Summary
Engineered Muskelgewebe hat ein großes Potenzial in der regenerativen Medizin, als Krankheit Modell und auch als alternative Quelle für Fleisch. Hier beschreiben wir die Konstruktion von einem Muskel-Konstrukt, in diesem Fall von der Maus Myoblasten Vorläuferzellen, und die Stimulation durch elektrische Impulse.
Abstract
Engineered Muskelgewebe kann für verschiedene Zwecke verwendet werden, die die Produktion von Geweben für den Einsatz als eine Krankheit Modell in vitro, zB um Druckgeschwüre zu studieren, für die regenerative Medizin und als Fleisch Alternative 1. Die erste gemeldete 3D Muskel-Konstrukte wurden vor vielen Jahren und machte Pioniere auf dem Gebiet sind Vandenburgh und Kollegen 2,3. Advances in Muskelgewebe Technik gemacht sind nicht nur das Ergebnis aus dem großen Gewinn an Wissen über biochemische Faktoren, Stammzellen und Vorläuferzellen, sondern sind insbesondere auf der Basis von Erkenntnissen von Forschern gewonnen, dass physische Faktoren eine essentielle Rolle bei der Kontrolle von Verhalten der Zelle spielen und Gewebe Entwicklung. State-of-the-art engineered Muskel baut derzeit von Zell-besiedelten Hydrogel Konstrukten bestehen. In unserem Labor diese in der Regel aus murine Myoblasten Vorläuferzellen, aus murinen Hinterbein Muskeln isoliert oder einem murinen Myoblasten-Zelllinie C2C12, mixed mit einer Mischung aus Kollagen / Matrigel und ausplattiert zwischen zwei Verankerungspunkten, imitiert die Muskel Bänder. Andere Zellen können ebenfalls berücksichtigt werden, z. B. alternative Zelllinien wie L6 Ratte Myoblasten 4, neonataler Muskel abgeleitet Vorläuferzellen 5, aus adulten Muskelgewebe aus anderen Spezies, wie Mensch 6 oder sogar induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) 7 abgeleitete . Zellkontraktilität bewirkt Ausrichtung der Zellen entlang der langen Achse des Konstrukts 8,9 und Differenzierung der Muskel-Vorläuferzellen nach etwa einer Woche der Kultur. Außerdem kann die Anwendung der elektrischen Stimulation des Prozesses der Differenzierung teilweise 8 verbessern. Aufgrund seiner geringen Größe (8 x 2 x 0,5 mm) das komplette Gewebe analysiert mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie zB Rentabilität, Differenzierung und Ausrichtung der Zellen zu überwachen. Abhängig von der spezifischen Anwendung der Bedingungen für die engineered Muskelgewebe variieren, z. B. Einsatz für die regenerative Medizin erfordert die Upscaling von Gewebe Größe und Vaskularisation, während als ein Fleisch alternative Übersetzung in andere Arten ist notwendig, zu dienen.
Protocol
Ein. Kultur Murine Myoblast Vorläuferzellen oder C2C12 Zellen
- Isolat Zellen gemäß dem Protokoll anfänglich durch Shefer und Kollegen 10 veröffentlicht und später von Collins et al. 11 und Boonen et al. 12 angepasst und speichern diese in flüssigem Stickstoff. Dies erfordert Mäusen, zB C57Bl / 6. Alternative Verfahren sind in anderen Labors verwendet werden, zB ein Verfahren, in Journal of Visualized Experiments durch Li Y et al. 13. Für die Reagenzien und Ausrüstung, die Sie in der Tabelle auf Seite 7 und 8 bezeichnet. Von den Muskel aus einer Maus, die Sie in der Regel erhalten, genügend Zellen auf etwa 20 Ampullen in flüssigem Stickstoff Kryokonservierung. Als nächstes starten wir das Protokoll, um die Zellen aus dem flüssigen Stickstoff Speicher auftauen.
- Platzieren der Zellen von 1 Fläschchen in einen 25 cm 2 Matrigel (1 mg / ml) beschichteten Gewebekulturplatten eingewogen und Wachstumsmedium (GM), die aus (335 ml DMEM fortgeschrittene, 100 ml fötalem bovine Serum (FBS), 50 ml HS, 5 ml Penicillin / Streptomycin, 5 ml L-Glutamin, 5 ml Hühnerembryo Extrakt (CEE)).
Hinweis: Mantel für 2 Stunden bei Raumtemperatur und entfernen Sie die Matrigel durch Aspiration.
- Subkultur die Zellen etwa 1:3 alle 3 Tage.
Das bedeutet: am Tag 3: Passage Zellen aus einem 25 cm 2 auf eine 75 cm 2-Kolben, am Tag 6: passage Zellen aus einem 75 cm 2 Kolben auf zwei 150 cm 2-Kolben (mit 30 min Vorabscheidungsbehandlung in unbeschichteten Kolben). Am Tag 9 Transfer ein 150 cm 2 Kolben 1 Dreibettzimmer 150 cm 2-Kolben oder falls nicht verfügbar zu drei 150 cm 2 Flaschen (falls erforderlich Vorbeschichtungszyklus wiederum abhängig vom Phänotyp der Zellen). Am Tag 12 die Zellen sind bereit für die Aussaat in einen Muskel Konstrukt.
Hinweise: - Per Triple 150 cm 2 die Anzahl der Zellen wird etwa 4,5 x 10 6 Zellen.
- Über Verwendungls aus unterschiedlichen Isolierungen zu mischen, um eine gemischte Population von Zellen zum Zeitpunkt der Aussaat zu erhalten.
Hinweis: Wenn Sie nicht mit primären Zellen arbeiten wollen, sind C2C12 Myoblasten eine gute Alternative.
2. Engineering Skeletal Muscle Tissues
- Bereiten Silikonkleber durch Mischen des "Elastomer" mit dem "Härter" (10:1). Cut + / - 5 mm quadratische Segmente von Klett mit einem dreieckigen Seitenteilen (Haus-Form; Abbildung 1). Leim das Klettelement in die Wells einer 6-Well-Kulturplatte in einem Abstand von etwa 12 mm zwischen den Quadraten.
Hinweise: - Verwenden Sie nur die weiche Seite des Velcro und das Gesicht dieser Seite nach oben.
- Sicherstellen, dass die Dächer einander gegenüberliegen.
- Nur decken den Klettverschluss mit Silikonkleber, nicht Kleber während der gut verteilt.
- Für die spätere elektrische Stimulation ist es sinnvoll, die Konstrukte in vertikaler Richtung des Bohrlochs auszurichten plaß (entlang der langen Achse).
- Lassen Sie es über Nacht trocknen im Vakuumofen, nicht beheizt, vor allem um Luftblasen zu entfernen. Sterilisieren durch Zugabe von 70% igem EtOH zu den Vertiefungen, Inkubation für 15 min. Abspülen mit PBS 3x und legte unter UV für 15 min. Entfernen Sie alle PBS aus dem Brunnen und den Klettverschluss und Ort im Inkubator bis zur Verwendung.
- Auftauen Matrigel-Lösung in den Kühlschrank und bereiten die Kollagenlösung auf die gewünschte Konzentration kurz bevor die 3D-Konstrukte. Verdünnt das Lager Kollagen mit steriler 0,02% Essigsäure (Endkonzentration 3,2 mg / ml).
Hinweis: lassen Sie alles auf Eis.
- Trypsinieren die Zellen, in GM und zählen zu resuspendieren. Lassen Sie Zellen in Zentrifugenröhrchen im Inkubator.
- Fügen Sie die gewünschte Menge an Collagen Stammlösung für die Zahlen von Konstrukten, die Sie an einem Rohr (gemäß Tabelle 1) machen wollen, fügen Sie 0,5 M NaOH zu dieser Kollagenlösung bis zu einem hellrosa color ist, die einen pH-Wert von 7,5. Vorsichtig mischen durch Auf-und Abpipettieren und vermeiden Blasenbildung. Dann fügen Sie die Matrigel und mischen sehr sanft, aber gründlich. Schließlich, fügen Sie die GM auf die Kollagen / Matrigel Mischung (für die entsprechenden Mengen siehe Tabelle 1).
Hinweise: - Führen Sie jeden Schritt auf dem Eis! Matrigel und Kollagen wird leicht Gel bei steigender Temperatur.
- Vorsicht, dass die Farbe der Tat ist rosa! Eine Erhöhung des pH-Wertes wird auch induzieren schnelle Gelierung.
- Final Konzentration von Kollagen: 1,6 mg / ml.
- Zentrifuge die gewünschte Menge der Zellen bei 1000 rpm für 5 min und Überstand.
Anmerkung: - Je nach Aktivität der Zellen die Anzahl der Zellen pro Konstrukt angepasst werden muss. Typischerweise liegt die Anzahl der Zellen, die zwischen 750.000 und 1.250.000 Zellen pro Konstrukt.
- Verwenden einige der Gelmischung, um das Zellpellet zu resuspendierenund Übertragung der Zellen in das verbleibende Gemisch und sorgfältig vermischt, jedoch ohne Einleiten von Luftblasen.
- Nehmen die vorerhitzten Well-Platten aus dem Inkubator und Pipette 0,35 -0,4 ml der Zell-Gel-Gemisch in den ersten Klettverschluss. Dann beginnen, um die Mischung aus der Mitte zwischen den Befestigungsstellen pipettieren und reichen bis zum Klettverschluss. Schließlich verwenden den Rest des Gels zu füllen die Lücke zwischen den beiden Velcro Anker und Pipette um die Velcro Stücke.
- Vorsichtig nach 5-10 min überprüfen, ob die Gele solide genug übertragen werden sollen, dh leicht abklopfen Gerichte und Sichtprüfung, wenn das Gel ist starr. Wenn ja, legen Sie sorgfältig die Gerichte in einem Inkubator. Normalerweise können sie nach zehn Minuten abgeholt. Dann wird nach 1-2 Stunden, sanft überlagern Gels mit 4 ml warmem GM.
Hinweis:-Nehmen Sie keine heftigen Bewegungen beim Umgang mit den Platten.
- Ersetzen GM durch Differenzierung Medium (Wachstumsmediumohne Hühnchenembryoextrakt) nach 24 h und mit frischem Medium alle 2-3 Tage zu ersetzen. Am Tag 7 sollten Sie reifen orientierten Muskelfasern erhalten haben, wie sie mit Färbung für Querstreifung Entwicklung in den fusionierten Muskelfasern ausgewertet werden.
3. Elektrostimulation
- Sterilisieren Sie die Elektroden aus dem ionoptix Platte (siehe Tabelle von Reagenzien und Geräte) vor dem Gebrauch mit 70% Ethanol und anschließend trocken unter UV in einer Sicherheitswerkbank. Die Platte mit Elektroden auf die Kulturplatte mit den Konstrukten und decken mit dem Deckel von der Kulturplatte und Transfer in einem Inkubator. Schließen Sie das Ionoptix C-Schrittmacher mit den entsprechenden Kabeln.
Anmerkung: sind Elektroden parallel neben den Muskel-Konstrukt (Abbildung 2) platziert.
- Übernehmen Sie die Stimulationsprotokoll wie erwartet.
Hinweis: Wir verwenden in der Regel 4 V / CM,6ms Impulse mit einer Frequenz von 2 Hz. Ändern Kulturmedium alle 24 Stunden während der Stimulation.
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Representative Results
Das Endprodukt wird Muskel-Konstrukte wie in 3 angedeutet ist. Die Größe des Gewebes ca. 8 mm lang, 2 mm breit und 0,5 mm dick sein. Elektrische Stimulation während der Differenzierung ändert die Expression von Myosin schwere Kette-Isoformen, aber nicht wesentlich bessere Differenzierung wie durch den Differenzierungsmedium 8 induziert wird, sondern eine elektrische Stimulation kann auch am Ende des Verfahrens angewendet werden, um für die Funktionalität des Muskels zu überprüfen Da ein Muskel mit voll entwickelten Sarkomere können auf einen elektrischen Impuls zusammenziehen.
Differenzierung und Reifung kann auch mittels quantitativer PCR für die Genexpression Auswertung und Färbung für Muskel Reifungsmarker oder Querstreifung Entwicklung (zB Färbung für alpha actinin) entweder auf Abschnitte aus den Geweben oder ganze Berg gefärbten Gewebeproben durchgeführt werden. Muscle Reifung und Differenzierung Beziehungented Genen und Myosin schwere Kette Ausdruck gehören zB MyoD, myogenin, MFR4 und MLP und MYH 1, 2, 4 und 8 8. Nachweis, dass das Muskelgewebe die tatsächlich gebildet Muskelgewebe auf die Genexpression, Immunhistochemie und Kontraktion durch elektrische Stimulation Induktion basiert, wurde bereits veröffentlicht 8 und eine Zahl mit angefärbten Querschnitte Muskelgewebe aus Myoblasten-Vorläuferzellen und C2C12 Zellen aus diesem Papier wird in Abbildung 4 dargestellt.
| Lösung | Volume (falls machen 10 Muskeln) in ul |
| Kollagen (3,2 mg / ml, verdünnt mit 0,02% Essigsäure) | 2570 (51,3%) |
| NaOH (0,5 M) | 10 (0,2%) |
| Matrigel | 430 (8,6%) |
| Wachstumsmedium | 2000 (39,9%) |
| gesamt | 5.010 (sollte genug für Verschütten und Pipettieren Verlust genügt) |
Tabelle 1. Mischung aus Zellen und Gel für die Erzeugung eines Gewebezüchtungen Muskel konstruieren.
Abbildung 1. Schneiden Sie die Stücke von Klett.
Abbildung 2. Ein Bild von der Unterseite eines Muskels Konstrukts in einer Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen, die die Platzierung der Elektroden genommen. Die Elektroden (angedeutet mit den weißen Pfeilen) parallel zu den Muskelfasern platziert Konstrukte.
Abbildung 3. Eine Gewebemarkiervorrichtungentworfen Muskel zwischen zwei Stücken von Velcro in einer 6-Well-Kulturplatte.
Abbildung 4. Typische Beispiele für Querstreifung in C2C12 (A) und MPC (B) in engineered Skelettmuskel Geweben. Gefrierschnitte von nicht stimulierten mBAMs (Tag 8 der Differenzierung) wurden für sarkomerischen α-Actinin (rot), sarkomerischen Myosin (grün angefärbt ) und Kernen (blau). (Aa-Ab und Ba-Bb) Vergrößerungen von boxed Bereichen (A, B) α-Actinin (rot) und sarcomeric Myosin (grün). Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von 8. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen.
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Discussion
Das Engineering von Muskelgewebe hat ein großes Potenzial für den Einsatz als eine Krankheit Modell für Wirkstoff-Screening, in der regenerativen Medizin und für die Fleischproduktion. Allerdings unterscheiden sich die Anforderungen für diese Anwendungen. Wir entschieden uns, mit einer Kombination aus Collagen und Matrigel arbeiten, weil Kollagen ermöglicht Zellausrichtung und weil die Myoblasten Vorläuferzellen erfordern das Vorhandensein von Basalmembran abgeleitete Proteine wie in früheren Studien 2D 12 bestimmt. Außerdem haben Fibringele in unserem Labor getestet und scheinen nicht zu den C2C12 Myoblasten und Vorläuferzellen zu unterstützen ebenso die Mischung von Kollagen und Matrigel ™ und vor allem nicht um Gewebe Verdichtung 14 führen. Das Modell, wie hier beschrieben wurde bereits in Studien zur Dekubitus Schäden verwendet werden, während unter Verwendung eines Zell-Linie 15. Für die regenerative Medizin-Anwendungen, hat die Übersetzung für die menschliche Satelliten-Zellen vor kurzem 6,16 gemacht. Zusätzlichals alternative Quelle für den Fleischkonsum die Technik hat ein großes Potenzial ein. Unserer Meinung jedoch benötigt die derzeitige Technologie zu einer nächsten Stufe vorrücken zu seiner Verwendung in der Klinik als auch zum Verzehr zu fördern. Beispielsweise hält der Differenzierung auf der ganzen neonatalen Stufe sowie Kraftproduktion wesentlich weniger als ein Muskel in vivo produziert. Darüber hinaus, obwohl Maus, Ratte und menschlichen Stammzellen in den 3D-Konstrukte, die Isolierung umgesetzt werden können und vor allem die Differenzierung und Reifung von Nutztieren abgeleitet Muskel-Stammzellen ist noch nicht so weit 1 entwickelt. Auch, um die Verwendung von Matrigel und tierischen Serum hergeleitet Bedürfnisse 1 weggelassen werden. Um die Anwendung in der regenerativen Medizin zu fördern, hat das Gewebe Größe erhöht werden soll, und erfordert (neo) und die Verwendung von Vaskularisierung Perfusionsbioreaktor Systemen für Sauerstoff und Nährstoffdiffusion Einschränkungen zu überwinden. Einige erste Vaskularisierung Studien an kleinen Konstrukte have in den vergangenen Jahren 9,17,18 getan.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren wollen Yabin Wu für die Kultivierung der Gewebe in Abbildung 2 dargestellt danken, wurde das Bild von Bart van Overbeeke genommen. Die Arbeit wurde finanziell unterstützt durch SenterNovem, Gewährung ISO 42022 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel-growth factor reduced | Beckton and Dickinson | ||
| DMEM (high glucose)* | Gibco | 42430 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491 | |
| Horse serum | Gibco | 65050-122 | |
| Fetal bovine serum | Greiner | 758075 | |
| 0.45 and 0.22 μm syringe filter* | Whatmann (Schleicher and Scheull) | 10462100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030024 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 10378016 | |
| Amphotericin | Gibco | 15290-018 | |
| Culture plastic | Greiner | Includes culture flasks and pipets | |
| Chick embryo extract | United States Biological | C3999 | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 0,9 - 1,1 mm | |
| Pasteur pipet* | Hilgenberg | Pasteur pipettes, with constriction, with cotton, open tip L: 230 mm with tip diameter of 1,4 - 1,6 mm | |
| Pasteur pipet | VWR | 612-1702 | |
| Collagenase type I* | Sigma | C0130-16 | |
| 40 μm cell strainer* | BD Falcon | 352340 | |
| 19G needle | |||
| Elastomer | Dow Corning corporation | 3097358-1004 | Silastic MDX 4-4210# |
| Curing agent | Dow Corning corporation | Silastic MDX 4-4210# | |
| Velcro | Regular store | You can buy this at a regular store, only use the soft side | |
| Collagen type I, rat tail | BD Biosciences | 3544236 | |
| C-Pace EP Culture Pacer | Ionoptix | ||
| 6-well culture dishes for electrical stimulation | Beckton Dickinson-Falcon | BD Falcon #353846 | |
| C-Dish culture dish electrodes | Ionoptix | ||
| * Needed for the isolation of cells (point 1.1) # Together in one kit |
|||
References
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