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Biology

SeqA डीएनए परिसर Crystallization लिए डीएनए duplexes के अनुकूलन चलने

Published: November 1, 2012 doi: 10.3791/4266
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University

Summary

प्रोटीन डीएनए परिसरों की क्रिस्टल संरचना प्रोटीन समारोह, तंत्र, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशेष बातचीत की प्रकृति में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. यहाँ, हम कैसे रिपोर्ट के साथ सह - crystallization के लिए लंबाई, अनुक्रम और द्वैध डीएनए के सिरों का अनुकूलन करने के लिए

Abstract

Escherichia कोलाई SeqA डीएनए प्रतिकृति के एक नकारात्मक नियामक है कि 1 प्रतिकृति की उत्पत्ति के भीतर sequestering hemimethylated GATC समूहों द्वारा समयपूर्व reinitiation घटनाओं रोकता है. मूल के परे, SeqA प्रतिकृति कांटे, 2 जहां यह उच्च आदेश दिया संरचनाओं में नव दोहराया डीएनए का आयोजन में पाया जाता है. SeqA सहयोगियों एकल GATC दृश्यों के साथ ही कमजोर है, लेकिन यह कई GATC साइटों युक्त डीएनए duplexes साथ उच्च आत्मीयता परिसरों रूपों. SeqA की न्यूनतम कार्यात्मक और संरचनात्मक इकाई डिमर एक है, जिससे कम से कम दो GATC दृश्यों लिए hemimethylated 3 डीएनए के साथ एक उच्च आत्मीयता जटिल बनाने की आवश्यकता को समझा. इसके अतिरिक्त, oligomerization और डीएनए बाध्यकारी एक लचीला linker द्वारा अलग डोमेन के साथ SeqA वास्तुकला, GATC दोहराता तीन पेचदार बदल जाता है अलग करने के लिए बाध्य करने की अनुमति देता है. इसलिए, एक आण्विक स्तर पर SeqA के समारोह को समझने संरचनात्मक एना की आवश्यकताlysis SeqA के कई GATC दृश्यों के लिए बाध्य है. प्रोटीन डीएनए crystallization में, डीएनए पैकिंग प्रोटीन और डीएनए के सापेक्ष आकार और वास्तुकला के आधार पर बातचीत पर एक असाधारण प्रभाव करने के लिए कोई नहीं हो सकता है. यदि प्रोटीन डीएनए या डीएनए के सबसे पैरों के निशान से भी बड़ा है, क्रिस्टल पैकिंग में मुख्य रूप से प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत द्वारा मध्यस्थता है. इसके विपरीत, जब एक ही प्रोटीन या डीएनए की तुलना में आकार छोटा है या यह केवल डीएनए, डीएनए डीएनए और प्रोटीन डीएनए बातचीत का एक अंश शामिल क्रिस्टल पैकिंग पर हावी है. इसलिए, प्रोटीन डीएनए परिसरों की crystallization डीएनए लंबाई 4 और डीएनए (कुंद या की अधिकता) समाप्त होता है 5-7 की व्यवस्थित जांच की आवश्यकता है. इस रिपोर्ट में, हम वर्णन कैसे डिजाइन, अनुकूलन करने के लिए, शुद्ध और hemimethylated परिसर में डीएनए की एक dimeric संस्करण SeqA ((41-59 SeqAΔ) A25R) संरचना निर्धारण के लिए उपयुक्त क्रिस्टल प्राप्त करने के साथ मिलकर GATC दोहराता युक्त duplexes मणिभ बनाना.

Protocol

1. प्रोटीन शुद्धीकरण

लचीला को जोड़ने linker N (oligomerization) और सी टर्मिनल (डीएनए बाध्यकारी) के डोमेन SeqA एड्स hemimethylated GATC डीएनए पर एक से तीन जाता है के द्वारा अलग दोहराता की मान्यता. इस अध्ययन के लिए, हम डोमेन एन टर्मिनल में एक बिंदु उत्परिवर्तन कि आगे oligomerization और एक छोटा linker है कि अग्रानुक्रम GATC के लिए बाध्य डीएनए दोहराता द्वारा विशेष रूप से अलग प्रतिबंधित रोकता साथ SeqA की एक dimeric संस्करण (SeqAΔ (41-59) A25R) का इस्तेमाल किया डीएनए पर एक बारी (1 चित्रा) 2,8.

  1. T7 प्रमोटर के नियंत्रण के तहत प्लाज्मिड एन्कोडिंग SeqA के साथ बदलना BL21 कोशिकाओं (DE3),
  2. 100 छ / मिलीलीटर एम्पीसिलीन सहित लेग अगर प्लेटों में परिवर्तन प्रतिक्रिया प्लेट,
  3. मिश्रित कालोनियों उठाओ एक छोटे पैमाने पर रातोंरात संस्कृति टीका लगाना (100 छ / मिलीलीटर एम्पीसिलीन के साथ लेग मीडिया),
  4. अगली सुबह मीडिया के एक 1 एल overni के एक 1:100 कमजोर पड़ने का उपयोग टीका लगानाght संस्कृति,
  5. एक 600 आयुध डिपो के लिए कोशिकाओं 0.7 ~ के और बढ़ने isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के अलावा प्रोटीन के उत्पादन को प्रेरित
  6. कक्षीय मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस के साथ 3 घंटा के लिए ऊष्मायन और जारी तो centrifugation द्वारा कोशिकाओं फसल (तैंतीस सौ ग्राम 10 मिनट),
  7. शुद्धि बफर एक में सेल गोली Resuspend और sonication द्वारा lyse,
  8. Centrifugation (+३९,००० छ 40 मिनट) द्वारा lysate साफ़ और शुद्धि बफर के साथ एक हेपरिन equilibrated स्तंभ पर तैरनेवाला लोड,
  9. Elute SeqA 1 एम NaCl (~ 0.7 एम NaCl में SeqA elutes) एक रैखिक ढाल का उपयोग कर,
  10. SeqA युक्त भागों एक साथ पूल, एक कटियन विनिमय क्रोमैटोग्राफी शुद्धि बफर के साथ equilibrated स्तंभ में नमूने के ईओण ताकत और लोड को कम करने के लिए जलमिश्रित,
  11. एक रेखीय नमक ढाल का प्रयोग, शुद्ध SeqA ~ 0.4 एम NaCl elutes,
  12. SeqA युक्त भागों एक साथ पूल, concentratई (3 मिलीग्राम / एमएल) और भंडारण बफर में दुकान.

2. डीएनए शोधन

  1. आदेश अपने पसंदीदा कंपनी से पूरक unmethylated और methylated oligonucleotides,
  2. Autoclaved DDH 2 हे, भंवर के 800 μl में प्रत्येक lyophilized भी कतरा डीएनए के 1 μmol भंग और इसे 10-20 मिनट के लिए बैठते हैं,
  3. प्रत्येक oligonucleotide preheated 2X लोडिंग बफर के 800 μl जोड़ें
  4. 20-30 nucleotides लंबे oligonucleotides के लिए, एक बड़े 10% denaturing जेल (160 x 250 x 1 मिमी) तैयार:
    * अच्छी तरह से 10% मिश्रण, 80 μl TEMED और 800 जेल प्रति μl अमोनियम persulfate की 80 मिलीलीटर मिश्रण और बहना,
    * एक बार polymerized, कंघी को हटाने और DDH 2 हे अच्छी तरह से साथ कुओं कुल्ला,
    * ठंडा प्लेट सहित जेल डाली पर जैल इकट्ठा और फिर बफर चल (1X tbe) के साथ ऊपर और नीचे जलाशयों को भरने,
    * 700-750 वी पर जेल पूर्व चलाने के लिए 55 डिग्री सेल्सियस के लिए जेल तक गर्म,
    * रन बंद करो और कुओं thoro कुल्लाughly बफर चलाने के साथ.
  5. 90 oligonucleotides गर्मी ° सी 2 मिनट के लिए,
  6. भंवर और नमूने स्पिन और तुरंत जेल लोड करने से पहले,
  7. ~ 700 वी में जेल भागो और इसे रोकने के लिए एक बार अपने oligonucleotide आधे रास्ते से चले गए है. (ध्यान दें कि एक 10% polyacrylamide जेल bromophenol ~ 20 लंबे, कुर्सियां ​​और ~ 60 कुर्सियां ​​लंबा के साथ xylene cyanol एफएफ oligonucleotides साथ नीले सह migrates)
  8. जेल बंद करो, यह जेल बॉक्स से जुदा और spacers को दूर करने के लिए,
  9. एक सपाट सतह पर, एक गिलास प्लेट हटाने और प्लास्टिक की चादर के साथ जेल कवर,
  10. जेल के चारों ओर मोड़, अन्य ग्लास प्लेट हटा दें और इसे प्लास्टिक की चादर के साथ कवर,
  11. मार्क जेल के पीछे पराबैंगनी प्रकाश और एक फ्लोरोसेंट प्लेट का उपयोग करने के लिए डीएनए की छाया देख बैंड,
  12. एक धार के साथ छोटे - छोटे टुकड़ों में बैंड और कट उन्हें एक बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए,
  13. क्षालन बफर के 9 मिलीलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के साथ रातोंरात elute
  14. सावधानी स्थानांतरण समाधानएक autoclaved अपकेंद्रित्र ट्यूब जेल की लोडिंग एक विंदुक टिप का उपयोग करने के लिए स्थानांतरित acrylamide टुकड़े से बचने के लिए और 7 पीएच में 3 एम सोडियम एसीटेट (1:10 कमजोर पड़ने) के 1 मिलीग्राम से अधिक ठंडा 100% इथेनॉल (2.5 संस्करणों) के 25 मिलीलीटर जोड़ने के लिए,
  15. -20 डिग्री सेल्सियस में कम से कम 3 घंटे के लिए सेते हैं,
  16. नीचे स्पिन और एक अलग ट्यूब तैरनेवाला हस्तांतरण,
  17. सूखी मध्यम गर्मी पर गति-Vac पर गोली,
  18. Autoclaved DDH 2 हे के 400 μl में गोली Resuspend और एक ताजा ट्यूब के स्थानांतरण,
  19. 7 पीएच पर 3 एम सोडियम एसीटेट और 100% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के 40 μl जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण (भंवर) और कमरे के तापमान पर 30 मिनट सेते हैं -20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के बाद,
  20. 18,000 जी पर 15 मिनट के लिए स्पिन और तैरनेवाला त्यागें,
  21. 70% ठंड इथेनॉल के 100 μl के साथ गोली कुल्ला गोली और स्पिन से 18,000 छ 6 मिनट के लिए अवशिष्ट नमक निकालने. इथेनॉल त्यागें और गति Vac पर गोली सूखी,
  22. Autoclaved DDH के 100 μl के कुल में गोली Resuspend
  23. तपाना hemimethylated डीएनए duplexes, strands एक पूरक equimolar सांद्रता मिश्रण और 95 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए एक पानी में स्नान मिश्रण गर्मी और फिर उन्हें नीचे पानी के स्नान के अंदर कमरे के तापमान को धीरे शांत.

3. प्रोटीन डीएनए जटिल संरचना और विश्लेषण

  1. शुद्ध SeqAΔ के बराबर मात्रा में (41-59) A25 (81 सुक्ष्ममापी) और hemimethylated डीएनए (81 सुक्ष्ममापी) मिक्स,
  2. 4 में 15 मिनट और दुकान के लिए कमरे के तापमान पर सेते ° C जब तक आप के लिए इसका इस्तेमाल करने के लिए तैयार कर रहे हैं,
  3. Crystallization वाणिज्यिक विरल मैट्रिक्स स्क्रीन का उपयोग करने की स्थिति के लिए स्क्रीन,
  4. एक बार प्रारंभिक crystallization सुराग की पहचान की गई है, स्थिति अनुकूलन विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल विकसित,
  5. या तो crystallization समाधान में 25% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए खूंटी वर्तमान 400 की राशि में वृद्धि से उत्पन्न SeqA डीएनए क्रिस्टल Cryoprotect (v / v) या crystallization समाधान के लिए 20% ग्लिसरॉल (v / v) जोड़ने,
  6. एक नायलॉन पाश के साथ व्यक्तिगत क्रिस्टल स्कूप, और उन्हें तरल नाइट्रोजन में फ्लैश फ्रीज,
  7. प्रत्येक क्रिस्टल के 100 लालकृष्ण सीमा विवर्तन टेस्ट

4. प्रतिनिधि परिणाम

(41-59) SeqAΔ-A25R hemimethylated डीएनए के लिए बाध्य की क्रिस्टल संरचना प्राप्त करने के लिए, हम लगातार डीएनए पर तीन मानकों को अनुकूलित: (i) hemimethylated GATC दृश्यों के बीच जुदाई, डुप्लेक्स की लंबाई (ii) और (iii) 5 'overhangs की उपस्थिति / अनुपस्थिति.

इलेक्ट्रो गतिशीलता बदलाव assays से संकेत मिलता है कि SeqAΔ A25R (41-59) preferentially GATC 9-10 आधार जोड़े (1 चित्रा) द्वारा अलग दोहराता बांधता है. इसलिए, हम शुरू duplexes जांच 23-24 आधार जोड़े (bps) लंबे समय से दो hemimethylated GATC 9 या तो 10 बीपीएस द्वारा अलग दृश्यों से युक्त. तीन duplexes अच्छी तरह से आकार क्रिस्टल (2 चित्रा) मिले. अलहालांकि कोई भी उच्च संकल्प diffracted क्रिस्टल, 23 ​​दो GATC 9 एक्स - रे diffracted बाकी की तुलना में बेहतर बीपीएस द्वारा अलग साइटों के साथ लंबे समय के द्वैध bps, यह दर्शाता है कि 9 बीपीएस की एक GATC जुदाई crystallization के लिए पसंद किया गया था. इसलिए, हम सभी बाद स्क्रीन के लिए 9 बीपीएस रिक्ति अंतर GATC तय.

आम तौर पर, डीएनए crystallization द्वैध सटीक पेचदार बदल जाता है इसी लंबाई के लिए इष्ट है क्योंकि कई डीएनए अणु सिर से पूंछ ढेर क्रिस्टल 9 के भीतर एक बी डीएनए निरंतर फार्म कर सकते हैं. इसलिए, हम duplexes की कुल लंबाई 21 बीपीएस (यानी दो पेचदार बदल जाता है) के लिए छोटा है. कुंद के साथ समाप्त होता है जबकि एक 21 बीपीएस द्वैध विवर्तन गुणवत्ता (नहीं दिखाया डेटा) क्रिस्टल, प्रत्येक के अंत पर एक भी 5 'nucleotide की अधिकता किया था क्रिस्टल उपज के साथ एक 21 बीपीएस द्वैध कि 5 हमारे घर स्रोत में एक diffracted. उपज नहीं था सीमा विवर्तन पर सुधार का सुझाव दिया है कि अंत करने के लिए अंत द्वैध संघ के पक्ष में वास्तव में किया गया थाआईएनजी क्रिस्टल पैकिंग.

चूंकि SeqA GATC दृश्यों कि डीएनए के एक ही चेहरे पर हैं साथ सूचना का आदान प्रदान, डीएनए द्वैध के विपरीत चेहरे विलायक उजागर किया जाना चाहिए. आगे परिसर के क्रिस्टल में सुधार, हम तो द्वैध के अनुक्रम को संशोधित करने के लिए दो GATC साइटों के बीच एक तटरक्षक dinucleotide क्रिस्टल में आसन्न डीएनए अणु के साथ द्वैध के विपरीत चेहरे के माध्यम से नाली - रीढ़ की हड्डी बातचीत को बढ़ावा देने के लिए एक विधि शामिल है कि पिछले 10 में डीएनए crystallization को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, तटरक्षक युक्त द्वैध साथ हो क्रिस्टल के विवर्तन सीमा एक समान डीएनए द्वैध है कि तटरक्षक dinucleotide (3 चित्रा) शामिल नहीं किया था के साथ हो उन लोगों के लिए समान था. इस परिणाम संकेत दिया कि इस मामले में नाली - रीढ़ की हड्डी बातचीत महत्वपूर्ण नहीं थे. हम बाद में एक डीएनए द्वैध है कि प्रत्येक में दो अतिरिक्त nucleotides था साथ हो क्रिस्टल की तुलना द्वारा overhangs के लंबाई अनुकूलित5 'अंत. यह परिवर्तन क्रिस्टल आकारिकी पर एक भारी प्रभाव पड़ा है, और साथ ही, विवर्तन सीमा का संकेत है कि अतिरिक्त nucleotide नाटकीय रूप से आणविक संपर्कों और बढ़ाया क्रिस्टल संगठन (3 चित्रा) बदल.

(41-59) SeqAΔ-A25R की क्रिस्टल संरचना यह पिछले डीएनए पुष्टि की है कि डीएनए द्वैध के मुक्त चेहरा क्रिस्टल संपर्क में संलग्न नहीं है द्वैध करने के लिए बाध्य है, के रूप में एक तटरक्षक dinucleotide शुरू करने की सीमित प्रभाव से होने की उम्मीद है. प्रोटीन और डीएनए के सापेक्ष आकार के बावजूद, समरूपता साथियों के बीच सबसे अधिक बातचीत प्रोटीन, प्रोटीन और प्रोटीन डीएनए बातचीत (4 चित्रा) द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं. दिलचस्प बात यह है कि इस विशेष मामले में, एक '5 dinucleotide की अधिकता के लाभकारी प्रभाव एक छद्म निरंतर डीएनए के गठन के कारण नहीं है. इसके बजाय, डीएनए अक्षों से दूर methylated किनारा परियोजनाओं के 5 अंत और परिसर के समीपस्थ SeqA अणु के साथ सूचना का आदान प्रदान, दो क्यों nucleotides w समझा अरे कड़ाई से 8,11 पैकिंग क्रिस्टल को बदलने के लिए आवश्यक है.

चित्रा 1
चित्रा 1. (41-59) SeqAΔ-A25R बाइंडिंग डीएनए को hemimethylated. (ए) SeqA के डोमेन के योजनाबद्ध आरेख मध्यस्थता प्रोटीन oligomerization और डीएनए बाध्यकारी है कि (बी) electrophoretic दो hemimethylated GATC बेस जोड़े के एक बढ़ती हुई संख्या से अलग दृश्यों से युक्त DNAs के साथ गतिशीलता (41-59) SeqAΔ-A25R पारी परख ( X). बाएँ सबसे लेन (रिक्त लेबल) 5 के साथ एक DNAs की equimolar मिश्रण, 7, 12, 21, 25 और 34 आधार जोड़े SeqAΔ के अभाव (41-59) में दो GATC दृश्यों के बीच होता है A25R. (सी) आरेख तीन डीएनए duplexes पर अनुकूलित चर विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल प्राप्त चित्रण.

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चित्रा 2. अंतर - GATC oligonucleotides और क्रिस्टल 23-24 बीपी लंबी दो hemimethylated GATC 9 या 10 आधार जोड़े द्वारा अलग साइटों युक्त duplexes साथ प्राप्त की दूरी सारांश अलग का प्रभाव. क्रिस्टल के सभी चित्रों को एक ही बढ़ाई पर ले जाया गया और पैमाने बार 100 सुक्ष्ममापी इंगित करता है. प्रत्येक SeqAΔ संकल्प सीमा (41-59) A25R डीएनए क्रिस्टल विवर्तन एक Rigaku RU 300 जनरेटर एक्स - रे सिस्टम पर एकत्र की छवियों पर आधारित है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. डीएनए बदलती के प्रभाव समाप्त होता है टी का सारांश.वह oligonucleotides का इस्तेमाल किया और 21 बीपीएस लंबे समय के duplexes दो hemimethylated GATC 9 आधार जोड़े द्वारा अलग साइटों युक्त और 1 0, या 2 nucleotide 5 'अंत overhangs सहित क्रिस्टल के साथ प्राप्त है. क्रिस्टल के सभी चित्रों को एक ही बढ़ाई पर ले जाया गया और पैमाने बार 100 सुक्ष्ममापी इंगित करता है. प्रत्येक SeqAΔ संकल्प सीमा (41-59) A25R डीएनए क्रिस्टल विवर्तन X12C और x29 beamlines (NSLS, BNL) में एकत्र की छवियों पर आधारित है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. SeqAΔ के क्रिस्टल पैकिंग (41-59) A25R dinucleotide की अधिकता के साथ डीएनए के लिए बाध्य: (ए) ऊपर और (बी) की ओर से देखा. असममित इकाई दो SeqAΔ (41-59) परिसरों जहां प्रोटीन भूरे रंग में दिखाया गया है जबकि डीएनए नारंगी में दिखाया गया है - A25R डीएनए होता है. Symmetry संबंधित SeqAΔ (41-59) A25R डीएनए अणु सफेद में प्रोटीन और डीएनए के लिए पीले रंग के लिए दिखाए जाते हैं. इस आंकड़ा 12 PyMOL का उपयोग कर तैयार किया गया था. यह आंकड़ा 1 मूवी से संबंधित है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

मूवी 1 फिल्म को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

Macromolecular एक्स - रे क्रिस्टलोग्राफी में सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल प्राप्त है. प्रोटीन या प्रोटीन डीएनए परिसरों के मामले में, इस चुनौती का अतिरिक्त चर कि अनुकूलित किया जाना चाहिए के कारण exacerbated है. यह व्यापक रूप से माना जाता है कि डीएनए की लंबाई और चिपचिपा overhangs के उपस्थिति छद्म द्वैध अब मुख्य मापदंडों का अनुकूलन में पड़ोसी डीएनए अणु के सहयोग को बढ़ाने के लिए है. हालांकि, हम पता चला है कि प्रकृति और इन overhangs के लंबाई एक जटिल प्रोटीन डीएनए की क्रिस्टल पैकिंग पर अतिरिक्त प्रभाव हो सकता है. हालांकि इस प्रोटोकॉल के लिए SeqA डीएनए जटिल, लंबाई, डीएनए अनुक्रम समाप्त होता है और के अनुकूलन मणिभ बनाना करने के लिए तैयार किया गया था किसी भी जटिल डीएनए प्रोटीन crystallization के लिए oligonucleotides के तर्कसंगत डिजाइन के लिए एक सामान्य रूपरेखा प्रदान करता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों के NSLS (Brookhaven राष्ट्रीय प्रयोगशाला) में डेटा संग्रह और मोनिका Pillon के दौरान सहायता के लिए डीएनए शुद्धि के साथ मदद के लिए PXRR स्टाफ का शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ. यह काम स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा (67,189 एमओपी) द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TRIS Bioshop TRS003.5
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific E478-500
Dithiotheitrol (DTT) Bio Basic Inc. DB0058
NaCl Bioshop SOD002.10
Glycerol Caledon 5350-1
Sucrose Sigma-Aldrich S5016-500G
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Bioshop SDS001.500
Urea Bioshop URE001.5
40% 29:1 Bis/acrylamide Bio Basic Inc. A0007-500ml Store at 4 °C
Boric acid EMD BX0865-1
Xylene cyanol FF Bio-Rad 161-0423
Bromophenol Blue Bioshop BR0222
Dual Adjustable Vertical Gel System C.B.C. Scientific Company Inc. DASG-250
Index crystallization screen Hampton Research HR2-144 Store at 4 °C
Wizard I crystallization screen Emerald BioSystems EBS-WIZ-1 Store at 4 °C
Wizard II crystallization screen Emerald BioSystems EBS-WIZ-2 Store at 4 °C
Classics crystallization screen Qiagen 130701 Store at 4 °C
Intelliplate trays Art Robbins Instruments 102-0001-00

Solutions

Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol.

Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol.

Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C.

2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C.

10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C.

10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature.

Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature.

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References

  1. Campbell, J. L., Kleckner, N. E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork. Cell. 62, 967-979 (1990).
  2. Guarné, A. Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization. Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).
  3. Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).
  4. Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals. Science. 230, 1383-1385 (1985).
  5. Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization. J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).
  6. Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn. Cell. 87, 1295-1306 (1996).
  7. Yang, W., Steitz, T. A. Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site. Cell. 82, 193-207 (1995).
  8. Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat. Nucleic Acids Res. , (2009).
  9. Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).
  10. Timsit, Y., Moras, D. DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly. Embo J. 13, 2737-2746 (1994).
  11. Chung, Y. S., Guarne, A. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).
  12. DeLano, W. L. The PyMOL Molecular Graphic Systems. , DeLano Scientific. (2002).

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