Summary
Wir präsentieren eine Durchflusszytometrie-basierte Methode zur T-Zell-Entwicklung zu untersuchen
Abstract
Ein gesundes Immunsystem verlangt, dass T-Zellen fremde Antigene reagieren, während verbleibenden tolerant gegenüber Selbst-Antigenen. Random Umlagerung der T-Zell-Rezeptor (TCR) α und β loci erzeugt eine T-Zell-Repertoire mit riesigen Vielfalt in Antigenspezifität, sowohl sich selbst als auch ausländische. Auswahl des Repertoires während der Entwicklung im Thymus ist kritisch für die Erzeugung und sichere nützlich T-Zellen. Defekte im Thymus Auswahl zur Entwicklung von Autoimmun-und Immunschwäche-Erkrankungen 1-4.
T-Zell-Vorläufer geben den Thymus als doppelt negative (DN) Thymozyten, die nicht exprimieren CD4 oder CD8 Co-Rezeptoren. Expression des αβTCR und beide Co-Rezeptoren tritt bei der doppelt positiven (DP) Bühne. Interaktion des αβTCR mit Selbst-Peptid-MHC (pMHC) durch Thymus-Zellen präsentiert bestimmt das Schicksal der DP Thymozyten. Hochaffine Wechselwirkungen zu negativen Selektion und Eliminierung führention von selbst-reaktiven Thymozyten. Low Affinitätswechselwirkungen Ergebnis in positiver Selektion und Entwicklung von CD4 oder CD8 einzigen positiven (SP) T-Zellen in der Lage zu erkennen fremde Antigene durch Selbst-MHC 5 dargestellt.
Positive Selektion kann in Mäusen mit einem polyklonalen (Wildtyp) TCR Repertoires werden durch Beobachten der Erzeugung von reifen T-Zellen untersucht. Sie sind jedoch nicht ideal für das Studium der negativen Selektion, die Deletion von antigenspezifischen kleinen Populationen umfasst. Viele Modellsysteme verwendet worden, um negative Selektion zu studieren, aber variieren in ihrer Fähigkeit zu rekapitulieren physiologische Ereignisse 6. Zum Beispiel in-vitro-Stimulation von Thymozyten fehlt die Thymus-Umgebung, die innig in Auswahl beteiligt ist, während Verabreichung von exogenen Antigens an nicht-spezifische Deletion von Thymozyten 7-9 führen kann. Derzeit sind die besten Werkzeuge für die Untersuchung in vivo negative Selektion Mäuse, die eine transg ausdrückenenic TCR spezifisch für endogene Selbst-Antigen. Allerdings sind viele klassischen TCR-transgene Modelle von vorzeitigem Expression des transgenen TCRα Kette am DN Stufe dadurch, was zu einem vorzeitigen negative Selektion. Unser Labor hat den HY cd4 Modell, bei dem der transgene HY TCRα bedingt am DP Stufe exprimiert wird entwickelt, wodurch negative Selektion während der DP bis SP Übergang auftreten wie dies bei Wildtyp-Mäusen 10.
Hier beschreiben wir eine Durchflusszytometrie-basiertes Protokoll zum Thymus positive und negative Selektion in der HY cd4 Mausmodell zu untersuchen. Während negative Auswahl HY cd4 Mäusen ist höchst physiologischen können diese Verfahren auch auf andere TCR-transgene Modelle angewendet werden. Wir werden außerdem allgemeine Strategien zur Analyse positive Selektion in einem polyklonalen Repertoire für alle genetisch manipulierten Mäusen.
Protocol
Siehe Abbildung 1 für eine allgemeine Regelung des experimentellen Protokolls Abbildung.
Ein. Präparation
- Ort sterile Stahlgitter Bildschirm in 60 x 15 mm Petrischale. Eine Einheit wird pro Gewebeprobe nötig.
- 5 ml balanced salt Hank-Lösung (HBSS) zu jedem Gericht. Halten Sie Speisen auf dem Eis.
- Einschläfern Mäuse mit CO 2.
- Sichere Maus Dissektion Oberfläche Bauchseite nach oben. Spray-Maus mit 70% Ethanol für die Sterilisation und sicherzustellen, dass das Fell verfilzt wird unten.
- Verwendung von chirurgischen Schere, beginnen Dissektion indem ein Einschnitt in der ventralen Bauchhaut knapp oberhalb der Genitalien. Verlängern Sie die Inzision nach oben bis zum Kinn.
- Von der Mittellinie, verlängern die Inzision entlang aller Glieder. Ziehen Sie die lose Haut und stecken Sie es bis zur Dissektion Oberfläche.
- Ernten Sie die Thymus:
- Heben Sie die untere Spitze des Brustbeins, um einen Schnitt zu machen.
- Die Vermeidung der Leber, senken die Membran an den Brustkorb zu lösen und dann geschnitten den Brustkorb zu jeder Seite. Schneiden Sie die Brustkorb nach oben auf jeder Seite, kümmert sich um die Lunge und des Herzens zu vermeiden.
- Ziehen der Brustkorb wieder mit einer Pinzette. Der Thymus ist ein weißes, bilobed Organ oberhalb des Herzens. Mit dem flachen Rand der Zange, um die Unterseite der Flügel zu erfassen, ziehen Sie den Thymus und legen Sie es auf dem Sieb.
- Ernten die Milz:
- Die Milz ist ein roter, Surfboard-förmige Organ auf der linken Seite der Maus der Bauchhöhle, unterhalb der Leber entfernt.
- Einen Einschnitt in die Bauchhöhle. Ziehen Sie vorsichtig die Milz mit einer Pinzette, mit dem zweiten Paar zu necken sich Bindegewebe. Legen Sie die Milz auf einem separaten Sieb.
2. Cell Preparation
- Verwendung eines Kolbens aus einer 3-ml-Spritze, schleifenOrgane in den Sieb, bis nur Bindegewebe und Fett bleibt. Spülen Mesh mit HBSS aus der Schale dreimal. Verwenden Sie einen neuen Kolben für jede Gewebeprobe.
- Andere Möglichkeiten zur Homogenisierung Gewebe kann anstelle dieses Verfahren verwendet werden.
- Zählen von Zellen mit einer Zählkammer.
- Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 335 xg für 5 Minuten bei 4 ° C.
- Splenozyten resuspendieren in 500 ul ACK-Lysepuffer (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHC0 3, 0,1 mM Na 2 EDTA, pH 7,2) für 10 min bei Raumtemperatur. Resuspendieren Thymozyten bei 20 x 10 6 Zellen / ml in FACS-Puffer (PBS, 1% FCS, 0,02% Natriumazid) und beiseite stellen auf Eis.
- Splenozyten zurückzukehren, um Isotonie durch Zugabe von 5 ml HBSS. Pellet Splenozyten durch Zentrifugieren und Resuspendieren bei 20 x 10 6 Zellen / ml in FACS-Puffer. Wenn Zellen steril bleiben müssen, können Sie sterilem RPMI + 10% FCS.
3.Färbung Cells für die Durchflusszytometrie
Der Zweck dieses Protokolls ist es, Strategien für die Analyse der positiven und negativen Selektion mit Wildtyp (WT) und HY cd4 Mäusen zu skizzieren. Für allgemeine Überlegungen zur Durchflusszytometrie experimentelles Design, Beschaffung und Analyse verweisen wir die Leserschaft auf eine ausgezeichnete Bewertung von Tung et al. 11
- Aliquot 4 x 10 6 pro Thymozyten Durchflußcytometrieprobe zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte, sowie 1 x 10 6 Splenozyten WT pro Kompensationssteuerung. Bei der Verwendung von transgenen Mäusen, sollten Sie einen WT-Maus als Kontrolle in den Test einbezogen werden.
- Fc-Rezeptoren blockieren, durch Inkubieren von Zellen mit anti-CD16/32 (Klon 2.4G2) für 10 min auf Eis.
- Drallplatte bei 335 × g bei 4 ° C für 5 min. Deckel entfernen und zu zerstreuen Flüssigkeit sorgfältig durch Ausklopfen der Platte einmal nach unten in einer Senke. Resuspendieren jedes Well in 200 ul FACS Puffer. Wiederholen Sie die Wäsche.
- Bereiten Antikörper Cocktails wie unten aufgeführt, über die optimale Konzentration jedes Antikörpers zur Verdünnung in 200 ul FACS-Puffer pro well basiert. Die optimale Konzentration der einzelnen Antikörper wird als die niedrigste Konzentration benötigt wird, um die größte Trennung von positiven und negativen Populationen geben definiert. Wenn es keinen negativen Population für einen gegebenen Antikörper, sollte ein Isotyp-Antikörper enthalten sein. Das Gesamtvolumen pro Vertiefung können verkleinert werden (zB zu 100 ul pro Well), falls gewünscht.
- WT Thymus: anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8-, Anti-CD69 oder anti-CD5-, Anti-CD24
- HY cd4 Thymus: anti-TCR HY (T3.70), anti-CD4, anti-CD8-, Anti-CD69 oder anti-CD5-, Anti-CD24
Um eine bessere Trennung von CD69 und CD69 lo hallo Populationen in Thymocyten zu erhalten, wird empfohlen, dass ein biotinylierter anti-CD69 primärer Antikörper verwendet werden, gefolgt von einem sekundären Fleck enthält Fluorochrom-konjugiertem Streptavidin. Wir use die gleiche Strategie für CD5 Färbung.
- Inkubieren von Zellen mit 200 ul Antikörper-Cocktail in FACS-Puffer für 30 min auf Eis im Dunkeln.
- Zeitgleich mit Antikörper-Cocktail Färbung, färben jede Entschädigung Steuerung mit einer einzigen Fluorochrom konjugierte Antikörper. Im Idealfall beinhaltet Entschädigung Färbung die gleichen Antikörper wie in der Antikörper-Cocktail verwendet. Allerdings kann Färbung für jedes einzelne Antigen nicht machbar sein für größere Experimente, wenn viele Antigene untersucht wird. Daher wird Anfärben für entweder Anti-CD4-oder Anti-CD8 empfohlen aufgrund hoher Expression dieser Antigene, oder die Verwendung von Kompensation Kügelchen. Färben in FACS-Puffer für 30 min auf Eis im Dunkeln. Lassen Sie eine Ausgleichsregelung ungefärbt.
- Waschen der Zellen zweimal mit FACS-Puffer.
- Die Zellen in FACS-Puffer und Transfer zum FACS-Röhrchen.
- Erwerben Proben auf Durchflusszytometer. Beinhalten den Erwerb von FSC-A-und FSC-W einllow für Dublett Diskriminierung.
4. Analyse der Durchflusszytometrie Data - Non-TCR transgenen Mäusen
Wir verwenden FlowJo für die Durchflusszytometrie Datenanalyse. Siehe 2A für die Gating-Strategie für nicht-TCR transgenen Mäusen Abbildung.
- Mit FSC-A von SSC, elektronisch Tor auf der "Lymphozyten" Bevölkerung.
- Im Rahmen der "Lymphozyten" Bevölkerung, verwenden FSC-A von FSC-W elektronisch Tor des FSC-W lo Bevölkerung zu Zelle Dubletten und aggregrates auszuschließen. Dies ist die "Singulett" Tor.
- Mit den Veranstaltungen in der "Singulett" Tor, Grundstück CD8 von CD4. Zeichnen Tore für DN, DP langweilig, DP hell, CD4 + CD8 lo, CD4SP und CD8SP Populationen wie in 2B dargestellt.
- Unter dem CD4SP und CD8SP Tore, erstellen TCRβ von CD24 Plots. Verwenden Sie den Quadranten Gating-Tool zu Toren zu ziehen wie in 2C dargestellt.
- Erstellen Sie eine new Plot aus der "Singulett" Tor: TCRβ von CD69. Zeichnen Gatter A, B, C, D wie in 2D dargestellt.
- Erstellen Sie ein weiteres Grundstück von der "Singulett" Tor: TCRβ von CD5. Zeichnen Gatter i, ii, iii, iv, wie in 2E dargestellt ist. Dies ist eine weitere Strategie zur Untersuchung positive Selektion.
- Bewerben DN, DP langweilig, DP hell, CD4 int, CD4SP und CD8SP Toren unter "Singulett" zu Toren i, ii, iii, iv, A, B, C, D (2D, E).
- Berechnen Sie die Anzahl der Zellen in einer bestimmten Untergruppe durch Multiplikation Orgel Zellularität durch die Häufigkeit der einzelnen nachfolgenden Tor, bis Sie Ihre Zielgruppe erreichen. Zum Beispiel kann die Anzahl der TCRβ hallo CD69-CD8SP Thymozyten würde durch Thymus Zellularität x% TCR bhi bestimmt werden CD69-(Fraktion D) x% CD8SP.
- Zählen berücksichtigt bereits die lebenden und toten Zellen also nicht auch die "lymphocYTE "Tor in Ihren Berechnungen.
5. Analyse der Durchflusszytometrie Data - TCR transgenen Mäusen
Siehe 3A für die Gating-Strategie für TCR transgenen Mäusen Abbildung.
- Folgen Sie den Schritten 4,1 und 4,2, wie im vorherigen Abschnitt.
- Unter dem "Singulett" Tor, eine T3.70 von SSC Plot und Tor auf der T3.70 + Zellpopulation Antigen-spezifischen T-Zellen (3B) zu analysieren. In manchen Fällen kann es von Interesse sein, diese Bevölkerung zu dem nicht antigenspezifischen (T3.70-) T-Zell-Population zu vergleichen.
- Innerhalb der T3.70 + Bevölkerung, draw DN, DP, CD4SP und CD8SP Tore (3C).
- Für WT Kontrollproben, zeichnen diese Tore unter dem "Singulett" Tor oder eine T3.70-Gate, da nur sehr wenige T3.70 +-Zellen sein wird.
- Unter dem CD8SP Tor, erstellen Sie eineT3.70 von CD24 Grundstück. Verwenden des Quadranten Gating Werkzeug, um Zellen in vier Populationen (3F) zu unterteilen.
- Neu überlagerte Histogramm, welches die CD69-Expression in den DP-Kompartiment von WT-Mäusen und T3.70 + DP Abteil HY cd4 Mäusen (4A). Wiederholen Sie den Vorgang CD5 Expression (4B) zu untersuchen.
- Berechnen der absoluten Anzahl von Zellen in jeder Untergruppe von Interesse, wie in 4.8.
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Representative Results
In physiologischen TCR transgene Modelle und WT Mäusen, beginnt positive Selektion an der DP hellen Bühne, bevor er in den DP langweilig Stufe nach Antigen Begegnung. DP langweilig Thymozyten und geben Sie dann eine Übergangsregelung CD4 + CD8 lo Bühne, bevor er CD4SP oder CD8SP Thymozyten (Abbildung 2B). Mature SP Thymozyten zeichnen sich durch hohe TCR-Expression und den Verlust von CD24 (2C) gekennzeichnet. Während die CD8 durch CD4 Profil Mängel positive Selektion zu offenbaren, kann die Prüfung TCRβ von CD69 oder CD5 können weitere Einblicke in denen der Mangel liegt bieten. Sowohl CD69 und CD5 werden nach TCR-Stimulation hochreguliert, mit stärkeren Wechselwirkungen Antreiben höhere Expression dieser Marker.
Auf der TCRβ von CD69 Grundstück, Gate A (TCRβ lo CD69-) repräsentiert eine Bevölkerung von pre-selection DP Thymozyten, Gate B (TCRβ int CD69 +) für ein transitional Bevölkerung direkt nach der TCR Eingriff, Gate C (TCRβ hallo CD69 +) entspricht der Population von Zellen unmittelbar nach der positiven Selektion und Gate D (TCRβ hallo CD69 -) repräsentiert einen reiferen Zellpopulation (2D). In einer WT-Maus, Gate A besteht aus DP hellen Zellen, während Gate B besteht im Wesentlichen aus DP hell mit einigen DP stumpf und CD4 + CD8 lo Zellen. Gate C besteht im Wesentlichen aus DP langweilig, CD4 + CD8 lo und CD4SP Zellen, während Gate D besteht im Wesentlichen aus CD4SP und CD8SP. Abwesenheit von Populationen B und C kann ein Hinweis auf eine Beeinträchtigung der positiven Selektion. Änderungen in dem Verhältnis, um CD4SP CD8SP innerhalb Population D könnte darauf hindeuten Veränderungen Abstammungslinie Verpflichtung. Der Verlust von Populationen C und D können reflektieren Überlebensfragen nach positiven Selektion.
Untersuchen TCRβ von CD5 ist eine weitere Strategie to Identifizierung Pre-und Post-positive Selektion Populationen. Population i (lo TCRβ CD5 lo) darstellt Vorauswahl DP Thymozyten und ii Population (TCRβ lo CD5 int) sind Zellen initiieren positiven Selektion (2E). Diese Populationen bestehen hauptsächlich aus DPbright Thymozyten. Iii Population (TCRβ int CD5 hallo) repräsentiert Thymozyten im Prozess der positiven Selektion unterzogen und bestehen hauptsächlich aus DP stumpf und CD4 + CD8 lo Thymozyten. Bevölkerung iv (TCRβ hallo CD5 hallo) besteht hauptsächlich aus post-positive Selektion SP Thymozyten. Impaired Generation von Populationen II und III schlägt defekt positive Selektion. Änderungen in dem Verhältnis, um CD4SP CD8SP innerhalb Population iv trotz normaler vorhergehenden Populationen könnte darauf hindeuten Veränderungen Abstammungslinie Verpflichtung. Ein Fehlen der Bevölkerung iv kann darauf hindeuten, verminderter Überlebensdauer nach einer positiven Selektiontion. Zum Beispiel, in TOX - / - Mäusen führt defekten CD4SP Differenzierung zu einer drastischen Reduzierung der Populationen iv, C und D, während positive Selektion bleibt intakt 12. Echten Fehler in positiver Selektion kann mit BCL11B Inaktivierung während des DP-Stufe, die zum Verlust der Populationen B, C und D 13,14 führt zu sehen. RasGRP1-defizienten Mäusen eine frühere Defekt in positiver Selektion, was in Gegenwart von nur Population A (unveröffentlichte Daten).
Als negative Selektion beinhaltet Löschen von kleinen Antigen-spezifische Bevölkerungsgruppen werden Fehler in diesem Prozess am besten beobachtet mit TCR transgenen Mäusen. In HY cd4 Mäusen kann Thymozyten Exprimieren des transgenen HY TCR mit dem monoklonalen Antikörper T3.70 (3B) detektiert werden. Die HY TCR erkennt das männliche spezifischen HY Antigen innerhalb der MHC-Klasse ID b vorgestellt. So unterziehen HY cd4 männlich (M) Mäusen negativen Selektion von HY TCR
Eine Einschränkung des TCR transgenen Modellen ist, dass die transgene TCR stark wird während Thymozyten Entwicklung exprimiert. Als Ergebnis ist es schwierig, weiter zu charakterisieren positive Selektion durch Identifizieren Populationen TCR und CD69/CD5 Expression basiert. Allerdings müssen CD69 und CD5 Expression mit der Stärke des TCR-Signal zu korrelieren. In WT-Mäusen haben die meisten DP Thymozyten nicht unterziehen positive oder negative Selektion, die TCR Eingriff pMHC erfordert, und somit nicht hochregulieren CD69 oder CD5. HY cd4 F Mäuse haben eine große Population von T3.70 + DP Thymozyten, die positive Selektion, wie durch einen Anstieg in der CD69 +-Population im Vergleich zu WT (4A) angegeben unterziehen. Negative Selektion mit einem höheren Affinität TCR Stimulus als positive Selektion, was durch eine höhere Expression von CD69 auf T3.70 + DP Thymozyten in HY cd4 M Mäusen angegeben, was zu einer Verschiebung of die Histogrammspitze nach rechts. Ähnliche Tendenzen sind mit CD5 Expression (4B) gesehen. Bei der Analyse von Thymus-Auswahl genetisch manipulierten Mäusen untersucht CD69 oder CD5 Expression kann bestimmen, ob der Defekt mit TCR Signalisierung oder einer stromabwärtigen Ausgang der TCR-Stimulation liegt.
Abbildung 1. Insgesamt Schema des experimentellen Protokolls.
Abbildung 2. Analyse Thymus Auswahl non-TCR transgenen Mäusen. (A) Gating Strategie für die Analyse Thymus-Auswahl nicht-TCR-transgenen Mäusen. (B) CD8 durch CD4 Profil eines WT Thymus. (C) Prüfung der Fälligkeit der SP Thymozyten durch TCRβ und CD24 Expression. (D) Stages der positiven Selektion kann durch unterschieden werdenCD69 durch TCRβ Ausdruck, zusammen mit CD8-und CD4-Profiling in jeder Teilmenge. (E) TCRβ von CD5 ist eine weitere Strategie, die verwendet werden, um Entwicklungsstadien trennen können. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 3. Analyse Thymus Auswahl HY cd4 Mäusen. (A) Gating Strategie für die Analyse Thymus-Auswahl TCR-transgenen Mäusen. (B) Die Häufigkeit der Thymozyten Ausdruck der HY TCR (T3.70 +) in WT, HY cd4 F und HY cd4 M Mäusen. (C) CD8 durch CD4 Profile der T3.70 + Bevölkerung angegebenen Mäusen. Neben Frequenzen sind die absolute Zahl der T3.70 + DP (D) und vor allem T3.70 + CD8SP (E) Thymozyten wichtige Indikatoren für negative Selektion. (F) die Prüfung desLaufzeit von CD8SP Thymozyten in angegebenen Mäusen. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 4. Expression der Aktivierungsmarker CD69 (A) und CD5 (B) auf das Gesamtgewicht der DP Thymozyten aus WT und T3.70 + DP Thymozyten von HY cd4 F und HY cd4 M Mäusen.
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Discussion
Die hier vorgestellten Protokoll kann verwendet werden, um positive und negative Selektion in nicht-transgenen und TCR TCR-transgenen Mäusen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt die Färbung von Oberflächen-Antigenen. Für die weitere Analyse der molekularen Mechanismen, ist es oft notwendig, intrazelluläre Färbung führen. Wir verwenden die BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit für die meisten intrazellulären Proteinen und der BD Biosciences Foxp3 Staining Kit für Transkriptionsfaktoren. Wir in der Regel erwerben unsere Proben unmittelbar nach dem Färben. Allerdings können Proben über Nacht in FACS-Puffer gespeichert werden mit 1% Formaldehyd bei 4 ° C im Dunkeln. Seien Sie sich bewusst, dass einige Fluorochrome und Antikörper möglicherweise nicht kompatibel mit Fixierung.
Für die Analyse der positiven Selektion, empfehlen wir die Verwendung von biotinylierten anti-CD69 oder anti-CD5 eine bessere Trennung von negativen, Zwischen-und hochexprimierenden Populationen (Abbildung 2) liefern. Wie in den Repräsentative Ergebnisse beschrieben,Diese Gating Strategie hilft zu unterscheiden Mängel positive Auswahl von Linie Engagement, wie die beiden können unterschiedliche Follow-up. Neben der Erzeugung von reifen SP Thymozyten, können positive Selektion durch Hochregulation von IL-7Rα und CCR7 bestätigt werden. Jedoch werden diese Marker in niedriger Höhe über den Post-Auswahl DP Thymozyten gegenüber SP Thymozyten 15,16 ausgedrückt. Für eine detaillierte Analyse der Reifung Stufen innerhalb des DP-Fach, kann die intrazelluläre ZAP70 Ausdruck 17 gemessen werden. Dies kann besonders nützlich sein, zu demonstrieren, dass Populationen mit ähnlichen Ausdruck Reifungsmarker, wie i und ii auf der TCRβ x CD5 Grundstück (2E), repräsentieren verschiedene Stadien der Entwicklung.
Die HY cd4 Modell hat die Vorteile der repräsentieren sowohl positive als auch negative Selektion sowie physiologische Expression des transgenen TCR. Jedoch können diese Verfahren anzuwendenanderen TCR transgenen Modellen mit bestimmten Überlegungen. Enthalten immer einen Antikörper gegen das transgene TCR der Wahl zur Untersuchung von Antigen-spezifischen T-Zellen aktivieren. Für manche Analysen kann es von Interesse sein, die Antigen-spezifische Population der nicht-spezifische Population als interne Kontrolle zu vergleichen. Studieren negative Selektion in anderen TCR transgenen Modellen erfordert weitere Überlegungen. Das Stadium der Thymozyten Entwicklung während der negativen Selektion erfolgt variiert zwischen den verschiedenen TCR transgenen Modellen. HY cd4 Thymozyten engagieren pMHC am DP somit, Analyse der HY-spezifische CD8SP Nachkommen Bevölkerung ist die richtige Anzeige für negative Selektion 10,18 (Abbildung 3). Wenn negative Selektion erfolgt während der DN an DP-Übergang nach klassischen HY Mäusen 19, würde die Analyse von Interesse die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antigen-spezifischen DP Thymozyten sein. Selektion gegen die allgegenwärtige HY-Antigen findet im ThymusCortex 20. Im Gegensatz dazu tritt negative Selektion gegen Gewebe-restringierten Antigene im Thymus Medulla 21,22. OT-I-RIP Mova Mäusen rekapitulieren diese Art der Selektion die Ova Antigen unter der Kontrolle der Ratten-Insulin-Promotor, der aktiv ist nur im Thymus Medulla und Bauchspeicheldrüse 23 exprimiert wird. Da positive Selektion von DP Thymozyten im Thymus Kortex wird zunächst für Migration in der Medulla, das Fehlen von reifen (CD24 lo) OT-I TCR + CD8SP Thymozyten zeigt die erfolgreiche negative Selektion in OT-I Rip-Mova Mäusen 24 erforderlich.
Bei der Verwendung von TCR-transgenen Mäusen hat den Vorteil, dass sie in der Lage, eine große Population von Antigen-spezifischen Zellen zu untersuchen, wird ein potentielles T-Zell-Entwicklung Einschränkung aufgrund begrenzter Liganden, die positive und negative Selektion der transgenen TCR vermitteln kann verändert. In RAG-reicht HY cd4 Mäuse, ist ein weiterer Vorbehalt, dass Co-Expression von endogenennous TCRα Ketten hat das Potenzial zu modulieren positiven und negativen Selektion auf eine Minderheit von HY TCR + Thymozyten. Diese Einschränkung ist nicht nur für die HY cd4 Modell, sondern TCR transgenen Modellen im Allgemeinen. Die repräsentativen HY cd4 präsentiert von HY cd4 Mäuse auf einem Rag-genügend Hintergrundwissen abgeleitet. Obwohl etwas komplexer in der Natur, gibt es viele Möglichkeiten, um Thymozyten-Auswahl einer physiologischen Einstellung begrenzter Frequenz Vorstufe studieren. Zum Beispiel können transgene TCR und WT gemischten Knochenmarkschimären erzeugt, um die Antigen-spezifischen Thymozyten Vorstufe Frequenz zu reduzieren. Außerdem kann man mit Mäusen, die nur eine transgene exprimieren TCRβ Kette, wie die VB8 Kette des TCR HY 25 oder dem VB5 Kette des OT-I TCR 26 bis Vorstufe Frequenz zu begrenzen. Da die transgene TCRβ Kette ist mit verschiedenen endogenen TCRα Ketten, Tracking von Antigen-spezifischen Thymozyten re gepaartenerfordert die Verwendung von pMHC Tetramere. Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass TCR-Expression zu niedrig DP Thymozyten zur Detektion mit Tetrameren zu ermöglichen. Dies schränkt weiteren Untersuchung der molekularen Mechanismen DP Thymozyten, die positive und negative Selektion führen. In jüngerer Zeit hat eine Kombination von pMHC Tetramere und Magnetkügelchen Anreicherung verwendet worden, um kleine, Antigen-spezifische Populationen von CD4 + T-Zellen in Mäusen unmanipulierten 27 aufzulisten.
Negative Selektion wird in erster Linie durch klonale Deletion selbstzersetzliche Thymozyten über den intrinsischen Weg vermittelt Apoptose. Apoptotischen Thymozyten durch Durchflusszytometrie unter Verwendung intrazelluläre Färbung für Caspase-3 gespalten detektiert werden. Die BH3-only Bcl-2 Familienmitglieder Bim notwendig für Caspase-3-Aktivierung in Thymocyten in Reaktion auf TCR-Stimulation 18,28. Durch die Kreuzung Bim-defizienten Mäusen zu verschiedenen TCR transgenen Modellen hat sich unser Labor festgestellt, dass Bim für negative Selektion erforderlich isttion gegen ubiquitäre Selbst-Antigene, jedoch nicht Gewebe-restringierten Antigenen, die das Vorhandensein von mehreren negativen Selektionsmechanismen 18,29. Ähnliche Ansätze haben die Waise Steroidrezeptor Nur77 als weitere zentrale Rolle von Thymus negative Selektion 30,31 verwickelt. Transkriptionelle Analyse der DP Thymozyten von HY cd4 Mäusen hat eine Liste von Genen, speziell während der positive und negative Selektion 32 induziert wird. Anwendung der Methoden hier Mäusen in diesen Genen manipuliert präsentiert werden Einblicke in die molekularen Mechanismen der Thymus Auswahl anzubieten.
Es ist ideal, um Nachuntersuchung von Thymus-Auswahl mit einer Analyse des peripheren Immunsystems Fach. Allerdings ist es oftmals schwierig, zentralen und peripheren Deletion trennen. Negative Selektion wird schließlich durch die Abwesenheit von Autoimmunität reflektiert. Obwohl sie Einschränkungen haben, sind TCR transgenen Mäusen eine leistungsstarke und praktische Möglichkeit,studieren physiologischen negative Selektion. Crossing TCR transgenen Mäusen defizienten Mäusen in bestimmten Genen ist ein effektiver Weg, um die molekularen Mechanismen der negativen Selektion zu untersuchen. Es ist wichtig, sich bewusst sein, jedoch, dass periphere Entzündung durch einen Gendefekt verursacht unspezifische Thymozyten Löschung durch Kortikosteroide und Zytokine 7-9 vermittelt. In solchen Fällen kann das hier vorgestellte Strategie zur Analyse von neugeborenen Mäusen Thymi werden vor dem Einsetzen der Entzündung aufgebracht. Positive Selektion, auf der anderen Seite, können entweder in TCR-oder nicht-TCR transgenen Modellen untersucht werden, wodurch die Ermittler die Probleme der Kreuzung. Ein besseres Verständnis der Moleküle in positive und negative Selektion beteiligt werden neue Strategien für die Diagnose und Behandlung von Autoimmun-und Immunschwäche-Erkrankungen führen.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Bing Zhang für seine technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde von der kanadischen Institute for Health Research (MOP-86595) finanziert. TAB ist eine CIHR New Investigator und AHFMR Scholar. Doctoral und einem AIHS Vollzeit Studentship - QH wird durch eine CIHR Canada Graduate Scholarship unterstützt. SAN wird von einer Königin Elizabeth II Graduate Scholarship unterstützt. Doctoral - AYWS wird durch ein NSERC Postgraduate-Stipendium unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone Hank's balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss - Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences - FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar - Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI - 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
|||
References
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