet göstermektedir. Daha iyi görselleştirme için, yama pipet kırmızı boya (dekstran-tetramethylrhodamine A) ile doluydu. Çıerally MN5 çıkıntılı orta hattın her iki tarafında VNC mesothoracic neuromere dorsal yüzeyi (B içinde bir konfokal görüntü yığının projeksiyon görünümü) üzerinde yer almaktadır. Tortikollis MN1-4 projelendirme daha lateralde yerleşir ve anteriorda MN5 (B oklar) ile ilgilidir. Her iki MN5 arasındaki noktalı çember MN5 (B) dahil olmak üzere nöropil içinde uçuş motonöronlar ve dendrit göstermektedir. (B) GFP etiketi GFP karşı bir antikor ile immünohistokimyasal boyama tarafından geliştirilmiştir. MN5 morfolojisinin detaylı görünmeyen izleyici neurobiotin ve sonraki konfokal görüntü elde etme (C) ile nöron intraselüler (iontophoretically) doldurularak görünür yapılır. Boyama Bir fluorofor birleştiğinde streptavidin ile görünür yapıldı. Ölçek çubuğu 30 mikron.
Şekil 3,. MN5 önce ve sonra temizleme. MN5 görüntülenmesi UAS/GAL4 kullanılarak GFP ifade ile elde edilirSistem (A, C, etiketine bakın). MN5 Temizleme prosedürü daha önce (A, B) ve sonra (C, D). Her resmin sol tarafı ön temsil eder, sağ tarafta posterior temsil eder. Kayıt yapmak Nöronlar kırık ucu bir proteaz doldurulmuş yama pipet ile temizlenir. Enzim pipet (A, B, etiketine bakın) sadece hafifçe görünür. A Ankastre hücre yaklaşan enzim pipet ile alt MN5 bir genişleme göstermektedir. MN5 temizlik prosedürü (B) önce parlak ışıkta görülemez. Bu araştırma altındaki hücrelerde kapsaması ile Trakea kaldırılması gerekir. Temizleme işlemi sonrası, hücre ve çevreleyen doku arasındaki kontrast (C, alt MN5) daha net ve hücre hemen parlak ışık (D) 'de görülebilir. Pipet ucu daha açık bir şekilde parlak ışık kullanıldığında görülebilir. Genişleme MN5 hücre gövdesi sınırları daha iyi belirlenmesi için bir noktalı çizgi ile çevrili olan noktalı kare alanı gösteriyor. Parlak ışıkta Görselleştirme genellikle temizlik kararı olur.
Şekil 4. Kalsiyum MN5 mevcut. MN5 kaydedilmiş olarak tam hücre kalsiyum akımlarının Örnek kayıt. En az iki farklı kalsiyum akımları, düşük voltajlı bir aktive geçici kalsiyum ve akım sürekli bir yüksek voltaj kalsiyum gösterilmiştir. Akımların -90 mV'luk bir tutma potansiyelinden uyarılmış edildi. -90 MV dan +20 mV Gerilim adımları uygulanmıştır. Engelleyiciler en diğer iyon kanalı bloke etmek için kullanıldı. Artefaktlar (MN5 kalsiyum akımlarının karakterizasyonu için Ryglewski ve ark., 2012 bakınız) açıklık için atlanmış edildi.
Şekil 5,. MN5 Potasyum akımları. Gibi MN5 kaydedilen tüm hücre potasyum akımları örneği kayıt. Gösterildiği Akımlar hiçbir kalsiyum kanal blokerleri uygulanmıştır gibi kalsiyum aktive potasyum akımları içerir. Akımlar bir işletmeden uyarılmış edildiakım potasyum toplam (A) için geçici ya da potasyum akımlarının inaktive ve akım sadece sürekli potasyum (B) göstermek için -20 mV'luk bir tutma potansiyelinden -90 mV'lik potansiyeli. -90 MV dan +20 mV Gerilim adımları 10 mV adımlarla uygulanmıştır. -90 MV (A) ve -20 mV (B) saf geçici potasyum akımları (C) ortaya bir holding potansiyelinden uyarılmış olarak potasyum akımların Çevrimdışı çıkarma. Voltaj bağımlı sodyum kanallarının bloke edildi. Artefaktlar (MN5 gerilim ve kalsiyum potasyum akımlarının karakterizasyonu için Ryglewski ve Duch, 2009 bakınız) açıklık için atlanmış edildi.
Şekil 6. Desen Atış MN5 tarafından sergilendi. Desenleri ateş Örnek kayıt olarak 200 ms süresi somatik akım enjeksiyonu (0.4 nA, siyah, 0.5 nA, gri) MN5 de ortaya çıkardı. İstirahat membran potansiyeli -59 mV idi. Resim iyon kanal blokerleri kullanılmıştır. (MN5 ateşleme akım kelepçe analizi içindesen Duch et al., 2008).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GFP gibi floresan proteinleri ile hücrelerin görselleştirmek zaman, çok fazla ışığı hazırlık aşırı maruz bırakmayın önemlidir. Bu fotoğraf hasara neden olabilir. Biz aydınlatma için 100W HBO kısa ark cıva ampul kullanmak, ve biz de 0.8 (Chroma ND filtreler 0.3 ve 0.5) nötr yoğunluğu (ND) kullanın. Temizlik iyi bir görünürlük kalitesini yargılamak için edebilmek için önemlidir. Bu nedenle, ND filtre birden çok kez için yaklaşık 20 saniyelik kısa bir süre için kaldırılmış olabilir.
Bazı pozitif basınç uygulayarak, hücre gövdesi "flap" biraz. Bu temizlik kalitesini yargılamak yardımcı olur. Ventral sinir kablosu aksine çok düşük olduğunu ve hareket hücreleri görselleştirmek için son derece yararlı olabilir. (Ve ayrıca yama klemp için) temizleme işlemi için kullanılan elektrot tutucu sıkıca kapatılmış olması gerekmektedir, aksi halde kontrollü basınç uygulaması mümkün olmayacaktır. Basınç kaybetmek başarılı dokunun çıkarılması ve deb rahatsız edecekris ve giga-mühür oluşumunu engeller
Hücre temizlendikten sonra yapılmalıdır yerinde yama klemp kayıtları durumda, bir bütün olarak ventral sinir kablosu çevreleyen kılıf (yetişkin sinekler herhangi bir merkezi sinir hücresinin herhangi bir yama kelepçe kayıt için kaldırılması gerekiyor, hangi sadece var olduğunu unutmayın ), ancak hücrelerin kendileri de bir kılıf ile çevrelenebilir. MN5, örneğin, sadece kısa yüksek yoğunluklu aydınlatma ile görülebilir bir hücresel olmayan bir kılıf ile çevrilidir. Buna ek olarak, nefes borusu hücreleri altında bulunabilir. Hücre erişilemez durumda, trakea temizleme yordamını (kenara çekti edildikten sonra) sırasında pipet ile yırtık değilse kenara çekilmiş olması gerekir. Tüm temizleme prosedürü çok fazla doku çekerek olmadan yapılması gerekir. Bu prosedür, eğitim gerektirir. Daha iyi temizlik, daha acil giga-contaları (1 s içinde hücre dokunduktan sonra ve rel frekansı olacaktır) pozitif basınç hafifletilmesi.
Temizleme protokolü bağlı ve hırsızlık aşağıdaki senaryolar mümkündür: Birincisi, hücreleri yeterince temizlenmiş değil sanki, bir giga-mühür mümkün değildir ve deney sonlandırılmalıdır. İkincisi, bazı durumlarda temizlik giga-mühür oluşumu için yeterince iyi ama kılıf ince, zor görünür kalıntısı soma etrafında kalır. Bu rüptürüne membran neden ve çeşitli genlikleri kaçak akımlar neden olacaktır. Yetersiz hücre temizliği bir daha az şiddetli sonucu kılıf neden bazı kalıntıları erişim direnci arttırır. Yama için deneysel tasarım farklı kalite kriterlerine bağlı olarak geçerli olabilir. Akım kelepçe içinde aksiyon potansiyeli desen izlenmesi için bir hücrenin membran potansiyeli (-55 mV veya MN5 durumunda daha fazla hyperpolarized) sağlıklı olmalı, ama dayanıklılık erişim önemli bir sorun değildir. Ancak, mevcut enjeksiyon erişim yeniden tarafından aksiyon potansiyelleri çağrıştıran zamandirenç bir sorun haline gelir. Sızıntı küçük olmalıdır (MΩ 80 'den daha yüksek bir direnç ile MN5 giriş şart söz konusu olduğunda) ve erişim direnç MΩ 15 den büyük olmamalıdır kayıt alanına yakın kaynaklanan büyük genlikli potasyum akımlarının çağrıştıran için. Hiçbir sızıntı sokulabilir (MN5 giriş direnci MΩ 120 üzerinde olmalıdır için) ve erişim direnci 12 daha yüksek olamaz soma oldukça mesafe yoktan küçük genlik dendritik kalsiyum akımlarının gerilim kelepçe kayıtlarında gerekli alanı kelepçe MΩ. Çoğu kayıtları biz 8 ve 10 MΩ (as seri direnç ve tüm hücre kapasitansı kompanzasyonundan sonra axopatch 200B amplifikatör arama okur) arasındaki erişim dirençleri ile kalsiyum akımları ölçer. Kaydedilecek her bir hücre tipi için, bu gibi kalite kriterlerine ayrı ayrı belirlenmelidir.
Burada açıklanan temizleme yordamını kullanarak, approxima için kararlı kayıtları tutabilirçülmüş 90 dakika. Biz (özellikle Cav2 ve Cav3 kalsiyum akımları ve Çalkalayıcı, Shal ve gecikmiş doğrultucu potasyum akımlar için test) run-down önemli gözlemlemek yok. Ancak, biz artık yama tutmaya çalıştı değil ve bu nedenle uzun kayıt mümkün olacağını ifade edemez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease type XIV | Sigma Aldrich USA | P5147 | |
| Microfil flexible injection needle | World Precision Instruments USA | MF28G-5 | |
| Borosilicate Glass Capillaries, o.d. 1.5 mm, i.d. 1.0 mm, no filament | World Precision Instruments USA | PG52151-4 | |
| DiI | Invitrogen USA | D3899 | |
| Sylgard Elastomer Kit 184 (Dow Corning) | www.ellsworth.com | 184 SIL ELAST KIT | |
| ND filter set (unmounted) | Chroma Technology Corp. | 22000b series | |
| Electrode holder 1-HL-U | Molecular Devices | 1-HL-U |
References
- Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Tempel, B. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Cloning of genomic and complementary DNA from Shaker, a putative potassium channel gene from Drosophila. Science. 237, 749-753 (1987).
- Tempel, B. L., Papazian, D. M., Schwarz, T. L., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Sequence of a probable potassium channel component encoded at Shaker locus of Drosophila. Science. 237, 770-775 (1987).
- Gu, H., O'Dowd, D. K. Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila. J. Vis. Exp. (6), e248 (2007).
- Gu, H., Jiang, S. A., Campusano, J. M., Iniguez, J., Su, H., Hoang, A. A., Lavian, M., Sun, X., O'Dowd, D. K. Cav2-type calcium channels encoded by cac regulate AP-independent neurotransmitter release at cholinergic synapses in adult Drosophila brain. J. Neurophysiol. 101, 42-53 (2009).
- Baines, R. A., Bate, M. Electrophysiological development of central neurons in the Drosophila embryo. J. Neurosci. 18, 4673-4683 (1998).
- Lin, W. H., Wright, D. E., Muraro, N. I., Baines, R. A. Alternative splicing in the voltage-gated sodium channel DmNav regulates activation, inactivation, and persistent current. J. Neurophysiol. 102, 1994-2006 (2009).
- Worrell, J. W., Levine, R. B. Characterization of voltage-dependent Ca2+ currents in identified Drosophila motoneurons in situ. J. Neurophysiol. 100, 868-878 (2008).
- Srinivasan, S., Lance, K., Levine, R. B. Segmental differences in firing properties and potassium currents in Drosophila larval motoneurons. J. Neurophysiol. , (2011).
- Choi, J. C., Park, D., Griffith, L. C. Electrophysiological and morphological characterization of identified motor neurons in the Drosophila third instar larva central nervous system. J. Neurophysiol. 91, 2353-2365 (2004).
- Pulver, S. R., Griffith, L. C. Spike integration and cellular memory in a rhythmic network from Na+/K+ pump current dynamics. Nat. Neurosci. 13, 53-59 (2010).
- Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS Biol. 4, e63 (2006).
- Duch, C., Vonhoff, F., Ryglewski, S. Dendrite elongation and dendritic branching are affected separately by different forms of intrinsic motoneuron excitability. J. Neurophysiol. 100, 2525-2536 (2008).
- Ryglewski, S., Duch, C. Shaker and Shal mediate transient calcium-independent potassium current in a Drosophila flight motoneuron. J. Neurophysiol. 102, 3673-3688 (2009).
- Ryglewski, S., Lance, K., Levine, R. B., Duch, C. Cav2 Channels Mediate LVA and HVA Calcium Currents in Drosophila Motoneurons. J. Physiol. , (2011).
- Ikeda, K., Koenig, J. H. Morphological identification of the motor neurons innervating the dorsal longitudinal flight muscle of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 1273, 436-444 (1988).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection. J. Vis. Exp. (52), e3080 (2011).
