Summary
We een flow cytometrie gebaseerde methode om T cel ontwikkeling onderzocht
Abstract
Een gezond immuunsysteem vereist dat T-cellen reageren op vreemde antigenen, terwijl de resterende tolerant voor zelf-antigenen. Willekeurige herschikking van de T cel receptor (TCR) α en β loci genereert een T cel repertoire met enorme diversiteit in antigeenspecificiteit, zowel zelf als buitenlandse. Selectie van het repertoire tijdens de ontwikkeling in de thymus is cruciaal voor het genereren veilige en nuttige T-cellen. Defecten in thymus selectie bijdragen tot de ontwikkeling van auto-en immunodeficiëntie aandoeningen 1-4.
T cel voorlopers voer de thymus als dubbele negatieve (DN) thymocyten die geen expressie CD4 of CD8 coreceptoren. Expressie van het αβTCR en beide co-receptoren optreedt bij de dubbele positieve (DP) podium. Interactie van de αβTCR met zelf-peptide-MHC (pMHC) door thymus cellen bepaalt het lot van de DP thymocyten. Hoge affiniteit interacties leiden tot negatieve selectie en opheffingtie van zelfontledende thymocyten. Lage affiniteit interacties resulteren in positieve selectie en ontwikkeling van CD4 of CD8 enkele positieve (SP) T-cellen herkent vreemde antigenen gepresenteerd door zelf-MHC 5.
Positieve selectie kan worden onderzocht in muizen met een polyklonaal (wildtype) TCR repertoire door het observeren van de generatie van rijpe T-cellen. Zij zijn echter niet geschikt voor de studie van negatieve selectie, die kleine deletie van antigeen-specifieke populaties omvat. Veel modelsystemen zijn gebruikt om negatieve selectie bestuderen maar in hun vermogen om vatten fysiologische gebeurtenissen 6 verschillen. Bijvoorbeeld, in vitro stimulatie van thymocyten mist de thymus omgeving die nauw betrokken is bij selectie, terwijl toediening van exogeen antigen kan leiden tot niet-specifieke deletie van thymocyten 7-9. Op dit moment, de beste tools voor het bestuderen van in vivo negatieve selectie zijn muizen die een transg drukkenENIC TCR specifiek voor endogene zelf-antigeen. Echter, veel klassieke TCR transgene modellen gekenmerkt door premature expressie van het transgene TCRα ketting aan de DN, resulterend in premature negatieve selectie. Ons laboratorium ontwikkelde de HY cd4 model, waarbij de transgene HY TCRα voorwaardelijk wordt aan het DP stadium, waardoor negatieve selectie in de DP optreden SP overgang zoals bij wildtype muizen 10.
Hier beschrijven we een flowcytometrie-based protocol thymus positieve en negatieve selectie onderzoeken de HY cd4 muismodel. Terwijl negatieve selectie in HY CD4 muizen zeer fysiologische Deze methoden kunnen ook worden toegepast op andere TCR transgene modellen. We brengen u ook algemene strategieën voor het analyseren van positieve selectie in een polyklonaal repertoire van toepassing op alle genetisch gemanipuleerde muizen.
Protocol
Zie Figuur 1 voor een algemene regeling van het experimentele protocol.
1. Ontleding
- Plaats steriele stalen gaas scherm in 60 x 15 mm petrischaal. Een eenheid nodig per weefselmonster.
- Voeg 5 ml gebalanceerde zoutoplossing Hank's (HBSS) bij elk gerecht. Houd gerechten op ijs.
- Euthanaseren muizen met CO 2.
- Secure muis om dissectie oppervlakte, ventrale zijde naar boven. Spray muis met 70% ethanol voor sterilisatie en dat de vacht is gematteerd beneden.
- Met behulp van chirurgische schaar, beginnen dissectie door het maken van een ventrale incisie in de buik huid net boven de genitaliën. Verleng de incisie omhoog naar de kin.
- Vanaf de middellijn, uitbreiding van de incisie langs alle ledematen. Trek de losse huid en speld het vast aan de dissectie oppervlak.
- Oogst de thymus:
- Til de onderste punt van het borstbeen tot een incisie te maken.
- Het vermijden van de lever, snijd het membraan aan de ribbenkast vervolgens los en snijd de ribbenkast aan elke kant. Snijd de ribbenkast naar boven aan elke kant, zorg ervoor dat de longen en het hart te voorkomen.
- Trek voorzichtig aan de ribbenkast terug met een pincet. De thymus is een witte, bilobed orgel boven het hart. Met de platte rand van de forceps naar de bodem van de lobben bevatten, trek de thymus en plaats het op het gaas.
- Oogst de milt:
- De milt is een rode, surfplank-vormige orgaan in de linkerkant van de abdominale holte muis, onder de lever.
- Maak een insnijding in de buikholte. Trek de milt met een pincet, met behulp van het tweede paar te plagen weg bindweefsel. Plaats de milt op een apart mesh zeef.
2. Celpreparaat
- Met behulp van een zuiger van een 3 ml spuit-, slijp-organen in de maas scherm totdat alleen het bindweefsel en vet resten. Spoel mesh met HBSS van de schaal driemaal. Gebruik een nieuwe zuiger voor elke weefselmonster.
- Andere opties voor homogeniseren weefsel kan worden gebruikt in plaats van deze methode.
- Tellen cellen met een hemocytometer.
- Pellet cellen door centrifugatie bij 335 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Resuspendeer splenocyten in 500 pi ACK lysis buffer (0,15 M NH4CI, 10 mM KHC0 3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2) gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Resuspendeer thymocyten op 20 x 10 6 cellen / ml in FACS buffer (PBS, 1% FCS, 0,02% natriumazide) en vernietigd op ijs.
- Terug splenocyten tot isotoniciteit door toevoeging van 5 ml HBSS. Pellet splenocyten door centrifugeren en resuspendeer in 20 x 10 6 cellen / ml in FACS buffer. Als cellen nodig hebben om te blijven steriel, kunt u gebruik maken steriele RPMI + 10% FCS.
3.Kleurende cellen voor flowcytometrie
Het doel van dit protocol is het schetsen strategieën voor de analyse van positieve en negatieve selectie met wildtype (WT) en HY CD4 muizen. Voor algemene overwegingen met betrekking tot flowcytometrie experimenteel ontwerp, de aankoop, en analyse, verwijzen we de lezers om een uitstekende beoordeling door Tung et al. 11.
- Aliquot 4 x 10 6 thymocyten per flowcytometrie monster aan elk putje van een 96-well plaat, en 1 x 10 6 WT splenocyten per compensatie. Bij gebruik van transgene muizen, moet u een WT muis op te nemen als een controle in uw experiment.
- Fc-receptoren blokkeren door incubatie cellen met anti-CD16/32 (kloon 2.4G2) gedurende 10 min op ijs.
- Spin plaat bij 335 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Verwijder het deksel en verdrijven vloeistof uit putten door de knop van de plaat een keer, gezicht naar beneden in een gootsteen. Resuspendeer elk putje in 200 ul FACS buffer. Herhaal de was.
- Bereid antilichaam cocktails zoals hieronder vermeld, met de optimale concentratie van elk antilichaam gebaseerd op verdunning in 200 ul FACS buffer per well. De optimale concentratie van elk antilichaam wordt gedefinieerd als de laagste concentratie die nodig is om de grootste scheiding van positieve en negatieve populaties geven. Als er geen negatieve populatie van een bepaald antilichaam moet een isotype antilichaam worden opgenomen. Het totale volume per goed kan omlaag geschaald worden (bijv. 100 ul per putje) indien gewenst.
- WT thymus: anti-TcR, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 of anti-CD5, anti-CD24
- HY CD4 thymus: anti-TCR HY (T3.70), anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 of anti-CD5, anti-CD24
Betere scheiding van CD69 en CD69 hi lo populaties in thymocyten verkrijgen, wordt aanbevolen dat een gebiotinyleerd anti-CD69 primair antilichaam gebruikt, gevolgd door een secundaire kleuring met fluorochroom-geconjugeerde streptavidine. We Ùse dezelfde strategie voor CD5 kleuring.
- Incubeer cellen met 200 pi antilichaam cocktail in FACS buffer gedurende 30 min op ijs in het donker.
- Gelijktijdig met antilichaam cocktail vlekken, vlek elk compensatieregeling, met een enkele fluorochroom-geconjugeerd antilichaam. Idealiter compensatie kleuring omvat dezelfde antilichamen in de antilichaam cocktail. Echter kan kleuring voor elk antigen niet haalbaar voor grotere experimenten bij vele antigenen worden getest. Daarom wordt kleuring voor zowel anti-CD4 of anti-CD8 vanwege de hoge expressie van deze antigenen, of het gebruik van compensatie kralen aanbevolen. Vlek in FACS buffer gedurende 30 min op ijs in het donker. Laat een compensatieregeling, ongekleurd.
- Was tweemaal cellen met FACS buffer.
- Resuspendeer cellen in FACS buffer en transfer naar FACS buizen.
- Acquire monsters op flowcytometer. Inclusief aankoop van FSC-A en FSC-W om eenlg voor doublet discriminatie.
4. Analyse van Flowcytometrie gegevens - Niet-TCR transgene muizen
We gebruiken FlowJo voor flowcytometrie analyse. Zie Figuur 2A de gating strategie voor niet-TCR transgene muizen.
- Met behulp van FSC-A door het SSC, elektronisch hek aan de "lymfocyt 'bevolking.
- Binnen de "lymfocyt" bevolking, gebruik FSC-A door FSC-W om elektronisch hek van de FSC-W lo bevolking naar cel wambuizen en aggregaten van het uit te sluiten. Dit is de "singlet" gate.
- Met behulp van de gebeurtenissen in de "singlet" gate, plot CD8 door CD4. Teken poorten voor DN, DP saai, DP heldere, CD4 + CD8 lo, CD4SP en CD8SP populaties zoals weergegeven in figuur 2B.
- Onder de CD4SP en CD8SP poorten, maakt u TcR door CD24 percelen. Gebruik het kwadrant gating tool om poorten te trekken zoals afgebeeld in figuur 2C.
- Maak een new plot van de "singlet" gate: TcR door CD69. Tekenen poorten A, B, C, D zoals in figuur 2D.
- Maak nog een plot van de "singlet" gate: TcR door CD5. Tekenen poorten i, ii, iii, iv zoals in figuur 2E. Dit is een andere strategie voor de behandeling van positieve selectie.
- Breng DN, DP saai, DP heldere, CD4 int, CD4SP en CD8SP poorten onder "singlet" om poorten i, ii, iii, iv, A, B, C, D (figuur 2D, E).
- Bereken het aantal cellen in een bepaalde subset door vermenigvuldiging orgel cellulariteit door de frequentie van elke volgende poort totdat u uw doelgroep. Bijvoorbeeld het aantal TcR hi-CD69 CD8SP thymocyten wordt bepaald door thymus cellulariteit x% TCR BHI-CD69 (fractie D) x% CD8SP.
- Tellen wordt reeds rekening gehouden met de levende en dode cellen dus niet de "lymphocyte "poort in uw berekeningen.
5. Analyse van Flowcytometrie gegevens - TCR transgene muizen
Zie figuur 3A de gating strategie voor TCR transgene muizen.
- Volg de stappen 4.1 en 4.2 zoals in de vorige paragraaf.
- Onder de "singlet" poort, maakt u een T3.70 door SSC plot en hek aan de T3.70 + celpopulatie om antigeen-specifieke T-cellen (Figuur 3B) te analyseren. In sommige gevallen kan het van belang zijn deze populatie vergelijken met de non-specifieke antigen (T3.70-) T celpopulatie.
- Binnen de T3.70 + bevolking, tekenen DN, DP, CD4SP en CD8SP poorten (Figuur 3C).
- Voor WT controlemonsters, trekken deze poorten onder de "singlet" gate of maak een T3.70-poort omdat er maar weinig T3.70 + cellen.
- Onder de CD8SP poort, maakt u eenT3.70 door CD24 plot. Gebruik het kwadrant gating tool om cellen te verdelen in vier populaties (Figuur 3F).
- Een overlay histogram dat CD69 expressie in de DP compartiment van WT muizen en T3.70 + DP compartiment van HY cd4 muizen (Figuur 4A). Herhaal dit om CD5-expressie (Figuur 4B) te onderzoeken.
- Bereken het absolute aantal cellen in elke subset plaats als in 4.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In fysiologische TCR transgene modellen en WT muizen, positieve selectie begint bij de DP heldere stadium vóór het verplaatsen in de DP saaie fase na antigen tegenkomen. DP dof thymocyten voer vervolgens een overgangsperiode CD4 + CD8 lo fase voordat hij CD4SP of CD8SP thymocyten (Figuur 2B). Rijpe thymocyten SP worden gekenmerkt door hoge TCR expressie en verlies van CD24 (Figuur 2C). Terwijl de CD8 door CD4 profiel kan defecten openbaren in positieve selectie, het onderzoeken TcR door CD69 of CD5 kan verder inzicht in waar het defect zit. Zowel CD69 en CD5 zijn opgereguleerd na TCR stimulatie, met sterkere interacties tot een betere expressie van deze markers.
Op de TcR door CD69 perceel, poort A (TcR lo CD69-) een populatie van voorselectie DP thymocyten vertegenwoordigt, poort B (TcR int CD69 +) staat voor een transitional populatie direct na TCR betrokkenheid gate C (TcR hi CD69 +) geeft de populatie van cellen direct na positieve selectie en gate D (TcR hi CD69 -) staat voor een volwassen populatie cellen (Figuur 2D). In een WT muis, poort A bestaat uit DP heldere cellen, terwijl poort B in de eerste plaats bestaat uit DP helder met een aantal DP saai en CD4 + CD8 lo cellen. Gate C bestaat voornamelijk uit DP saai, CD4 + CD8 lo en CD4SP cellen, terwijl gate D voornamelijk bestaat uit CD4SP en CD8SP. Aangezien populaties B en C kunnen wijzen verminderde positieve selectie. Veranderingen in de verhouding van CD4SP om CD8SP binnen populatie D kan wijzen op veranderingen in de lijn inzet. Het verlies van populaties C en D kunnen weerspiegelen overleving vragen na positieve selectie.
Behandeling TcR door CD5 is een andere strategie to identificeren pre-en post-positieve selectie populaties. Bevolking i (TcR lo CD5 lo) vertegenwoordigt voorselectie DP thymocyten en bevolking ii (TcR lo CD5 int) zijn cellen initiëren van positieve selectie (figuur 2E). Deze populaties bestaan voornamelijk uit DPbright thymocyten. Iii populatie (TcR int CD5 hi) is thymocyten in het proces ondergaan positieve selectie en bestaan voornamelijk uit DP dof en CD4 + CD8 lo thymocyten. Bevolking iv (TcR hi hi CD5) bestaat voornamelijk uit post-positieve selectie SP thymocyten. Verminderde generatie van de bevolking ii en iii suggereert defecte positieve selectie. Veranderingen in de verhouding van CD4SP om CD8SP binnen de bevolking iv ondanks normale voorgaande populaties kan wijzen op veranderingen in de lijn inzet. Een afwezigheid van de bevolking iv kan duiden op verminderde overleving na positieve selectietie. Bijvoorbeeld, in TOX - / - muizen, defecte CD4SP differentiatie leidt tot een drastische vermindering van populaties iv, C en D en positieve selectie blijft intact 12. Waar defecten in positieve selectie kan worden gezien met Bcl11b inactivatie tijdens de DP fase, die leidt tot verlies van populaties B, C en D 13,14. RasGRP1-deficiënte muizen een eerdere defect in positieve selectie, waardoor de aanwezigheid van enige populatie A (ongepubliceerde gegevens).
Als negatieve selectie gaat verwijdering van kleine antigeen-specifieke populaties, zijn defecten in dit proces het best waargenomen met behulp van TCR transgene muizen. In HY CD4 muizen thymocyten kan de transgene expressie HY TCR worden gedetecteerd met het monoklonale antilichaam T3.70 (Figuur 3B). De HY TCR herkent de man-specifieke HY antigen gepresenteerd in MHC klasse-id b. Zo HY cd4 man (M) muizen ondergaan negatieve selectie van HY TCR
Een waarschuwing van TCR transgene modellen is dat de transgene TCR sterk in de hele tekst thymocyt ontwikkeling. Daardoor is het moeilijk om positieve selectie verder te karakteriseren door het identificeren populaties gebaseerd op TCR en CD69/CD5 expressie. Echter, CD69 en CD5 expressie correleert met de kracht van TCR signalering. In WT muizen, de meeste DP thymocyten ondergaan positieve of negatieve selectie, die TCR engagement van pMHC vereist, en dus niet upregulate CD69 of CD5. HY CD4 F muizen een grote populatie van T3.70 + DP thymocyten dat positieve selectie, zoals aangegeven door een toename van de CD69 + populatie in vergelijking met WT (Figuur 4A) ondergaan. Negatieve selectie gekenmerkt door een hogere affiniteit dan TCR stimulus positieve selectie, wordt dit door hogere expressie van CD69 op T3.70 + DP thymocyten in HY CD4 M muizen, resulterend in een verschuiving of de histogram piek naar rechts. Vergelijkbare trends zijn gezien met CD5 expressie (Figuur 4B). Bij het analyseren van de thymus selectie in genetisch gemanipuleerde muizen, onderzoeken CD69 of CD5 expressie kan bepalen of het defect ligt bij TCR signalering of een stroomafwaarts uitkomst van TCR stimulatie.
Figuur 1. Algemeen schema van de experimentele protocol.
Figuur 2. Analyseren thymus selectie in non-TCR transgene muizen. (A) Gating strategie voor de analyse thymus selectie in non-TCR transgene muizen. (B) CD8 door CD4 profiel van een WT thymus. (C) Het onderzoeken van de looptijd van SP thymocyten door TcR en CD24 expressie. (D) Stages van positieve selectie kan worden onderscheiden doorCD69 door TcR expressie, samen met CD8 en CD4 profilering in elke subset. (E) TcR door CD5 is een andere strategie die kan worden gebruikt om ontwikkelingsstadia te scheiden. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Analyseren thymus selectie in HY cd4 muizen. (A) Gating strategie voor de analyse thymus selectie in TCR transgene muizen. (B) De frequentie van de thymocyten expressie HY TCR (T3.70 +) in WT, HY en HY F CD4 CD4 M muizen. (C) CD8 door CD4 profielen van de T3.70 + populatie in muizen aangegeven. In aanvulling op de frequenties, het absolute aantal T3.70 + DP (D) en in het bijzonder T3.70 + CD8SP (E) thymocyten zijn belangrijke indicatoren van negatieve selectie. (F) Het onderzoeken van delooptijd van CD8SP thymocyten in de aangegeven muizen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Expressie van activatie merkers CD69 (A) en CD5 (B) de totale DP thymocyten van WT en T3.70 + DP thymocyten uit CD4 HY en HY CD4 F M muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde protocol kan worden gebruikt om positieve en negatieve selectie in niet-transgene en TCR TCR transgene muizen onderzocht. Dit protocol beschrijft de kleuring van oppervlakte-antigenen. Voor verdere analyse van moleculaire mechanismen, is het vaak noodzakelijk om intracellulaire kleuring uitgevoerd. We maken gebruik van de BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit voor de meeste intracellulaire eiwitten en de BD Biosciences Foxp3 Staining Kit voor transcriptiefactoren. We meestal verkrijgen onze monsters direct na kleuring. Echter, monsters een nacht opgeslagen in FACS buffer met 1% formaldehyde bij 4 ° C in het donker. Wees ervan bewust dat sommige fluorochromen en antistoffen mogelijk niet compatibel met de fixatie.
Voor analyse van positieve selectie, raden wij gebiotinyleerd anti-CD69 of anti-CD5 betere scheiding van negatieve, intermediaire en hoge expressie populaties (figuur 2) te verschaffen. Zoals beschreven in de Representatieve resultaten,deze gating strategie zal helpen onderscheiden gebreken in positieve selectie uit stam inzet, als de twee kunnen zij verschillende follow-up. In aanvulling op generatie volwassen SP thymocyten, kan positieve selectie worden bevestigd door opregulatie van IL-7Rα en CCR7. Echter, deze markers tot expressie op laag niveau na selectie DP thymocyten vergelijking met SP thymocyten 15,16. Voor een gedetailleerde analyse van rijping fasen binnen het OP compartiment, kunnen intracellulaire Zap70 uitdrukking worden gemeten 17. Dit kan bijzonder nuttig zijn aangetoond dat populaties met gelijke expressie van rijping markers, zoals i en ii op TcR x CD5 plot (fig. 2E), vertegenwoordigen verschillende stadia van ontwikkeling.
De HY CD4 model heeft de voordelen van die zowel positieve en negatieve selectie, evenals fysiologische expressie van de transgene TCR. Echter, deze methoden kunnen worden toegepastandere TCR transgene modellen met bepaalde overwegingen. Bevatten altijd een antilichaam tegen TCR transgene keuze voor studie van antigeen-specifieke T-cellen mogelijk. Voor bepaalde analyses kan het van belang zijn voor de antigeenspecifieke populatie vergeleken met de niet-specifieke populatie als een interne controle. Studeren negatieve selectie in andere TCR transgene modellen moet verder overwegingen. Het stadium van thymocyt ontwikkeling waarin negatieve selectie plaatsvindt verschilt per TCR transgene modellen. HY CD4 thymocyten grijpen pMHC de DP stadium, waardoor de analyse van HY-specifieke CD8SP nakomelingen bevolking de juiste uitlezing voor negatieve selectie 10,18 (figuur 3). Als negatieve selectie optreedt tijdens de DN DP overgang als in klassieke HY muizen 19, zou de analyse van belang zijn de aanwezigheid of afwezigheid van antigen-specifieke DP thymocyten. Selectie tegen de alomtegenwoordige HY antigeen plaatsvindt in de thymuscortex 20. Daarentegen negatieve selectie tegen weefsel-beperkte antigenen treedt in de thymus medulla 21,22. OT-I RIP-mova muizen recapituleren dergelijke selectie als de Ova antigen tot expressie wordt gebracht onder controle van de rat insuline promoter die alleen actief is in de thymus medulla en pancreas 23. Sinds positieve selectie van DP thymocyten in de thymus cortex wordt eerst vereist voor migratie in de medulla, de afwezigheid van mature (CD24 lo) OT-I TCR + CD8SP thymocyten geeft een succesvolle negatieve selectie in OT-I Rip-mova muizen 24.
Bij gebruik TCR transgene muizen heeft het voordeel dat een grote populatie van antigeen-specifieke cellen te bestuderen, wordt een mogelijk nadeel gewijzigde T-celontwikkeling door beperkte liganden die positieve en negatieve selectie van de transgene TCR kunnen bemiddelen. In RAG-voldoende HY CD4 muizen, een ander nadeel is dat co-expressie van endogenous TCRα ketens heeft de potentie om moduleren positieve en negatieve selectie een minderheid van HY + TCR thymocyten. Dit nadeel is niet uniek voor de HY cd4 model, maar TCR transgene modellen in het algemeen. De vertegenwoordiger gepresenteerde HY cd4 zijn afgeleid van HY cd4 muizen op een Rag-voldoende achtergrond. Hoewel enigszins complex, zijn er vele manieren om thymocyt selectieonderzoek in een fysiologische omgeving beperkt precursorfrequentie. Zo kan TCR transgene en WT gemengde beenmerg chimeren worden gegenereerd om de antigeenspecifieke thymocyt precursorfrequentie verminderen. Daarnaast kan gebruik muizen die slechts een transgene expressie TcR keten, zoals Vb8 keten van de TCR HY 25 of de VB5 keten van de OT-I TCR 26 tot precursorfrequentie beperken. Omdat de transgene TcR keten gekoppeld diverse endogene TCRα ketens volgen van antigeen-specifieke re thymocytenkaternen het gebruik van pMHC tetrameren. Een beperking van deze methode is dat TCR expressie te laag DP thymocyten om detectie mogelijk te maken met tetrameren. Dit beperkt verdere bestudering van de moleculaire mechanismen in DP thymocyten die leiden tot positieve en negatieve selectie. Meer recent is een combinatie van pMHC tetrameren en magnetische bead verrijking gebruikt om kleine antigen-specifieke populaties van CD4 + T-cellen sommen in ongemanipuleerde muizen 27.
Negatieve selectie wordt voornamelijk gemedieerd door klonale deletie van zelf-reactieve thymocyten via de intrinsieke apoptose route. Apoptotische thymocyten kan worden gedetecteerd door flowcytometrie met intracellulaire kleuring voor gekliefde caspase-3. De BH3-only Bcl-2 familielid Bim is essentieel voor caspase-3 activatie in reactie op thymocyten TCR stimulatie 18,28. Door het kruisen van Bim-deficiënte muizen aan verschillende TCR transgene modellen, heeft ons lab ontdekt dat Bim nodig is voor negatieve selectieming tegen alomtegenwoordige zelf-antigenen, maar niet weefsel-beperkte antigenen, met vermelding van het bestaan van meerdere negatieve selectiemechanismen 18,29. Vergelijkbare benaderingen zijn betrokken de wees steroïdereceptor Nur77 als een belangrijke mediator van thymus negatieve selectie 30,31. Transcriptionele analyse van DP thymocyten uit HY CD4 muizen gegenereerd een lijst van genen die specifiek geïnduceerd in positieve en negatieve selectie 32. Toepassing van de methoden hier gepresenteerd muizen gemanipuleerd in deze genen kan inzicht in de moleculaire mechanismen van thymus selectie.
Het is ideaal te volgen onderzoek thymus selectie met een analyse van de perifere immuuncompartiment. Het is echter vaak moeilijk te scheiden centrale en perifere deletie. Negatieve selectie uiteindelijk gereflecteerd door de afwezigheid van auto-immuniteit. Hoewel ze hebben beperkingen, TCR transgene muizen zijn een krachtige en praktische manier omstuderen fysiologische negatieve selectie. Crossing TCR transgene muizen muizen die bepaalde genen is een effectieve manier om de moleculaire mechanismen van negatieve selectie onderzoeken. Het is belangrijk om bewust, echter dat perifere ontsteking door een gendefect veroorzaakt aspecifieke thymocyt deletie gemedieerd door cytokines corticosteroïden en 7-9. In dergelijke gevallen kan de hier gepresenteerde strategie worden toegepast voor de analyse van thymi van neonatale muizen voor het begin van ontsteking. Positieve selectie, anderzijds, kunnen worden onderzocht in ofwel TCR-of niet-TCR transgene modellen opslaan onderzoekers de problemen van kruisingen. Een beter begrip van de moleculen betrokken bij positieve en negatieve selectie zal leiden tot nieuwe strategieën voor de diagnose en behandeling van autoimmune en immunodeficiëntie aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Bing Zhang bedanken voor zijn technische bijstand. Dit werk werd gefinancierd door de Canadese Institutes for Health Research (MOP-86595). TAB is een CIHR New Investigator en AHFMR Scholar. QH wordt ondersteund door een CIHR Canada Graduate Scholarship - Doctoral en een AIHS Voltijds studententijd. SAN wordt ondersteund door een Koningin Elizabeth II Graduate Scholarship. AYWS wordt ondersteund door een NSERC Postgraduate Scholarship - Doctoral.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone Hank's balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss - Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences - FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar - Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI - 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
|||
References
- Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
- Liston, A. Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
- Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
- Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
- Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
- Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
- Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
- Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
- Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
- Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
- Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
- Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
- Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
- Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23 (2010).
- Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
- Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
- Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
- Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
- Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
- Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
- Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).
