Summary
نقدم تدفق الخلوي على أساس طريقة لدراسة تطور الخلايا T
Abstract
A نظام صحي المناعي يتطلب أن الخلايا T المستضدات الخارجية الرد على حين تبقى تسامحا في تقرير المصير، مستضدات. إعادة ترتيب عشوائية من مستقبلات الخلايا T (TCR) α β ومواضع يولد مرجع خلية T مع تنوع واسع في خصوصية المستضد، سواء في تقرير المصير والأجنبية. اختيار مرجع خلال التنمية في الغدة الصعترية هو أمر حاسم لتوليد خلايا T آمنة ومفيدة. عيوب في اختيار التوتة المساهمة في تطوير اضطرابات المناعة الذاتية ونقص المناعة 1-4.
الأسلاف خلية T دخول التوتة كما نقرا thymocytes (DN) السلبية التي لا تعبر عن CD4 CD8 أو شارك في مستقبلات. التعبير عن كل من شارك وαβTCR مستقبلات يحدث في مرحلة (DP) إيجابية مزدوجة. تفاعل مع αβTCR الذاتي الببتيد-MHC (PMHC) قدم من قبل خلايا الغدة الصعترية يحدد مصير خلية توتية DP. التفاعلات تؤدي إلى تقارب عالية التحديد السلبية وeliminaنشوئها من ذاتية التفاعل thymocytes. انخفاض نتيجة التفاعلات الإيجابية تقارب في اختيار وتطوير CD4 CD8 واحد أو إيجابية (SP) خلايا T قادرة على الاعتراف المستضدات الخارجية المقدمة من MHC الذاتي 5.
يمكن دراستها اختيار الإيجابية في الفئران مع ذخيرة بولكلونل TCR (wildtype) من خلال مراقبة الجيل من الخلايا T الناضجة. ومع ذلك، فإنها ليست مثالية لدراسة اختيار السلبية التي ينطوي حذف السكان مستضد محددة الصغيرة. وقد استخدمت العديد من أنظمة نموذج لدراسة اختيار السلبية ولكنها تختلف في قدرتها على تلخيص الأحداث الفسيولوجية 6. على سبيل المثال، في المختبر من التحفيز thymocytes تفتقر إلى البيئة الغدة الصعترية التي تشارك عن كثب في الاختيار، في حين إدارة مستضد خارجي المنشأ يمكن أن يؤدي إلى غير محددة حذف thymocytes 7-9. حاليا، أفضل الأدوات لدراسة في الجسم الحي هي اختيار السلبية الفئران التي تعبر عن transgenic TCR محددة لمستضد الذاتية الذاتي. ومع ذلك، وتتميز العديد من النماذج الكلاسيكية المعدلة وراثيا من قبل TCR المبكرة التعبير عن سلسلة TCRα المعدلة وراثيا في مرحلة DN، مما أدى إلى اختيار سابق لأوانه السلبية. وقد وضعت مختبرنا النموذج CD4 HY، وهو ما يعبر عنه في مشروط HY المعدلة وراثيا TCRα في مرحلة DP، مما يسمح لاختيار سلبية تحدث أثناء الانتقال إلى DP SP كما يحدث في الفئران wildtype 10.
هنا، نحن تصف تدفق الخلوي على أساس بروتوكول لفحص الغدة الصعترية اختيار الإيجابية والسلبية في نموذج الفأر HY CD4. في حين اختيار سلبية في الفئران CD4 HY هو الفسيولوجية للغاية، ويمكن أيضا أن تطبق هذه الأساليب لغيرها من النماذج المعدلة وراثيا TCR. سنقدم أيضا الاستراتيجيات العامة لتحليل إيجابي في اختيار ذخيرة بولكلونل ينطبق على أي تلاعب الفئران وراثيا.
Protocol
الرجوع إلى الشكل 1 مخطط شامل للبروتوكول التجريبية.
1. تشريح
- مكان الصلب شبكة العقيمة الشاشة إلى 60 × 15 مم طبق بتري. وهناك حاجة وحدة واحدة لكل عينة الأنسجة.
- إضافة 5 مل من محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) إلى كل طبق. إبقاء الأطباق على الجليد.
- الموت ببطء مع الفئران CO 2.
- آمنة الماوس لسطح تشريح، جنبا بطني مواجهة. رذاذ الفأر مع الايثانول 70٪ للتعقيم والتي تكفل متعقد الفراء أسفل.
- باستخدام مقص جراحي، تبدأ بجعل تشريح شق بطني في الجلد في منطقة البطن فقط فوق الأعضاء التناسلية. تمديد صعودا إلى شق الذقن.
- من خط الوسط، تمديد شق أسفل على طول جميع الأطراف. سحب الجلد فضفاضة ويعلقون عليه إلى السطح تشريح.
- حصاد الغدة الصعترية:
- رفع الطرف السفلي من عظمة القص إلى إجراء شق.
- تجنب الكبد، قطع الحجاب الحاجز لفصل القفص الصدري ثم قطع القفص الصدري على كل جانب. قطع ما يزيد على كل جانب القفص الصدري، مع الحرص على تجنب الرئتين والقلب.
- سحب بلطف مرة أخرى القفص الصدري مع ملقط. الغدة الصعترية هي بيضاء، جهاز الفص تقع فوق القلب. باستخدام حافة مسطحة من ملقط لفهم الجزء السفلي من فصوص، وسحب بلطف الغدة الصعترية ووضعه على الشاشة شبكة.
- حصاد الطحال:
- الطحال هو أحمر، ركوب الأمواج على شكل الجهاز الموجود على الجانب الأيسر من تجويف البطن الماوس،، تحت الكبد.
- إجراء شق في تجويف البطن. سحب بلطف من الطحال مع زوج واحد من الملقط، وذلك باستخدام الزوج الثاني لندف بعيدا النسيج الضام. وضع الطحال على شاشة شبكة منفصلة.
2. خلية إعداد
- باستخدام المكبس من المحاقن مل 3، طحنأجهزة المستمر على شاشة شبكة النسيج الضام حتى فقط وبقايا الدهون. شطف مع شبكة HBSS من الطبق ثلاث مرات. استخدام المكبس جديد لكل عينة الأنسجة.
- ويمكن استخدام خيارات أخرى لالمجانسة الأنسجة بدلا من هذا الأسلوب.
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 335 x ج لمدة 5 دقائق في C. ° 4
- إعادة تعليق splenocytes في 500 ميكرولتر من العازلة تحلل ACK (0.15 M NH 4 الكلورين، 10 ملم KHC0 3، 0.1 مم نا 2 EDTA، ودرجة الحموضة 7.2) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. thymocytes إعادة تعليق على 20 × 10 6 خلية / مل العازلة FACS في (PBS، 1٪ FCS، 0.02٪ أزيد الصوديوم) وتوضع جانبا على الجليد.
- العودة إلى splenocytes تعادل التوتر عن طريق إضافة 5 مل من HBSS. splenocytes بيليه بواسطة الطرد المركزي و resuspend في 20 × 10 6 خلية / مل العازلة FACS في. إذا الخلايا تحتاج للبقاء العقيمة، يمكنك استخدام معقم RPMI + FCS 10٪.
3.تلطيخ الخلايا لقياس التدفق الخلوي
والغرض من هذا البروتوكول هو تحديد استراتيجيات لتحليل اختيار الإيجابية والسلبية باستخدام wildtype (WT) والفئران HY CD4. لاعتبارات عامة تتعلق تدفق الخلوي التجريبية تصميم وحيازة، والتحليل، ونشير إلى القراء استعراض ممتاز من قبل تونغ وآخرون 11
- قسامة 4 × 10 6 thymocytes لكل عينة التدفق الخلوي إلى كل بئر من لوحة 96-حسنا، وكذلك 1 × 10 6 splenocytes WT في السيطرة التعويض. في حالة استخدام الفئران المعدلة وراثيا، يجب أن تشمل الماوس WT كعنصر تحكم في تجربتك.
- منع المستقبلات من التيسير احتضان الخلايا مع anti-CD16/32 (استنساخ 2.4G2) لمدة 10 دقيقة على الجليد.
- تدور في 335 XG وحة في C ° 4 لمدة 5 دقائق. إزالة الغطاء وتبديد السائل من الآبار بواسطة عبها لوحة واحدة، تواجه أسفل إلى بالوعة. إعادة تعليق كل بئر في 200 ميكرولتر من العازلة FACS. تكرار الغسيل.
- إعداد الكوكتيلات الأجسام المضادة على النحو المبين أدناه، وذلك باستخدام تركيز الأمثل للكل الأجسام المضادة على أساس التخفيف في 200 ميكرولتر من العازلة FACS لكل بئر. يتم تعريف التركيز الأمثل للكل الأجسام المضادة كما تحتوي على نسبة أقل حاجة لإعطاء أكبر فصل السكان الإيجابية والسلبية. إذا لم يكن هناك سكان السلبية لجسم معين، ينبغي إدراج نمط إسوي جسم مضاد. يمكن زيادتها إجمالي حجم لكل بئر أسفل (على سبيل المثال إلى 100 ميكرولتر لكل بئر) اذا شئت.
- WT الغدة الصعترية: مكافحة TCRβ، ومكافحة CD4، ومكافحة CD8، ومكافحة CD69 أو مكافحة CD5، CD24 المضادة لل
- CD4 HY الغدة الصعترية: مكافحة HY TCR (T3.70)، ومكافحة CD4، ومكافحة CD8، ومكافحة CD69 أو مكافحة CD5، CD24 المضادة لل
للحصول على أفضل فصل CD69 CD69 الصغرى والسكان في thymocytes مرحبا، فمن المستحسن أن يتم استخدام الأجسام المضادة لمكافحة CD69 المعقدة البيروكسيديز الأساسي، تليها الثانوية البقعة التي تحتوي على ملون تألقي، مترافق streptavidin. نحن عSE نفس الاستراتيجية لCD5 تلطيخ.
- احتضان خلايا مع 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة في كوكتيل العازلة FACS لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام.
- المتزامنة مع تلطيخ كوكتيل الأجسام المضادة، وصمة عار كل عنصر تحكم التعويض مع الأجسام المضادة ملون تألقي، مترافق واحد. من الناحية المثالية، وتلطيخ التعويض ينطوي على نفس الأجسام المضادة المستخدمة في كوكتيل الأجسام المضادة. ومع ذلك، قد تلطيخ لكل مستضد الفردية لا يكون ممكنا للحصول على أكبر التجارب عندما يتم يعاير مستضدات عديدة. ولذلك، فمن المستحسن لتلطيخ CD4 المضادة للأو CD8 المضادة، بسبب التعبير عالية من هذه المضادات، أو استخدام الخرز التعويض. وصمة عار في المخزن المؤقت FACS لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام. ترك عنصر تحكم واحد التعويض غير ملوثين.
- غسل الخلايا مرتين مع العازلة FACS.
- إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS ونقلها لأنابيب FACS.
- الحصول على عينات على قياس التدفق الخلوي. وتشمل اقتناء FSC-A-W وFSC إلىllow صدرة للتمييز.
4. تحليل البيانات قياس التدفق الخلوي - غير TCR الفئران المعدلة وراثيا
نستخدم FlowJo التدفق الخلوي لتحليل البيانات. الرجوع إلى الشكل 2A للاستراتيجية النابضة لالفئران المعدلة وراثيا غير TCR.
- باستخدام FSC-A بواسطة SSC، بوابة إلكترونيا على السكان "اللمفاويات".
- بين السكان "اللمفاويات"، استخدم FSC-A-W من قبل FSC إلى البوابة إلكترونيا السكان الصغرى FSC-W لاستبعاد الخلايا والحلل aggregrates. هذا هو "القميص" البوابة.
- باستخدام الأحداث في بوابة "القميص" قطعة من CD8 CD4. رسم بوابات للDN، DP مملة، DP مشرق، CD4 + CD8 الصغرى، وCD4SP CD8SP السكان كما هو مبين في الشكل 2B.
- تحت أبواب CD4SP وCD8SP، وخلق TCRβ من CD24 المؤامرات. استخدام أداة لرسم النابضة رباعي بوابات كما هو مبين في الشكل 2C.
- إنشاء شمال شرقث مؤامرة من "القميص" البوابة: TCRβ من CD69. رسم بوابات A، B، C، D كما هو مبين في الشكل 2D.
- خلق آخر من المؤامرة "القميص" البوابة: TCRβ من CD5. رسم بوابات الأول والثاني والثالث والرابع كما هو مبين في الشكل 2E، وهذا هو استراتيجية أخرى لدراسة اختيار إيجابية.
- تطبيق DN، DP مملة، DP مشرق، وكثافة العمليات CD4، وبوابات CD4SP CD8SP من تحت "القميص" لط بوابات والثاني والثالث، والرابع، A، B، C، D (الشكل 2D، E).
- حساب عدد الخلايا في مجموعة فرعية معينة عن طريق ضرب الخلوية الجهاز من وتيرة من كل باب لاحق حتى تصل السكان التي تستهدفها. على سبيل المثال، سيتم تحديد عدد TCRβ thymocytes CD69-CD8SP مرحبا من قبل الغدة الصعترية الخلوية X٪ TCR بهي CD69-(جزء D) X CD8SP٪.
- عد يأخذ في الاعتبار بالفعل الخلايا الحية والميتة حتى لا تشمل lymphoc "YTE "البوابة في الحسابات الخاصة بك.
5. تحليل البيانات قياس التدفق الخلوي - TCR المعدلة وراثيا الفئران
الرجوع إلى الشكل 3A للاستراتيجية النابضة لالفئران المعدلة وراثيا TCR.
- اتبع الخطوات من 4.1 و 4.2 كما في المقطع السابق.
- تحت بوابة "القميص"، إنشاء T3.70 من مؤامرة SSC وبوابة على T3.70 + السكان خلية لتحليل مستضد محددة الخلايا T (الشكل 3B). في بعض الحالات، قد يكون من مصلحة هذه الفئة من السكان مقارنة للمستضد غير محددة (T3.70) السكان خلية T.
- بين السكان + T3.70، تعادل DN، DP، CD4SP وCD8SP بوابات (الشكل 3C).
- لعينات التحكم WT، ووضع هذه البوابات تحت بوابة "القميص" أو إنشاء بوابة T3.70 كما سيكون هناك عدد قليل جدا من T3.70 + الخلايا.
- تحت بوابة CD8SP، إنشاءT3.70 من CD24 المؤامرة. استخدم أداة لتقسيم النابضة رباعي الخلايا إلى أربع السكان (الشكل 3F).
- إنشاء رسم بياني يصور CD69 التعبير مضافين في المقصورة DP من الفئران WT وT3.70 مقصورة DP + CD4 من الفئران HY (الشكل 4A). تكرار لدراسة CD5 التعبير (الشكل 4B).
- حساب العدد المطلق للخلايا في كل فرعية من الفائدة في 4.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الفيزيولوجية نماذج المعدلة وراثيا والفئران WT TCR، واختيار الإيجابي يبدأ في مرحلة DP مشرق قبل أن ينتقل إلى مرحلة DP مملة بعد اللقاء مستضد. thymocytes DP مملة ثم أدخل CD4 CD8 + الانتقالية المرحلة الصغرى قبل أن يصبح CD4SP أو thymocytes CD8SP (الشكل 2B). وتتميز ناضجة thymocytes SP من التعبير TCR عالية وفقدان CD24 (الشكل 2C). في حين يمكن للCD8 CD4 بواسطة الشخصي يمكن أن تكشف عن العيوب في اختيار إيجابية، ودراسة TCRβ من CD69 أو CD5 توفير مزيد من التبصر في حيث يكمن الخلل. وupregulated كل CD69 وCD5 بعد التحفيز TCR، مع أقوى التفاعلات القيادة العليا التعبير عن هذه العلامات.
على TCRβ من CD69 المؤامرة، بوابة A (TCRβ لو CD69) يمثل عدد سكانها thymocytes DP الاختيار الأولي، بوابة B (كثافة العمليات TCRβ CD69 +) يمثل TRالسكان ansitional مباشرة بعد الاشتباك TCR، بوابة C (TCRβ مرحبا CD69 +) يمثل السكان من الخلايا مباشرة بعد اختيار إيجابية، وبوابة D (TCRβ مرحبا CD69 -) يمثل عدد سكانها أكثر نضجا من الخلايا (الشكل 2D). في الماوس WT، بوابة A يتكون من خلايا DP مشرق، في حين بوابة B تتكون أساسا من مشرق DP DP مملة مع بعض وCD4 + الخلايا CD8 الصغرى. بوابة C تتكون أساسا من مملة DP، CD4 + CD8 الخلايا الصغرى وCD4SP، في حين بوابة D تتكون أساسا من CD4SP وCD8SP. قد غياب B C السكان ويكون مؤشرا على ضعف اختيار إيجابية. وقد يكون للتغيرات في نسبة CD4SP لCD8SP داخل D السكان تشير إلى تغيرات في نسب الالتزام. قد فقدان C D السكان وتعكس القضايا بقاء بعد اختيار إيجابية.
دراسة TCRβ من CD5 هو آخر ر استراتيجيةس تحديد السكان الاختيار قبل وبعد إيجابي. ط السكان (TCRβ لو CD5 الصغرى) تمثل الاختيار المسبق للthymocytes DP والسكان الثاني (TCRβ لو CD5 INT) هي خلايا بدء اختيار إيجابية (2E الشكل). هؤلاء السكان تتألف أساسا من thymocytes DPbright. السكان الثالث (TCRβ الباحث CD5 مرحبا) يمثل thymocytes في عملية الاختيار تمر إيجابية وتتألف أساسا من مملة وCD4 + DP CD8 thymocytes الصغرى. السكان الرابع (TCRβ مرحبا مرحبا CD5) تتكون أساسا من بعد إيجابي thymocytes SP الاختيار. الجيل الثاني من ضعف السكان والثالث يشير إلى خلل اختيار إيجابية. وقد يكون للتغيرات في نسبة CD4SP إلى داخل CD8SP الرابع السكان على الرغم من السكان طبيعية السابقة تشير إلى تغيرات في نسب الالتزام. قد يكون غياب رابعا السكان تشير إلى بقاء انخفضت بعد سلك إيجابيةنشوئها. على سبيل المثال، في TOX - / - الفئران، معيبة التمايز CD4SP يؤدي إلى انخفاض حاد في السكان الرابع، C و D في حين لا يزال سليما اختيار إيجابية 12. ويمكن ملاحظة العيوب الحقيقية في اختيار إيجابية مع تعطيل Bcl11b خلال المرحلة DP، الأمر الذي يؤدي إلى فقدان السكان C، B و D 13،14. RasGRP1 الفئران التي تعاني من نقص لديها عيب في وقت سابق اختيار إيجابية، مما أدى إلى وجود السكان فقط. (بيانات غير منشورة)
كما تتضمن اختيار السلبية حذف السكان مستضد محددة صغيرة، لوحظ وجود عيوب في أفضل هذه العملية باستخدام TCR الفئران المعدلة وراثيا. في الفئران CD4 HY، يمكن الكشف عن thymocytes معربا عن HY المعدلة وراثيا TCR مع الأجسام المضادة أحادية المنشأ T3.70 (الشكل 3B). وTCR HY تعترف المستضد HY ذكر محددة داخل الطبقة MHC قدم ID ب. وهكذا، HY CD4 الذكور (M) الفئران الخضوع السلبي لاختيار TCR HY
واحد من النماذج المعدلة وراثيا التحذير TCR هو أن يتم التعبير عن TCR المعدلة وراثيا للغاية في جميع أنحاء تطوير خلية توتية. ونتيجة لذلك، فإنه من الصعب اختيار لتوصيف مزيد من الإيجابية من خلال تحديد السكان على أساس TCR والتعبير CD69/CD5. ومع ذلك، CD69 التعبير وCD5 لا ترتبط قوة إشارة TCR. في الفئران WT، ومعظم thymocytes DP لا يخضع اختيار إيجابية أو سلبية، وهو ما يتطلب إشراك TCR PMHC، وبالتالي لا upregulate CD69 أو CD5. الفئران HY F CD4 لديهم عدد كبير من thymocytes T3.70 DP + الإيجابية التي تخضع الاختيار، كما يتضح من زيادة في السكان + CD69 مقارنة WT (الشكل 4A). اختيار السلبية ينطوي على قدر أكبر من الحوافز TCR تقارب من اختيار إيجابية؛ ويدل على ذلك ارتفاع التعبير عن CD69 على T3.70 thymocytes DP + CD4 في HY M الفئران، مما أدى إلى تحول سو ذروة الرسم البياني إلى اليمين. وينظر اتجاهات مماثلة مع CD5 التعبير (الشكل 4B). عند تحليل الغدة الصعترية في اختيار الفئران التلاعب وراثيا، أو دراسة CD69 التعبير CD5 يمكن تحديد ما إذا كان الخلل يكمن في إشارة TCR أو نتيجة المصب من التحفيز TCR.
الشكل 1. الخطة الشاملة للبروتوكول التجريبية.
الشكل 2. تحليل الغدة الصعترية في اختيار الفئران المعدلة وراثيا غير TCR. (A) استراتيجية الصب لتحليل الغدة الصعترية في اختيار الفئران المعدلة وراثيا غير TCR. (B) CD8 CD4 بواسطة الملف من الغدة الصعترية WT. (C) فحص نضج thymocytes SP بواسطة TCRβ والتعبير CD24. يمكن (D) يمكن تمييزها مراحل اختيار إيجابية من قبلCD69 التعبير بواسطة TCRβ، جنبا إلى جنب مع CD8 CD4 والتنميط في كل مجموعة فرعية. (E) TCRβ من CD5 هو استراتيجية أخرى التي يمكن استخدامها لفصل مراحل التطوير. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 3. تحليل الغدة الصعترية في اختيار الفئران CD4 HY. (A) استراتيجية الصب لتحليل الغدة الصعترية في اختيار الفئران المعدلة وراثيا TCR. (B) تواتر thymocytes معربا عن TCR HY (T3.70 +) في WT، HY F CD4 CD4 وHY M الفئران. (C) CD8 CD4 التي كتبها ملامح من السكان + T3.70 في الفئران المشار إليه. بالإضافة إلى الترددات، فإن العدد المطلق للT3.70 + DP (D) وخاصة T3.70 + thymocytes CD8SP (E) هي مؤشرات هامة لاختيار سلبية. (F) فحصنضج thymocytes CD8SP في الفئران المشار إليه. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
الشكل 4. التعبير عن علامات التنشيط CD69 (A) وCD5 (B) على thymocytes DP مجموع من WT وT3.70 + F thymocytes DP من CD4 CD4 وHY HY M الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمكن استخدام بروتوكول المعروضة هنا لدراسة اختيار الإيجابية والسلبية في غير المعدلة وراثيا والفئران TCR TCR المعدلة وراثيا. هذا البروتوكول يصف تلطيخ من المستضدات السطحية. لمزيد من التحليل للآليات الجزيئية، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لأداء تلطيخ الخلايا. نستخدم العلوم البيولوجية دينار بحريني Cytofix / Cytoperm لكيت البروتينات داخل الخلايا ومعظم العلوم البيولوجية دينار بحريني Foxp3 كيت تلوين لعوامل النسخ. نكتسب عادة عينات لدينا على الفور بعد تلطيخ. ومع ذلك، يمكن تخزين العينات بين عشية وضحاها في المخزن المؤقت FACS مع الفورمالديهايد 1٪ في 4 درجات مئوية في الظلام. تكون على علم بأن بعض fluorochromes والأجسام المضادة قد لا تكون متوافقة مع التثبيت.
لتحليل اختيار إيجابية، ونحن نوصي باستخدام المعقدة البيروكسيديز مكافحة CD69 أو مكافحة CD5 لتقديم أفضل الفصل بين السكان السلبية، وسيطة، والتعبير عن غاية (الشكل 2). كما هو موضح في النتائج الممثل،وهذه الاستراتيجية تساعد في التمييز النابضة عيوب في اختيار إيجابية من التزام النسب، والاثنان قد تتطلب متابعة مختلف. بالإضافة إلى جيل من thymocytes SP ناضجة، يمكن اختيار الإيجابية التي أكدت upregulation من IL-7Rα وCCR7. ومع ذلك، يتم التعبير عن هذه العلامات على مستوى منخفض على thymocytes DP بعد اختيار مقارنة thymocytes SP 15،16. لتحليل مفصل لمراحل النضج داخل المقصورة DP، يمكن قياس التعبير داخل الخلايا Zap70 17. هذا قد يكون مفيدا بشكل خاص في إثبات أن التجمعات السكانية التي التعبير مماثلة من علامات النضج، مثل الأول والثاني على المؤامرة TCRβ CD5 X (2E الشكل)، تمثل مراحل مختلفة من التنمية.
نموذج CD4 HY لديه مزايا إيجابية وتمثل الاختيار السلبية، وكذلك التعبير الفسيولوجية للTCR المعدلة وراثيا. ومع ذلك، يمكن تطبيق هذه الأساليب لنماذج أخرى TCR المعدلة وراثيا مع اعتبارات معينة. وتشمل دائما جسم مضاد ضد TCR المعدلة وراثيا في الاختيار لتمكين دراسة الخلايا T-مستضد محددة. بالنسبة لبعض التحليلات، فإنه قد يكون من مصلحة لمقارنة السكان مستضد محددة للسكان غير محددة باعتبارها الرقابة الداخلية. دراسة اختيار النماذج السلبية الأخرى المعدلة وراثيا في TCR يتطلب اعتبارات أخرى. مرحلة التنمية خلية توتية خلالها اختيار السلبية يحدث تختلف بين نماذج مختلفة المعدلة وراثيا TCR. HY CD4 thymocytes الدخول في مرحلة PMHC DP، وبالتالي تحليل السكان CD8SP ذرية HY-محددة هي قراءات صحيحة لاختيار السلبية 10،18 (الشكل 3). إذا اختيار سلبية تحدث أثناء الانتقال إلى DN DP كما هو الحال في الفئران HY الكلاسيكية 19، فإن تحليل الفائدة يكون وجود أو عدم وجود مستضد thymocytes DP محددة. اختيار مستضد ضد HY في كل مكان يحدث في التوتةالقشرة 20. في المقابل، واختيار السلبية ضد الأنسجة المقيدة مستضدات يحدث في الغدة الصعترية 21،22 النخاع. OT-I-RIP موفا الفئران ألخص هذا النوع من الاختيار، وهي أعرب عن مستضد البويضات تحت سيطرة الفئران المروج الانسولين، التي تنشط فقط في النخاع الغدة الصعترية والبنكرياس 23. لأن المطلوب أولا اختيار الإيجابية للthymocytes DP الغدة الصعترية في قشرة للهجرة في النخاع، وغياب النضج (CD24 الصغرى) OT-I TCR + thymocytes CD8SP يشير اختيار السلبية ناجحة في الفئران مزق موفا OT-I 24.
أثناء استخدام الفئران المعدلة وراثيا TCR ديها ميزة كونها قادرة على دراسة عدد كبير من المستضد محددة الخلايا، يتم تبديل التحذير المحتملة T تطور الخلايا بسبب بروابط محدودة التي يمكن التوسط اختيار الإيجابية والسلبية لTCR المعدلة وراثيا. في ذاتيا RAG HY CD4 الفئران، وآخر التحذير هو أن شارك في التعبير عن endogeسلاسل TCRα عقل لديه القدرة على اختيار تعدل الإيجابية والسلبية على أقلية من thymocytes HY + TCR. هذا التحذير ليست فريدة إلى HY CD4 نموذج، بل نماذج TCR المعدلة وراثيا بشكل عام. وتستمد CD4 HY قدم الممثل من الفئران CD4 HY على خلفية خرقة ذاتيا. على الرغم من أن أكثر تعقيدا نوعا ما في الطبيعة، هناك العديد من الطرق لدراسة اختيار خلية توتية في وضع أكثر الفسيولوجية للتردد السلائف محدودة. على سبيل المثال، يمكن إنشاء TCR المعدلة وراثيا وWT نخاع العظم الوهم المختلطة للحد من المستضد محددة التردد السلائف خلية توتية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء استخدام الفئران فقط التي تعبر عن سلسلة TCRβ المعدلة وراثيا، مثل سلسلة Vb8 من TCR HY 25 أو سلسلة VB5 من TCR OT-I 26 إلى الحد تردد السلائف. لأن من إقران سلسلة TCRβ المعدلة وراثيا مع مختلف سلاسل TCRα الذاتية، وتتبع مستضد محددة إعادة thymocytesملازم استخدام tetramers PMHC. وجود قيود من هذا الأسلوب هو أن TCR التعبير منخفض جدا على thymocytes DP للسماح الكشف مع tetramers. وهذا يحد مزيد من الدراسة للالآليات الجزيئية في thymocytes DP التي تؤدي إلى اختيار الإيجابية والسلبية. وفي الآونة الأخيرة، تم استخدام مزيج من tetramers PMHC وتخصيب حبة المغناطيسي للتعداد الصغيرة، مستضد محددة من السكان CD4 + T الخلايا في الفئران unmanipulated 27.
وتوسط في المقام الأول اختيار السلبية بالحذف من نسيلي الذاتية التفاعل thymocytes عبر مسار موت الخلايا المبرمج الذاتية. ويمكن الكشف عن أفكارك thymocytes بواسطة التدفق الخلوي باستخدام الخلايا تلطيخ للالمشقوق كاسباس-3. وBH3 فقط بي سي-2 بيم أفراد الأسرة أمر ضروري لتفعيل كاسباس-3 في thymocytes ردا على التحفيز TCR 18،28. عن طريق عبور بيم الفئران التي تعاني من نقص في نماذج مختلفة المعدلة وراثيا TCR، وقد وجدت مختبرنا ما هو مطلوب لسلك بيم السلبيةنشوئها ضد المستضدات الذاتية في كل مكان ولكن ليس الأنسجة المقيدة المستضدات، مشيرا إلى وجود عدة آليات الاختيار السلبية 18،29. وقد تورط نهج مماثلة اليتيم Nur77 مستقبلات الستيرويد وسيط آخر مفتاح اختيار السلبية التوتة 30،31. وقد ولدت تحليل الترانسكربتي من thymocytes DP من الفئران CD4 HY قائمة من الجينات التي يسببها تحديدا خلال اختيار الإيجابية والسلبية 32. قد تطبيق الأساليب المعروضة هنا لالفئران التلاعب في هذه الجينات توفير نظرة ثاقبة على الآليات الجزيئية لاختيار الغدة الصعترية.
وهو مثالي لمتابعة النظر في اختيار التوتة مع تحليل للمقصورة المناعة الطرفية. ومع ذلك، غالبا ما يكون من الصعب فصل الحذف المركزي والمحيطي. وينعكس في نهاية المطاف اختيار سلبية بسبب عدم وجود المناعة الذاتية. على الرغم من أنها لها حدود، TCR الفئران المعدلة وراثيا هي وسيلة قوية وعملية لدراسة اختيار السلبية الفسيولوجية. معبر TCR الفئران المعدلة وراثيا لفئران نقص في جينات معينة هو وسيلة فعالة للتحقيق في الآليات الجزيئية لاختيار سلبية. من المهم أن تكون على علم، ومع ذلك، يمكن أن التهاب الطرفية نتيجة لخلل الجينات يسبب غير محددة حذف خلية توتية بوساطة السيتوكينات القشرية و7-9. في مثل هذه الحالات، يمكن تطبيق هذه الاستراتيجية المقدمة هنا في تحليل التوتة من الفئران حديثي الولادة قبل ظهور الالتهاب. اختيار إيجابية، من ناحية أخرى، يمكن أن تدرس في أي من TCR أو النماذج المعدلة وراثيا غير TCR، وتوفير المحققين متاعب التهجين. وهناك فهم أفضل للجزيئات المشاركة في اختيار الإيجابية والسلبية يؤدي إلى استراتيجيات جديدة لتشخيص وعلاج اضطرابات المناعة الذاتية ونقص المناعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر بينغ تشانغ على مساعدته التقنية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (MOP-86595). TAB هو محقق جديد CIHR والباحث AHFMR. ويدعم QH من قبل على منحة دراسات عليا CIHR كندا - الدكتوراه ومنحة دراسية لAIHS بدوام كامل. ويدعم SAN بواسطة منحة دراسات عليا II الملكة اليزابيث. ويدعم AYWS بواسطة منحة دراسات عليا لNSERC - الدكتوراه.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone Hank's balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss - Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences - FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar - Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI - 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
|||
References
- Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
- Liston, A. Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
- Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
- Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
- Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
- Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
- Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
- Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
- Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
- Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
- Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
- Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
- Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
- Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23 (2010).
- Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
- Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
- Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
- Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
- Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
- Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
- Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).
