Summary
Engineered spierweefsel heeft een groot potentieel in de regeneratieve geneeskunde, als de ziekte model en ook als een alternatieve bron voor vlees. Hier beschrijven we de constructie van een spier construct, in dit geval van muis myoblast progenitor cellen en stimulering van elektrische pulsen.
Abstract
Ontworpen spierweefsel kan worden gebruikt voor verschillende doeleinden, waaronder de productie van weefsel voor gebruik als een ziektemodel in vitro, bijv. decubitus bestuderen voor regeneratieve geneeskunde en als vlees alternatief 1. De eerste melding 3D spier constructen zijn vele jaren geleden gemaakt en pioniers op het gebied zijn Vandenburgh en collega's 2,3. Vooruitgang in spierweefsel engineering zijn niet alleen het gevolg van de enorme winst in kennis van de biochemische factoren, stamcellen en progenitorcellen, maar zijn met name gebaseerd op inzichten die door de onderzoekers dat de fysieke factoren een essentiële rol in de controle van cel gedrag spelen en weefsel ontwikkeling. State-of-the-art ontworpen spier bouwt bestaan momenteel uit cel-bevolkte hydrogel constructen. In ons lab deze over het algemeen bestaan uit murine myoblast progenitorcellen, geïsoleerd uit muizen achterste ledematen spieren of een muizen myoblast cellijn C2C12, mixed met een mengsel van collageen / Matrigel en uitgeplaat tussen twee ankerpunten, nabootsen van de spier ligamenten. Andere cellen kunnen eveneens worden overwogen, bijvoorbeeld alternatieve cellijnen zoals L6 myoblasten rat 4 neonatale spier afgeleide progenitorcellen 5, cellen afkomstig van volwassen spierweefsel van andere species zoals humaan 6 of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS cellen) 7 . Cell contractiliteit veroorzaakt uitlijning van de cellen langs de lengteas van de construct 8,9 en differentiatie van de spier progenitorcellen na ongeveer een week van cultuur. Bovendien is de toepassing van elektrische stimulatie kan de differentiatie verbeteren enigszins 8. Vanwege de beperkte omvang (8 x 2 x 0,5 mm) het volledige weefsel kan worden geanalyseerd met behulp van confocale microscopie zoals levensvatbaarheid, differentiatie en celuitlijning controleren. Afhankelijk van de specifieke toepassing van voorschriften voor de engineerood spierweefsel variëren, bijvoorbeeld bij gebruik voor regeneratieve geneeskunde is het opschalen van weefsel grootte en vascularisatie, terwijl om als vleesvariatie vertaling naar andere soorten noodzakelijk.
Protocol
1. Cultuur van Murine myoblast Progenitor Cellen of C2C12 Cellen
- Isoleer cellen volgens het protocol oorspronkelijk gepubliceerd Shefer en collega's 10 en later aangepast door Collins et al.. 11 en Boonen et al.. 12 en bewaar deze in vloeibare stikstof. Dit vereist muizen, bijv. C57Bl / 6. Alternatieve methoden worden in andere laboratoria, bijvoorbeeld een methode, gepubliceerd in Journal of Gevisualiseerde Experimenten door Li Y et al.. 13. Voor de reagentia en apparatuur wordt verwezen naar de tabel op pagina 7 en 8. Van de spier van een muis kunt u over het algemeen het verkrijgen van voldoende cellen tot ongeveer 20 flesjes in vloeibare stikstof cryopreserveren. Vervolgens beginnen we het protocol bij de cellen van de vloeibare stikstof opslag ontdooien.
- Plaats de cellen van een flacon in een 25 cm 2 Matrigel (1 mg / ml) bekleed weefselkweekfles en voeg groeimedium (GM) bestaande uit (335 ml DMEM advanced, 100 ml foetale bovine serum (FBS), 50 ml HS, 5 ml penicilline / streptomycine, 5 ml L-glutamine, 5 ml kippenembryo extract (CEE)).
Let op: jas voor 2 uur bij kamertemperatuur en de Matrigel door aspiratie te verwijderen.
- Subcultuur van de cellen ongeveer 01:03 om de 3 dagen.
Dit betekent: op dag 3: Passage cellen van een 25 cm 2 bij een 75 cm2 fles, op dag 6: passage cellen van een 75 cm2 fles met twee 150 cm2 flessen (met 30 min preplating in ongecoate kolven). Op dag 9 overdracht een 150 cm2 kolf tot 1 triple 150 cm2 kolf, of bij ontstentenis drie 150 cm2 flessen (indien nodig preplate weer afhankelijk van het fenotype van de cellen). Op dag 12 de cellen klaar voor het zaaien in een spier construct.
Opmerkingen: - Per triple 150 cm 2 het aantal cellen zal ongeveer 4,5 x 10 6 cellen.
- Gebruik vials uit verschillende isolaten te mengen tot een gemengde populatie van cellen te verkrijgen op het moment van zaaien.
Opmerking: Als u ervoor kiest niet te werken met primaire cellen, C2C12 myoblasten zijn een goed alternatief.
2. Techniek Skeletal spierweefsel
- Bereid siliconenlijm door mengen van de "elastomeer" de "hardingsmiddel" (10:1). Cut + / - 5 mm vierkant segmenten van klittenband met een driehoekige kant (huis-achtige vorm; Figuur 1). Lijm het klittenband in de putjes van een 6-wells plaat cultuur in een ruimte van ongeveer 12 mm tussen de pleinen.
Opmerkingen: - Gebruik alleen de zachte kant van het klittenband en het gezicht van deze kant naar boven.
- Zorg ervoor dat de daken naar elkaar toe.
- Alleen de klittenband te bedekken met siliconenlijm, verspreiden zich niet lijmen in de put.
- Voor elektrostimulatie later is relevant voor de constructen lijnen in verticale richting van de put platen (langs de lange as).
- Laat een nacht drogen in een vacuümoven, niet verwarmd, vooral om luchtbellen te verwijderen. Steriliseer door toevoeging 70% EtOH aan de putjes en incubeer gedurende 15 minuten. Spoel 3x met PBS en onder UV gedurende 15 minuten. Verwijder alle PBS uit de putjes en de klittenband en in incubator tot gebruik.
- Ontdooien Matrigel oplossing in de koelkast en bereiden collageenoplossing tot de gewenste concentratie kort voordat de 3D constructen. Verdun de stock collageen met steriel 0,02% azijnzuur (eindconcentratie 3,2 mg / ml).
Let op: laat alles op ijs.
- Trypsinize de cellen, resuspendeer in GM en tellen. Laat cellen in centrifugebuis in de incubator.
- Voeg de gewenste hoeveelheid Collageen voorraad oplossing voor het aantal constructies die u wilt maken op een buis (volgens tabel 1), voeg 0,5 M NaOH aan deze collageen oplossing totdat een licht roze color aangeeft een pH van 7,5. Meng voorzichtig door en neer te pipetteren zonder blaasjes vorming. Voeg dan de Matrigel en meng zeer grondig, maar voorzichtig. Voeg ten slotte de GM de Collagen / Matrigel mengsel (voor de juiste hoeveelheden zie Tabel 1).
Opmerkingen: - Voer elke stap op het ijs! Matrigel en collageen gel zal gemakkelijk bij toenemende temperatuur.
- Let op dat de kleur inderdaad roze is! Een toename van pH zal induceren snelle gelering.
- Eindconcentratie van collageen: 1,6 mg / ml.
- Centrifugeer de gewenste hoeveelheid cellen bij 1000 rpm gedurende 5 min en verwijder het supernatant.
Opmerking: - Afhankelijk van de activiteit van de cellen het aantal cellen per construct moet worden aangepast. Typisch, het aantal cellen ligt tussen 750.000 en 1.250.000 cellen per construct.
- Voor sommige gel mengsel de cel pellet te resuspenderenen breng de cellen in de resterende mengsel en meng grondig, maar zonder dat er luchtbellen.
- Neem de voorverwarmde well platen uit de incubator en pipet 0,35 -0,4 ml van de cel-gel mengsel in de klittenband eerst. Vervolgens beginnen het mengsel pipet uit het midden tussen de bevestigingsplaatsen en de Velcro verlengen. Gebruik ten slotte de rest van gel op te vullen het gat tussen de twee klittenband ankers en pipet om de klittenband stukken.
- Controleer zorgvuldig na 5-10 min als de gels zijn solide genoeg om te worden overgedragen, dat wil zeggen tik de gerechten en inspecteer visueel als de gel is stijf. Als dat zo is, plaatst u voorzichtig de schalen in een incubator. Meestal kunnen ze worden opgehaald na tien minuten. Dan, na 1-2 uur voorzichtig bedekken elke gel met 4 ml warm GM.
Let op:-Maak geen krachtige bewegingen bij het hanteren van de platen.
- Vervang GM door differentiatie medium (groeimediumzonder kippenembryo-extract) na 24 uur, en te vervangen door vers medium om de 2-3 dagen. Op dag 7 moet verkregen rijpe georiënteerde spiervezels, zoals kan worden geëvalueerd met kleuring voor cross strepen ontwikkeling in de gesmolten spiervezels.
3. Elektrische Stimulatie
- Steriliseer de elektroden van de ionoptix plaat (zie tabel van de reagentia en apparatuur) voor gebruik met 70% ethanol en vervolgens droog onder UV in een veiligheidskabinet. Plaats de plaat met elektroden op de cultuur plaat met de constructen en dek af met het deksel van de petrischaal en overdracht aan een incubator. Sluit de Ionoptix C-pacer met de juiste kabels.
Opmerking: elektroden parallel geplaatst naast de spier construct (figuur 2).
- Breng de stimulatie protocol zoals verwacht.
Opmerking: We gebruiken over het algemeen 4 V / CM,6ms pulsen met een frequentie van 2 Hz. Wijzig kweekmedium om de 24 uur tijdens de stimulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het eindproduct wordt spier constructen zoals aangegeven in figuur 3. De grootte van het weefsel zal ongeveer 8 mm lang en 2 mm breed en 0,5 mm dik. Elektrische stimulatie tijdens differentiatie verandert de expressie van myosine zware keten isovormen, maar niet sterk verbeteren van de differentiatieproces zoals geïnduceerd door de differentiatie medium 8, maar elektrische stimulatie kan ook worden toegepast op het einde van het proces om te controleren functionaliteit van de spier omdat een spier met volle sarcomeren kunnen aangaan op een elektrische puls.
Differentiatie en maturatie kan ook worden geanalyseerd met behulp van kwantitatieve PCR voor genexpressie evaluatie en kleuring voor spier rijping markers of kruis strepen ontwikkeling (bijvoorbeeld kleuring voor alpha actinine) aan beide secties gemaakt van de weefsels of hele berg glas weefselmonsters. Spier rijping en differentiatie relatieted genen en myosine zware keten expressie omvatten bijvoorbeeld MyoD, myogenin, MFR4 en MLP en MYH 1, 2, 4 en 8 8. Het bewijs dat het spierweefsel dat inderdaad wordt gevormd is spierweefsel, op basis van genexpressie, immunohistochemische kleuringen en krimp inductie door elektrische stimulatie, is eerder gepubliceerd 8 en een figuur met gekleurde doorsneden van spierweefsel gemaakt van myoblast progenitorcellen en C2C12 cellen van dit document is weergegeven in figuur 4.
| Oplossing | Volume (als het maken van 10 spieren) in pi |
| Collageen (3,2 mg / ml, verdund met 0,02% azijnzuur) | 2570 (51,3%) |
| NaOH (0,5 M) | 10 (0,2%) |
| Matrigel | 430 (8,6%) |
| Groeimedium | 2.000 (39,9%) |
| totaal | 5010 (moet met genoeg volstaan voor morsen en pipetteren verlies) |
Tabel 1. Mengsel van cellen en gel voor het genereren van een tissue engineered spier bouwen.
Figuur 1. Snijden van de stukken klittenband.
Figuur 2. Een foto genomen van de bodem van een spier construct in een putje van een 6-well plaat met de plaatsing van de elektroden. De elektroden (aangegeven met witte pijlen) zijn parallel geplaatst aan de spier constructen.
Figuur 3. Een weefselontworpen spieren tussen twee stukken van Velcro in een 6-well kweekplaat.
Figuur 4. Typische voorbeelden van cross-strepen in C2C12 (A) en MPC (B) in skeletspieren gemanipuleerde weefsels. Vriescoupes van niet-gestimuleerde mBAMs (dag 8 van differentiatie) werden gekleurd voor sarcomere α-actinine (rood), sarcomere myosine (groen ) en kernen (blauw). (Aa Ab-en Ba-Bb) vergrotingen van boxed gebieden (A, B) α-actinine (rood) en sarcomere myosine (groen). Overgenomen met toestemming van 8. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De engineering van spierweefsel heeft een groot potentieel voor het gebruik als een ziekte model, voor drug discovery, in de regeneratieve geneeskunde en voor de vleesproductie. Echter, de eisen voor deze toepassingen variëren. We kozen voor werken met een combinatie van collageen en Matrigel, omdat collageen maakt celuitlijning en omdat de myoblast progenitor cellen vereisen de aanwezigheid van basale membraan eiwitten afkomstig zoals bepaald in eerdere studies 2D 12. Bovendien zijn fibrinegelen getest in ons laboratorium en lijken niet te C2C12 myoblast en progenitorcellen ondersteunen evenals het mengsel van collageen en Matrigel ™ en vooral niet tot verdichting weefsel 14. Het model zoals hier beschreven is al gebruikt in studies naar decubitus schade tijdens het gebruik van een cellijn 15. Voor regeneratieve geneeskunde toepassingen, heeft de vertaling voor de menselijke satelliet cellen kort is 6,16. Bovendienals een alternatieve bron voor de vleesconsumptie de techniek heeft een groot potentieel 1. Naar onze mening echter de huidige technologie moet gaan naar een volgend stadium het gebruik in de kliniek verder als voor consumptie. Bijvoorbeeld, de differentiatie stopt rond de neonatale fase en kracht productie veel minder dan een spier produceert in vivo. Bovendien, hoewel muis, rat en menselijke stamcellen kunnen worden uitgevoerd in de 3D constructen, de isolatie en vooral de differentiatie en rijping van landbouwhuisdieren afgeleide spierstamcellen niet zo ver ontwikkelde nog 1. Ook het gebruik van Matrigel en dierlijke oorsprong serum moet worden weggelaten 1. Om verder de toepassing regeneratieve geneeskunde, de weefselgrootte moet worden vergroot, en vereist (neo) vascularisatie en gebruik van perfusie bioreactor systemen zuurstof en voedingsstoffen diffusie beperkingen te overwinnen. Sommige initiële vascularisatie studies op kleine constructies have is gedaan in de afgelopen jaren 9,17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Yabin Wu bedanken voor het kweken van de weefsels die in figuur 2, werd de foto genomen door Bart van Overbeeke. Het werk werd financieel ondersteund door SenterNovem, subsidie ISO 42022.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel-growth factor reduced | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM (high glucose)* | Gibco | 42430 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Horse serum | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| 0.45 and 0.22 μm syringe filter* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipets | |
| Chick embryo extract | United States Biological | C3999 | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 - 1,1 mm | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 - 1,6 mm | |
| Pasteur pipet | VWR | 612-1702 | |
| Collagenase type I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm cell strainer* | BD Falcon | 352340 | |
| 19G needle | |||
| Elastomer | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Curing agent | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Collagen type I, rat tail | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Culture Pacer | Ionoptix | ||
| 6-well culture dishes for electrical stimulation | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish culture dish electrodes | Ionoptix | ||
| * Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit |
|||
References
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle. Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).
- Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro. In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).
- Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy. Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells. Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).
- Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).
- van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway. J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).
- Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
- Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).
- Li, Y., Pan, H., Huard, J. Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues. J. Vis. Exp. (41), e2011 (2010).
- Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering. J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).
- Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model. Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).
- Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC. , In revision (2013).
- Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
- Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).
