Iteratieve optimalisatie van DNA-duplexen voor kristallisatie van SeqA-DNA complexen

Summary

Kristalstructuur van eiwit-DNA-complexen kan inzicht verschaffen in eiwitfunctie, mechanisme, evenals de aard van de specifieke interactie. Hier rapporteren we hoe de lengte en sequentie uiteinden van duplex DNA optimaliseren voor co-kristallisatie met

Abstract

Escherichia coli SeqA is een negatieve regulator van DNA replicatie die premature her-initiatie gebeurtenissen sequestering hemimethylated GATC clusters voorkomt in de oorsprong van replicatie ^1. Voorbij de oorsprong, wordt SeqA vinden op de replicatie vorken, waar het onlangs gerepliceerd DNA organiseert in hogere geordende structuren ^2. SeqA associeert slechts zwak met enkele GATC sequenties, maar het vormt een hoge affiniteit complexen met DNA duplexen met meerdere GATC sites. De minimale functionele en structurele eenheid SeqA een dimeer, daardoor verklarend de eis van ten minste twee sequenties GATC een hoge affiniteit complex met DNA hemimethylated ^3. Bovendien, de SeqA architectuur met de oligomerisatie en DNA-bindende domeinen gescheiden door een flexibele linker, kan binden aan GATC herhalingen gescheiden door maximaal drie spiraalvormige bochten. Daarom begrijpen van de functie van SeqA op moleculair niveau heeft de structurele analysis van SeqA gebonden aan meerdere GATC sequenties. In eiwit-DNA kristallisatie kan DNA hebben een uitzonderlijke Geen effect op de verpakking interacties afhankelijk van de relatieve afmetingen en structuur van het eiwit en DNA. Als het eiwit is hoger dan de DNA of voetafdrukken meeste DNA, wordt de kristalpakking hoofdzakelijk gemedieerd door eiwit-eiwit interacties. Omgekeerd, wanneer het eiwit even groot of kleiner dan de DNA of slechts betrekking op een fractie van de DNA, DNA-DNA en DNA-eiwit interacties domineren kristalpakking. Daarom kristallisatie van eiwit-DNA-complexen vereist een systematische screening van DNA lengte ⁴ en DNA-uiteinden (stomp of overhang) ^5-7. In dit rapport beschrijven we hoe te ontwerpen, te optimaliseren, te zuiveren en kristalliseren hemimethylated DNA duplexen met tandem GATC herhalingen in complex met een dimeer variant van SeqA (SeqAΔ (41 tot 59)-A25R) om kristallen geschikt voor structuurbepaling te verkrijgen.

Protocol

1. Protein Purification

De flexibele linker die de N-(oligomerisatie) en C-terminal (DNA binding) domeinen van SeqA steun erkenning van hemimethylated GATC herhalingen gescheiden door een tot drie slagen op het DNA. Voor deze studie hebben we een dimere variant van SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) met een puntmutatie in het N-terminale domein dat verdere oligomerisatie en verkorte linker die DNA binden tandem GATC herhaalt uitsluitend gescheiden beperkt voorkomt een slag op het DNA (Figuur 1) ^2,8.

1. Transformeren BL21 (DE3) cellen met het plasmide dat codeert SeqA onder de controle van T7 promoter,
2. Plaat de transformatie reactie in LB-agarplaten met 100 ug / ml ampicilline,
3. Extra gemengde kolonies een kleinschalige overnacht inoculeren (LB medium met 100 ug / ml ampicilline)
4. De volgende ochtend inoculeren een 1 L van media met een 1:100 verdunning van het overniGHT cultuur,
5. Groeien de cellen aan een OD ₆₀₀ van ~ 0,7 en eiwitproductie door toevoeging van isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM induceren,
6. Verdere incubatie gedurende 3 uur bij 37 ° C met schudden orbitale en oogst de cellen door centrifugeren (10 minuten bij 3300 g),
7. Resuspendeer de celpellet in buffer A en zuivering lyseren door sonicatie,
8. Verwijder het lysaat door centrifugatie (40 min bij 39.000 g) en de supernatant op een heparine geëquilibreerd met buffer zuivering laden
9. Elueren SeqA met een lineaire gradiënt van 1 M NaCl (SeqA elueert bij ~ 0,7 M NaCl),
10. Pool de SeqA bevattende fracties samen verdunnen tot de ionsterkte van het monster en belasting te verlagen tot een kationenwisselingschromatografie geëquilibreerd met buffer zuivering,
11. Met een lineaire zoutgradiënt, pure SeqA elueert bij -0,4 M NaCl,
12. Pool de SeqA bevattende fracties samen CONCENTRATe (3 mg / ml) en opslag in opslagbuffer.

2. DNA Purification

1. Bestel complementaire niet-gemethyleerd en gemethyleerde oligonucleotiden van uw favoriete bedrijf,
2. Los 1 mol van elk gevriesdroogde enkelstrengs DNA in 800 ul van geautoclaveerd ddH ₂ O, vortex en laat het zitten voor 10-20 min.,
3. Voeg 800 ul voorverwarmde 2X laadbuffer elke oligonucleotide,
4. 20-30 nucleotiden lange oligonucleotiden, om een ​​grote 10% denaturerende gel (160 x 250 x 1 mm):
   * Meng 80 ml van 10% PAGE mix, 80 ul TEMED en 800 ul ammoniumpersulfaat per gel en giet,
   * Eenmaal gepolymeriseerd, verwijder dan de kam en spoel de putten met ddH ₂ O grondig,
   * Monteer de gels op gel cast waaronder koelplaat en de bovenste en onderste reservoirs met loopbuffer (1X TBE) vullen,
   * De gel Pre-run op 700 tot 750 V om de gel op te warmen tot 55 ° C,
   * Stop de run en spoel de putten THOROughly met loopbuffer.
5. Verwarm de oligonucleotiden aan 90 ° C gedurende 2 min,
6. Vortex en draai de monsters en onmiddellijk vóór het laden van de gel,
7. Voer de gel op ~ 700 V en stoppen zodra uw oligonucleotide is halverwege gemigreerd. (Op een 10% polyacrylamide gel broomfenolblauw co-migreert met oligonucleotiden ~ 20 basen lang en xyleencyanol FF met ~ 60 basen lang)
8. Stop de gel, demonteer hem uit de gel doos en verwijder de afstandhouders,
9. Op een vlakke ondergrond, verwijder dan een glazen plaat en dekking van de gel met plastic omslag,
10. Draai de gel rond, verwijder dan de andere glasplaat en dek deze af met plastic omslag,
11. Markeer de banden met behulp van UV-licht en een fluorescerende plaat achter de gel aan het DNA schaduw te zien,
12. Snijd de band met een scheermesje in kleine stukjes en ze in een steriele 15 ml buis te brengen,
13. Voeg 9 ml elutiebuffer en overnacht bij 37 ° C onder roeren elueren,
14. Voorzichtig breng de oplossingeen geautoclaveerde centrifugebuis met een gel-lading pipetpunt de overdracht acrylamide stukken voorkomen en 1 ml van 3 M natriumacetaat bij pH 7 (1:10 verdunning) plus 25 ml gekoelde 100% ethanol (2,5 volumes) toevoegen
15. Incubeer bij -20 ° C gedurende ten minste 3 uur,
16. Draaien en overdracht het supernatant naar een afzonderlijke buis,
17. Droog de pellet op de speed-vac op middelhoog vuur,
18. Resuspendeer de pellet in 400 pl geautoclaveerd ddH ₂ O en naar een nieuwe buis,
19. Voeg 40 pl 3 M natriumacetaat bij pH 7 en 1 ml 100% ethanol, goed mengen (vortex) en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door 30 min bij -20 ° C,
20. Draai gedurende 15 min bij 18.000 g en het supernatans,
21. Spoel de pellet met 100 pl 70% ethanol aan koude resterende zout uit de pellet en spin gedurende 6 min bij 18.000 g. Gooi de ethanol en droog de pellet op speed-vac,
22. Resuspendeer de pellet in een totaal van 100 pi van geautoclaveerd ddH
23. De hemimethylated DNA duplexen gloeien, meng equimolaire concentraties van de complementaire enkele strengen en verwarm het mengsel tot 95 ° C in een waterbad gedurende 5 minuten en laat ze langzaam afkoelen tot kamertemperatuur in het waterbad.

3. Eiwit-DNA Complex Formation and Analysis

1. Meng gelijke volumes van gezuiverd SeqAΔ (41 tot 59)-A25 (81 uM) en hemimethylated DNA (81 uM),
2. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en bewaar bij 4 ° C totdat u klaar bent om het te gebruiken,
3. Scherm voor kristallisatie omstandigheden met behulp van commerciële sparse-matrix schermen,
4. Zodra de eerste kristallisatie leads geïdentificeerd, optimaliseren van de omstandigheden diffractie kwaliteit kristallen groeien
5. Cryoprotect het resulterende DNA-SeqA kristallen door ofwel de hoeveelheid van PEG 400 in de kristallisatie oplossing tot een eindconcentratie van 25% (v / v) of het toevoegen van 20% glycerol (v / v) om de kristallisatie oplossing
6. Schep individuele kristallen met een nylon lus en deze flash-bevriezen in vloeibare stikstof,
7. Test de diffractielimiet van elk kristal bij 100 K.

4. Representatieve resultaten

De kristalstructuur van SeqAΔ (41-59)-A25R gebonden aan hemimethylated DNA bekomen, achtereenvolgens drie parameters geoptimaliseerd op DNA: (i) scheiding tussen hemimethylated GATC sequenties, (ii) lengte van de duplex, en (iii) de afwezigheid / aanwezigheid van 5 'overhangen.

Electro-mobility shift assays blijkt dat SeqAΔ (41-59)-A25R voorkeur GATC repeats gescheiden door 9-10 baseparen (figuur 1) bindt. Daarom hebben we in eerste instantie gescreend duplexen 23 tot 24 basenparen (bp) lang met twee hemimethylated GATC sequenties gescheiden door 9 of 10 bps. Drie duplexen leverde mooi gevormde kristallen (figuur 2). Alhoewel geen van de kristallen afgebogen naar een hoge resolutie, de 23 bps lange duplex met de twee GATC plaatsen gescheiden door 9 bps afgebogen X-stralen beter dan de rest, wat aangeeft dat een GATC scheiding van 9 bps is de voorkeur voor kristallisatie. Daarom hebben we vast de inter-GATC afstand tot 9 bps voor alle volgende schermen.

In het algemeen wordt DNA kristallisatie voorkeur voor duplex lengtes exact overeenkomt met schroefvormige windingen omdat meerdere DNA-moleculen kunnen kop-staart stapel een continue B-DNA te vormen binnen het kristal ^9. Daarom verkort we de totale lengte van de duplexen tot 21 bps (twee spiraalvormige windingen). Terwijl een 21 bps duplex met stompe uiteinden leverde geen diffractie kwaliteit kristallen (gegevens niet getoond), een 21 bps duplex met een 5 'overhang nucleotide aan elk uiteinde heeft verkregen kristallen die afgebogen tot 5 A in huis bron. De verbetering van de diffractielimiet voorgesteld end-to-end duplex vereniging inderdaad bevorderening kristal verpakking.

Aangezien SeqA interageert met GATC sequenties die op dezelfde zijde van het DNA moeten de andere zijde van de DNA duplex wordt blootgesteld aan het oplosmiddel. Verdere verbetering van de kristallen van het complex vervolgens gemodificeerd we de sequentie van de duplex een dinucleotide CG tussen de twee sites GATC groef-backbone via interacties met aangrenzende DNA-moleculen in het kristal door de andere zijde van de duplex, een methode omvatten dat is gebruikt om DNA kristallisatie bevorderen in het verleden ^10. De diffractielimiet van de kristallen van de CG-bevattende duplex was identiek aan die geteeld met een soortgelijke DNA duplex die niet dinucleotide CG bevatten (Figuur 3). Dit resultaat gaf aan dat groefvormige backbone interacties belangrijk waren in dit geval. We vervolgens geoptimaliseerd de lengte van de overhangen door vergelijking van de kristallen van een DNA duplex die twee extra nucleotiden hadden elk5 'uiteinde. Deze wijziging heeft een drastische invloed op kristalmorfologie, alsmede, diffractielimiet aangeeft dat de aanvullende nucleotide drastisch de moleculaire contacten en verbeterde kristal organisatie (figuur 3) veranderd.

De kristalstructuur van SeqAΔ (41 tot 59)-A25R gebonden aan deze laatste DNA-duplex bevestigd dat de vrije gezicht van de DNA-duplex niet bezighouden met kristal contacten, zoals verwacht van het beperkte effect van de invoering van een CG-dinucleotide. Ondanks de relatieve grootte van eiwitten en DNA zijn de meeste interacties tussen symmetrie mates gemedieerd door eiwit-eiwit en eiwit-DNA-interacties (figuur 4). Interessant is dat in dit geval het gunstige effect van dinucleotide een 5 'overhang is door de vorming van een pseudo-continue DNA. In plaats daarvan het 5'-uiteinde van het gemethyleerde streng projecten weg van de DNA assen en interageert met het proximale SeqA molecule van het complex, verklaart waarom twee nucleotiden w ere strikt nodig is om het kristal verpakken ^8,11 te wijzigen.

Figuur 1. Binding van SeqAΔ (41-59) aan-A25R hemimethylated DNA. (A) Schematische weergave van de domeinen van SeqA die bemiddelen eiwit oligomerisatie en DNA binding. (B) elektroforetische mobiliteit shift assay van SeqAΔ (41-59)-A25R met DNAs die twee hemimethylated GATC sequenties gescheiden door een toenemend aantal baseparen ( X). De meest linkse baan (gelabeld Blank) bevat een equimolair mengsel van DNA met 5, 7, 12, 21, 25 en 34 basenparen tussen de twee GATC sequenties in afwezigheid van SeqAΔ (41-59)-A25R. (C) diagram dat de drie variabelen geoptimaliseerd op DNA duplexen diffractie kwaliteit kristallen te verkrijgen.

upload/4266/4266fig2.jpg "fo: inhoud-width =" 6in "fo: src =" / files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg "/>
Figuur 2. Effect van het variëren van de inter-GATC afstand. Samenvatting van de gebruikte oligonucleotiden en kristallen verkregen met drieëntwintig-vierentwintig bp lange duplexen met twee hemimethylated GATC plaatsen gescheiden door 9 of 10 basenparen. Alle foto's van kristallen werden genomen bij dezelfde vergroting en de schaal balk geeft 100 pm. De resolutie limiet van elk SeqAΔ (41 tot 59)-A25R-DNA kristal is gebaseerd op diffractie beelden verzameld op een Rigaku RU-300 X-ray generator systeem. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3. Effect van het variëren van de DNA-uiteinden. Samenvatting van thij oligonucleotiden gebruikt en kristallen verkregen met 21 bps lange duplexen die twee hemimethylated GATC plaatsen gescheiden door 9 basenparen en met 0, 1 of 2 nucleotide 5 'uiteinde overhangen. Alle foto's van kristallen werden genomen bij dezelfde vergroting en de schaal balk geeft 100 pm. De resolutie limiet van elk SeqAΔ (41 tot 59)-A25R-DNA kristal is gebaseerd op diffractie beelden verzameld op bundellijnen X12C en X29 (NSLS, BNL). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 4. Kristalpakking van SeqAΔ (41-59)-A25R gebonden aan DNA met dinucleotide overhang: Vanuit de (A) boven en zijde (B). De asymmetrische eenheid bevat twee SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA complexen waar het eiwit wordt getoond in grijs, terwijl het DNA oranje weergegeven. Symmery gerelateerde SeqAΔ (41 tot 59)-A25R-DNA-moleculen worden getoond in het wit voor het eiwit en geel voor het DNA. Dit cijfer werd bereid met behulp PyMOL ^12. Dit cijfer heeft betrekking op Film 1. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Film 1. Klik hier om naar de film te bekijken .

Discussion

Een van de grootste uitdagingen in macromoleculaire X-ray kristallografie is het verkrijgen van diffractie kwaliteit kristallen. Bij eiwit of eiwit-DNA-complexen, is deze uitdaging door de extra variabelen die moeten worden geoptimaliseerd verergerd. Het wordt algemeen aangenomen dat de lengte van de DNA en de aanwezigheid van kleverige overhangen aan associatie van aangrenzende DNA-moleculen te verbeteren in een langere pseudo-duplex worden de belangrijkste parameters te optimaliseren. We hebben echter aangetoond dat de aard en de duur van deze overhang kan neveneffecten op de kristalpakking van een eiwit-DNA complex. Hoewel dit protocol werd ontwikkeld om het SeqA-DNA complex, de optimalisatie van de DNA lengte sequentie en eindigt kristalliseren een algemeen kader voor het rationeel ontwerpen van oligonucleotiden voor de kristallisatie van een DNA-eiwitcomplex.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIS	Bioshop	TRS003.5
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	E478-500
Dithiotheitrol (DTT)	Bio Basic Inc.	DB0058
NaCl	Bioshop	SOD002.10
Glycerol	Caledon	5350-1
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016-500G
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Bioshop	SDS001.500
Urea	Bioshop	URE001.5
40% 29:1 Bis/acrylamide	Bio Basic Inc.	A0007-500ml	Store at 4 °C
Boric acid	EMD	BX0865-1
Xylene cyanol FF	Bio-Rad	161-0423
Bromophenol Blue	Bioshop	BR0222
Dual Adjustable Vertical Gel System	C.B.C. Scientific Company Inc.	DASG-250
Index crystallization screen	Hampton Research	HR2-144	Store at 4 °C
Wizard I crystallization screen	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-1	Store at 4 °C
Wizard II crystallization screen	Emerald BioSystems	EBS-WIZ-2	Store at 4 °C
Classics crystallization screen	Qiagen	130701	Store at 4 °C
Intelliplate trays	Art Robbins Instruments	102-0001-00
Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature.