Summary
אנו מציגים שיטת זרימת cytometry מבוסס לבחון התפתחות תא T
Abstract
מערכת חיסונית בריאה דורשת שתאי T מגיבים לאנטיגנים זרים, בעוד שנשארו סובלני לאנטיגנים עצמיים. סידור אקראי של הקולטן התא T (TCR) α ולוקוסי β יוצר רפרטואר תאי T עם מגוון עצום בהספציפיות אנטיגן, הן עצמי וזרות. בחירת הרפרטואר במהלך פיתוח בבלוטת התימוס היא קריטית ליצירת תאי T בטוחים ושימושיים. פגמים בבחירה הרתי לתרום להתפתחות של הפרעות אוטואימוניות וכשל חיסוניים 1-4.
אבות תאי T מכניסים את התימוס כthymocytes (DN) השלילי כפול שלא מבטא CD4 או CD8 עמיתים לקולטנים. ביטוי של αβTCR ושני עמיתים לקולטנים מתרחש בשלב החיובי הכפול (DP). אינטראקציה של αβTCR עם (pMHC) הציג עצמי פפטיד-MHC על ידי תאים הרתי קובעת את גורלו של thymocyte DP. אינטראקציות זיקה גבוהות להוביל לבחירה וelimina שליליתtion של thymocytes העצמי תגובתי. תוצאה נמוכה זיקת גומלין בבחירה והתפתחות חיוביות של CD4 או CD8 (SP) תאי T חיוביים יחידים המסוגלים לזהות אנטיגנים זרים שהוצגו על ידי 5-MHC עצמי.
סלקציה חיובית ניתן ללמוד בעכברים עם רפרטואר polyclonal (wildtype) TCR ידי התבוננות הדור של תאי T בשלים. עם זאת, הם לא אידיאליים למחקר של סלקציה שלילית, הכולל מחיקה של אוכלוסיות קטנות אנטיגן ספציפיים. מערכות מודל רבות שמשו ללמוד סלקציה שלילית אך נבדל ביכולתם לסכם אירועים פיסיולוגיים 6. לדוגמה, בגירוי במבחנה של thymocytes חסר את הסביבה הרתי כי הוא מעורב באופן אינטימי בבחירה, ואילו ממשל של אנטיגן אקסוגני יכול להוביל למחיקה הלא ספציפית של thymocytes 7-9. נכון לעכשיו, את הכלים הטובים ביותר ללימוד בסלקציה שלילית vivo הם עכברים שמבטאים transgספציפי enic TCR לאנטיגן עצמי אנדוגני. עם זאת, רבי מודלים קלסיים TCR המהונדסים מאופיינים בביטוי המוקדם של שרשרת TCRα המהונדסת בשלב DN, וכתוצאה ממוקדמת סלקציה שלילית. המעבדה שלנו פתחה מודל CD4 ח.י., בי המהונדס ח.י. TCRα מתבטא בתנאים בשלב DP, המאפשר סלקציה שלילית להתרחש במהלך עקורים למעבר SP כפי שמתרחש בעכברי wildtype 10.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול זרימה cytometry מבוסס לבחון סלקציה חיובית ושלילית הרתי במודל עכבר CD4 ח.י.. בעוד סלקציה שלילית בעכברי ח.י. CD4 היא פיזיולוגית מאוד, שיטות אלה יכולים להיות מיושמים גם על מודלים מהונדסים TCR אחרים. אנחנו גם נציג אסטרטגיות כלליות לניתוח סלקציה חיובית ברפרטואר מתאים לכל עכברי מניפולציות גנטיות polyclonal.
Protocol
ראה איור 1 עבור מערך כולל של פרוטוקול הניסוי.
1. בתור
- מסך מקום סטרילי פלדת רשת לצלחת 60 x 15 מ"מ פטרי. יחידה אחת נדרשה לדגימת רקמה.
- הוסף 5 מ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) לכל מנה. שמור מנות על קרח.
- להרדים עכברים עם CO 2.
- עכבר מאובטח למשטח חיתוך, צד הגחוני פונה כלפי מעלה. עכבר תרסיס עם אתנול 70% לעיקור ולהבטיח שפרוותו מדובללת.
- בעזרת מספרי כירורגיות, להתחיל על ידי ביצוע נתיחת חתך גחון בעור הבטן ממש מעל איבר המין. להרחיב את החתך כלפי מעלה לסנטר.
- מקו האמצע, להרחיב את החתך לאורך כל הגפיים. למשוך חזרה את העור הרפוי ולהצמיד אותו למשטח החיתוך.
- לקצור את התימוס:
- הרם את הקצה התחתון של עצם החזה כדי לעשות חתך.
- הימנעות הכבד, לחתוך את הסרעפת כדי לנתק את כלוב צלעות ולאחר מכן לחתוך את כלוב צלעות לכל צד. חותך את הצלעות כלפי מעלה בכל צד, מקפיד להימנע מהריאות והלב.
- משוך בעדינות את בית החזה האחורי עם מלקחיים. התימוס הוא איבר לבן, bilobed ממוקם מעל הלב. אם אשתמש בשפה השטוחה של המלקחיים לתפוס את התחתית של האונות, משוך בעדינות את התימוס ולמקם אותו על מסך רשת.
- לקצור את הטחול:
- הטחול הוא איבר אדום, גלשן בצורה הממוקם בצד השמאלי של חלל הבטן של העכבר, מתחת לכבד.
- הפוך חתך לתוך חלל הבטן. משוך בעדינות את הטחול עם זוג אחד של מלקחיים, תוך שימוש בזוג השני כדי להקניט את רקמת חיבור. הנח את הטחול על מסך רשת נפרדת.
2. הכנת תא
- שימוש בבוכנה ממזרק 3 מ"ל, לטחוןאיברים לתוך מסך רשת עד רקמת חיבור ורק שרידי שומן. יש לשטוף את רשת עם HBSS מהצלחת שלוש פעמים. השתמש בוכנה חדשה לכל דגימת רקמה.
- אפשרויות אחרות למאחדים רקמה ניתן להשתמש במקומה של שיטה זו.
- ספירת תאים באמצעות hemocytometer.
- תאי גלולה ידי צנטריפוגה ב335 XG למשך 5 דקות ב 4 ° C.
- splenocytes resuspend ב 500 μl של חיץ תמוגה ACK (0.15 מ 'NH 4 Cl, 10 מ"מ KHC0 3, 0.1 המ"מ Na 2 EDTA, 7.2 pH) למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר. thymocytes resuspend ב 20 x 10 6 תאים / מ"ל בFACS חיץ (PBS, 1% FCS, 0.02% יזידו נתרן) ומניח בצד על קרח.
- חזור לsplenocytes isotonicity ידי הוספת 5 מ"ל של HBSS. splenocytes הגלולה ידי צנטריפוגה וresuspend ב 20 x 10 6 תאים / מ"ל בחיץ FACS. אם תאים צריכים להישאר סטרילי, אתה יכול להשתמש בסטרילי RPMI + 10% FCS.
3.תאים מכתימים עבור cytometry זרימה
מטרתו של פרוטוקול זה היא להתוות אסטרטגיות לניתוח של סלקציה חיובית ושלילית באמצעות wildtype (WT) ועכברי ח.י. CD4. לשיקולים כלליים בנוגע לזרימת cytometry עיצוב, רכישה, וניתוח ניסויי, אנו מתייחסים לקוראי סקירה מצוינת על ידי טונג ואח' 11.
- Aliquot 4 X 10 6 thymocytes לדגימת cytometry זרימה לכל אחד גם מצלחת 96-היטב, כמו גם 1 x 10 6 splenocytes WT לשליטת פיצוי. אם אתם משתמשים בעכברים הטרנסגניים, אתה צריך לכלול עכבר WT כבקרה בניסוי.
- חסימה קולטנית FC ידי דוגרי תאים עם anti-CD16/32 (שיבוט 2.4G2) למשך 10 דקות על קרח.
- ספין בצלחת 335 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הסר את המכסה ולפזר נוזל מבארות ידי מצליף את הצלחת פעם אחת, עם פנים כלפי מטה לתוך כיור. Resuspend כל באר בשנת 200 μl של חיץ FACS. חזור על לשטוף.
- הכן קוקטיילי נוגדנים כמפורטים להלן, באמצעות ריכוז האופטימלי של כל נוגדן המבוסס על דילול ב200 μl של חיץ FACS לטוב. הריכוז האופטימלי של כל נוגדן מוגדר כריכוז הנמוך ביותר הנדרש כדי לתת את ההפרדה הגדולה ביותר של אוכלוסיות חיוביות ושליליות. אם אין אוכלוסייה שלילית לנוגדנים נתונים, נוגדן אלוטיפ צריך להיות כלול. הנפח הכולל לכל גם ניתן scaled למטה (לדוגמה עד 100 μl לטוב) אם רוצה.
- WT התימוס: אנטי TCRβ CD4 אנטי,, אנטי CD8, אנטי CD69 או אנטי CD5, אנטי CD24
- CD4 התימוס ח.י.: אנטי ח.י. TCR (T3.70), CD4 אנטי, אנטי CD8, אנטי CD69 או אנטי CD5, אנטי CD24
כדי להשיג הפרדה טובה יותר של CD69 lo וCD69 אוכלוסיות hi בthymocytes, מומלץ שנוגדן אנטי-CD69 עיקרי biotinylated לשמש, ואחריו כתם משני המכיל streptavidin fluorochrome מצומדות. אנו use אותה האסטרטגיה לCD5 מכתים.
- דגירת תאים עם 200 μl של קוקטייל נוגדנים בחיץ FACS למשך 30 דקות על קרח בחושך.
- במקביל לצביעת קוקטייל נוגדנים, כתם כל פקד פיצוי עם נוגדן חד fluorochrome מצומדות. באופן אידיאלי, כתמי פיצוי כרוכים באותם נוגדנים אלו המשמשים בקוקטייל הנוגדנים. עם זאת, מכתים עבור כל אנטיגן מסוים אינו ריאלי עבור ניסויים גדולים יותר כאשר אנטיגנים רבים שassayed. לכן, מכתים גם עבור CD4 אנטי או נגד CD8 מומלץ בשל ביטוי גבוה של אנטיגנים אלה, או השימוש בחרוזי פיצויים. כתם בחיץ FACS למשך 30 דקות על קרח בחושך. השאר שליטת פיצוי אחד בתוליים.
- שטוף תאים פעמים עם חיץ FACS.
- תאי resuspend במאגר והעברה לצינורות FACS FACS.
- לרכוש דגימות על cytometer זרימה. כולל רכישת FSC-וFSC-W כדיllow לאפלית כפיל.
4. ניתוח של נתוני זרימת cytometry - עכברים ללא TCR המהונדסים
אנו משתמשים FlowJo לניתוח נתוני cytometry זרימה. ראה איור 2 א לאסטרטגית gating לעכברים שאינם TCR מהונדסים.
- שימוש FSC-ידי SSC, שער אלקטרוני על האוכלוסייה "לימפוציטים".
- בתוך האוכלוסייה "ימפוציטים", השתמש FSC-ידי FSC-W לשער אלקטרוני אוכלוסיית lo FSC-W שלא לכלול כפילויות סלולריות וaggregrates. זה שער "הגופייה".
- באמצעות אירועים בשער "הגופייה", שעלילת CD8 ידי CD4. צייר שערים לד.נ., DP משעמם, DP בהיר, מסוג CD4 + CD8 אוכלוסיות הנה CD4SP וCD8SP כמתואר באיור 2 ב '.
- תחת CD4SP וCD8SP השערים, ליצור TCRβ ידי CD24 חלקות. השתמש בכלי gating רבע לצייר שערים כמתואר באיור 2 ג.
- צור neעלילת w מהשער "הגופייה": TCRβ ידי CD69. צייר שערים, B, C, D כמתואר באיור 2 ד.
- צור עוד מזימה מהשער "הגופייה": TCRβ ידי CD5. צייר השערים I, II, III, IV כמתואר באיור 2E. זוהי אסטרטגיה אחרת לבחינת סלקציה חיובית.
- החל DN, DP משעמם, DP בוהק, int CD4, וCD4SP CD8SP שערים מתחת "גופייה" לשערי I, II, III, IV, A, B, C, D (איור 2 ד, ה).
- לחשב את מספר התאים בתת קבוצה מסוימת על ידי הכפלה תאית איבר בתדירות של כל שער שלאחר מכן עד שתגיע לאוכלוסיית היעד שלך. לדוגמה, מספר hi thymocytes TCRβ CD69-CD8SP היה נקבע על ידי% התאי התימוס TCR BHI x CD69-(חלק ד ') x CD8SP%.
- הספירה כבר לוקחת בחשבון את תאי חיים ומתים ולכן אינם כוללים "lymphoc"שער yte בחישובים שלך.
5. ניתוח של נתוני זרימת cytometry - TCR טרנס עכברים
ראה איור 3 א לאסטרטגית gating לעכברים הטרנסגניים TCR.
- בצע את השלבים 4.1 ו -4.2 כמו בסעיף הקודם.
- מתחת לשער "הגופייה", ליצור T3.70 ידי עלילת SSC ושער בT3.70 + אוכלוסיית תא לנתח תאי T אנטיגן ספציפיים (איור 3 ב '). בנסיבות מסוימות, זה עשוי להיות עניין להשוואה לאוכלוסייה זו (T3.70-) האוכלוסייה הלא אנטיגן ספציפית לתאי T.
- בתוך האוכלוסייה T3.70 +, התיקו DN, DP, CD4SP וCD8SP שערים (האיור 3C).
- לדגימות בקרת WT, לצייר השערים האלה מתחת לשער "הגופייה" או ליצור T3.70 שער כפי שיהיו מעט מאוד T3.70 + תאים.
- מתחת לשער CD8SP, ליצורT3.70 ידי CD24 עלילה. השתמש בכלי gating רבע לחלק תאים לארבע אוכלוסיות (איור 3F).
- יצירת היסטוגרמה מעולפת מתארת CD69 ביטוי בתא DP של עכברי WT ו+ תא T3.70 DP של עכברי ח.י. CD4 (איור 4 א). חזור על פעולה כדי לבחון CD5 ביטוי (איור 4 ב).
- לחשב את המספר המוחלט של תאים בכל קבוצת משנה של ריבית בכ4.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במודלים פיסיולוגיים TCR מהונדסים ועכברי WT, סלקציה חיובית מתחילה בשלב הבהיר DP לפני המעבר לשלב המשעמם עקורים לאחר מפגש אנטיגן. thymocytes המשעמם העקור לאחר מכן זן מסוג CD4 + שלב מעבר lo CD8 לפני שהפך thymocytes CD8SP (האיור 2B) CD4SP או. thymocytes SP הבוגר מאופיין בביטוי TCR גבוה ואובדן CD24 (האיור 2C). בעוד CD8 ידי CD4 פרופיל יכול לחשוף ליקויים בסלקציה חיובית, בחינת TCRβ ידי CD69 או CD5 יכול לספק תובנה נוספת לתוך בי פגם השקרים. שניהם CD69 וCD5 הם upregulated לאחר גירוי TCR, עם אינטראקציות חזקות נהיגת ביטוי גבוה יותר של סמנים אלה.
על ידי TCRβ CD69 עלילה, השער (TCRβ lo CD69-) מייצג אוכלוסייה של thymocytes DP-בחירה מראש, השער ב '(TCRβ int CD69 +) מייצג trאוכלוסיית ansitional ישירות לאחר TCR אירוסין, השער ג (TCRβ היי CD69 +) מייצגת את האוכלוסייה של תאי בחירה ישירות פוסט חיובית, והשער D (TCRβ היי CD69 -) מייצג אוכלוסייה בוגרת יותר של תאים (איור 2 ד). בעכבר WT, שער מורכב מתאים בהירים עקורים, ואילו שער ב 'כולל בעיקר DP בהיר עם כמה DP משעמם וסוג CD4 + תאי CD8 lo. השער C בעיקר מורכב של DP משעמם, מסוג CD4 + תאי CD4SP CD8 הפלא ו, ואילו השער D מורכב בעיקר מCD4SP וCD8SP. היעדרות של B ו-C אוכלוסיות עשויה להצביע על ליקוי בסלקציה חיובית. שינויים ביחסו של CD4SP לCD8SP בתוך האוכלוסייה D יכולים להציע שינויים בהתחייבות שושלת. הפסד של האוכלוסיות C ו-D עשוי לשקף בעיות הישרדות לאחר סלקציה חיובית.
בחינת TCRβ ידי CD5 היא עוד לא אסטרטגיהo לזהות אוכלוסיות בחירה לפני ואחרי-חיוביות. אוכלוסייה, אני (TCRβ lo lo CD5) מייצג thymocytes העקור מיון מוקדם ואוכלוסייה שנייה (TCRβ CD5 int lo) הם תאי ייזום סלקציה חיובית (2E איור). אוכלוסיות אלו כוללות בעיקר thymocytes DPbright. אוכלוסיית iii (TCRβ int CD5 היי) מייצג thymocytes בתהליך עובר סלקציה חיובית והיא כוללת בעיקר DP משעמם וסוג CD4 + CD8 thymocytes lo. אוכלוסיית iv (TCRβ היי היי CD5) מורכב בעיקר מthymocytes SP בחירת הודעה החיובית. הדור השני לקוי של אוכלוסיות וג מרמז פגומת סלקציה חיובית. שינויים ביחסו של CD4SP לCD8SP בתוך האוכלוסייה iv למרות אוכלוסיות שקדמו נורמליות יכולים להציע שינויים בהתחייבות שושלת. העדר האוכלוסייה iv עשוי להצביע על הישרדות ירד בעקבות חיובי selection. לדוגמה, במעבדה לבדיקת רעלים - / - עכברים, פגום בידול CD4SP מוביל לירידה דרסטית באוכלוסיות iv, C ו-D בזמן הסלקציה חיובית נשארה שלמה 12. ליקויים אמיתיים בסלקציה חיובית ניתן לראות באיון Bcl11b בשלב DP, שמוביל לאובדן של האוכלוסיות B, C ו-D 13,14. עכברים RasGRP1-חסרים לי פגם מוקדם יותר בסלקציה חיובית, וכתוצאה מהנוכחות של אוכלוסייה בלבד (נתונים שלא פורסמו).
כסלקציה שלילית כרוכה במחיקה של אוכלוסיות קטנות אנטיגן ספציפיים, פגמים בתהליך זה נשמרים טוב ביותר באמצעות עכברים מהונדסים TCR. בעכברי CD4 HY, thymocytes מבטא המהונדס ח.י. TCR יכול להיות מזוהה עם נוגדנים חד שבטיים T3.70 (איור 3 ב '). ח.י. TCR מזהה אנטיגן HY הגברי הספציפי שהוצג בכיתת MHC מזהה ב. לפיכך, HY CD4 זכרי עכברים (M) לעבור סלקציה שלילית של ח.י. TCR
אזהרה אחת של מודלים מהונדסים TCR היא שהמהונדס TCR מתבטא מאוד ברחבי פיתוח thymocyte. כתוצאה מכך, קשה לאפיין סלקציה חיובית יותר על ידי זיהוי אוכלוסיות המבוססות על TCR וCD69/CD5 ביטוי. עם זאת, ביטוי CD69 וCD5 אל לתאם עם הכח של TCR איתות. בעכברי WT, thymocytes העקור רוב לא עובר סלקציה חיובית או שלילית, הדורשת מעורבות של TCR pMHC, ולכן אינו upregulate CD69 או CD5. עכברי F CD4 HY יש אוכלוסייה גדולה של T3.70 + thymocytes העקור שעובר סלקציה חיובית, כפי שצוינה על ידי גידול באוכלוסיית CD69 + בהשוואה ל WT (איור 4 א). סלקציה שלילית כרוכה בגירוי גבוה יותר מאשר זיקת TCR סלקציה חיובית, זה מצוין על ידי ביטוי גבוה יותר של CD69 + בT3.70 thymocytes העקור בCD4 ח.י. M עכברים, שהובילה לשינוי of שיא ההיסטוגרמה לימין. מגמות דומות נראות עם CD5 ביטוי (איור 4 ב). כאשר מנתחים את הבחירה הרתי בעכברי מניפולציות גנטיות, בוחן CD69 או CD5 ביטוי יכול לקבוע אם הפגם טמון בTCR איתות או במורד זרם תוצאה של גירוי TCR.
איור 1. ערכה כוללת של פרוטוקול הניסוי.
איור 2. ניתוח בחירה הרתי בעכברים שאינם TCR מהונדסים. () אסטרטגית gating לניתוח בחירה הרתי בעכברים שאינם TCR מהונדסים. (ב) לפי פרופיל CD8 CD4 של WT התימוס. (ג) בחינת הבגרות של thymocytes SP ידי TCRβ וCD24 ביטוי. (ד) שלבים של סלקציה חיובית יכולים להיות מכובדים על ידיCD69 ידי ביטוי TCRβ, יחד עם CD8 וCD4 פרופילים בכל משנה. (ה) על ידי TCRβ CD5 היא אסטרטגיה אחרת שיכולים לשמש להפרדת שלבי התפתחות. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. ניתוח בחירה הרתי בעכברי ח.י. CD4. () אסטרטגית gating לניתוח בחירה הרתי בעכברים מהונדסים TCR. (ב) תדירות thymocytes מבטא ח.י. TCR (T3.70 +) בWT, ח.י. CD4 F ו CD4 M עכברי ח.י.. (ג) CD8 ידי פרופילי CD4 של אוכלוסיית T3.70 + בעכברים שצוינו. בנוסף לתדרים, המספר המוחלט של T3.70 + DP (ד ') ובייחוד T3.70 + thymocytes CD8SP (E) הם אינדיקטורים חשובים של סלקציה שלילית. (ו) בדיקהפדיון של thymocytes CD8SP בעכברים שצוינו. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 4. ביטוי של סמני ההפעלה CD69 () וCD5 (ב ') על thymocytes העקור כלל מWT וT3.70 + thymocytes העקור מCD4 M עכברי HY F ו CD4 ח.י..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המובא כאן יכול לשמש לבדיקת סלקציה חיובית ושלילית בעכברים מהונדסים TCR הלא TCR מהונדס ו. פרוטוקול זה מתאר את ההכתמה של אנטיגנים על פני שטח. לניתוח נוסף של מנגנונים מולקולריים, לעתים קרובות יש צורך לבצע צביעה תאית. אנו משתמשים BD Biosciences קיט Cytofix / Cytoperm עבור רוב החלבונים תאיים וערכת כתמי Foxp3 Biosciences BD לגורמי שעתוק. אנחנו בדרך כלל לרכוש הדגימות שלנו מייד לאחר צביעה. עם זאת, דגימות ניתן לאחסן לילה במאגר FACS עם פורמלדהיד 1% ב 4 ° C בחושך. להיות מודע לכך כמה fluorochromes ונוגדנים לא יהיו תואם עם קיבעון.
לניתוח של סלקציה חיובית, מומלץ להשתמש באנטי CD69 biotinylated או אנטי CD5 לספק הפרדה טובה יותר של אוכלוסיות שליליות, בינוניות, ומאוד להביע (איור 2). כפי שמתואר בנציג התוצאות,אסטרטגית gating זה יעזור להבחין פגמים בסלקציה חיובית ממחויבות שושלת, כמו השניים אחרים עשוי לדרוש מעקב. בנוסף לדור של thymocytes SP הבוגר, סלקציה חיובית יכולה להיות מאושרת על ידי גברת ביטוי של IL-7Rα וCCR7. עם זאת, סמנים אלה באים לידי ביטוי ברמה נמוכה בthymocytes העקור לאחר הבחירה בהשוואה לthymocytes SP 15,16. לניתוח מפורט של שלבי הבשלה בתוך תא DP, Zap70 ביטוי תאי ניתן למדוד 17. זה עשוי להיות שימושי במיוחד בהוכחה כי אוכלוסיות עם ביטוי דומה של סמני התבגרות, כגון 'וב' בTCRβ x CD5 העלילה (2E איור), מייצג שלבים שונים של פיתוח.
מודל CD4 ח.י. יש את היתרונות של ייצוג חיובי וסלקציה שלילית, כמו גם ביטוי פיסיולוגי של המהונדס TCR. עם זאת, שיטות אלה יכולים להיות מיושמים עלדגמים אחרים TCR הטרנסגניים עם שיקולים מסוימים. תמיד כולל נוגדנים נגד המהונדס TCR של בחירה כדי לאפשר מחקר של תאי T אנטיגן ספציפיים. עבור ניתוחים מסוימים, זה עשוי להיות עניין להשוות את אוכלוסיית אנטיגן הספציפי לאוכלוסייה הלא הספציפית כבקרה פנימית. לומד סלקציה שלילית במודלים מהונדסים TCR אחרים מחייב שיקולים נוספים. שלב התפתחות thymocyte במהלך הסלקציה שלילית שמתרחשת משתנה בין הדגמים השונים TCR המהונדסים. HY thymocytes CD4 לעסוק pMHC בשלב DP, ובכך ניתוח של אוכלוסיית צאצאי CD8SP ח.י. הספציפית הוא readout הנכון לסלקציה שלילית 10,18 (איור 3). אם בחירה שלילית מתרחשת במהלך ד.נ. למעבר עקורים ובעכברי ח.י. קלסית 19, הניתוח של ריבית יהיה נוכחות או עדר של thymocytes העקור אנטיגן הספציפי. בחירה כנגד אנטיגן HY הנפוץ מתרחשת בהרתי20 קליפת המוח. לעומת זאת, סלקציה שלילית נגד אנטיגנים רקמות מוגבלות מתרחשת במדולה הרתי 21,22. OT-I עכברי RIP-mOva לסכם את זה סוג של בחירה כאנטיגן ביציות מתבטא בשליטה של אמרגן אינסולין העכברוש, שהוא פעיל רק בלשד והלבלב 23 הרתי. מאז בחירה חיובית של thymocytes העקור בקליפה הרתי נדרשה ראשונה להגירה ללשד, העדר בשל (CD24 lo) OT-I TCR + thymocytes CD8SP מציין סלקציה שלילית מוצלחת בOT-אני ריפ-mOva 24 עכברים.
תוך שימוש בעכברים מהונדסים TCR יש את היתרון של להיות מסוגל ללמוד אוכלוסייה גדולה של תאי אנטיגן ספציפיים, אזהרת פוטנציאל משתנית התפתחות תא T בשל ligands המוגבל שיכול לתווך סלקציה חיובית ושלילית של המהונדס TCR. בעכברי CD4-HY מספיק סמרטוט, את אזהרה נוספת היא ששיתוף ביטוי לendogeשרשרות TCRα Nous יש פוטנציאל לווסת סלקציה חיובית ושלילית על מיעוט של HY TCR + thymocytes. אזהרה זו אינה ייחודית למודל CD4 ח.י., אלא מודלי TCR מהונדס באופן כללי. את CD4 ח.י. היציגה הוצג נגזרים מעכברי CD4 ח.י. על רקע Rag-מספיק. אם כי מעט מורכב יותר בטבע, יש דרכים רבות ללימוד בחירת thymocyte בהגדרה פיזיולוגית יותר של תדר מבשר מוגבל. לדוגמה, כימרות מח עצם מעורבת WT TCR מהונדס ויכולים להיות שנוצרו כדי להפחית את תדירות מבשר thymocyte אנטיגן הספציפית. בנוסף, ניתן להשתמש בעכברים המבטאים שרשרת TCRβ מהונדסת בלבד, כגון Vb8 שרשרת של ח.י. 25 TCR או Vb5 שרשרת של OT-אני TCR 26 להגביל תדר מבשר. בגלל שרשרת TCRβ המהונדסת היא זיווג עם רשתות שונות אנדוגניים TCRα, מעקב של מחדש thymocytes אנטיגן הספציפיquires שימוש tetramers pMHC. מגבלה של שיטה זו היא שביטוי TCR הוא נמוך מדי בthymocytes העקור כדי לאפשר זיהוי עם tetramers. זה מגביל מחקר נוסף של המנגנונים המולקולריים בthymocytes העקור שמובילים לברירה חיובית ושלילית. לאחרונה, שילוב של tetramers pMHC והעשרת חרוז מגנטית נעשה שימוש כדי למנות אוכלוסיות קטנות, אנטיגן ספציפיים של CD4 + תאי T בעכברי unmanipulated 27.
סלקציה שלילית מתווכת בעיקר על ידי מחיקה משובטת של thymocytes העצמי תגובתי באמצעות מסלול אפופטוזיס הפנימי. thymocytes אפופטוטיים יכולה להיות מזוהה על ידי cytometry זרימה באמצעות צביעה תאית לcaspase-3 בקעו. Bim BH3 בלבד Bcl-2 בן המשפחה הוא חיוני לcaspase-3 הפעלה בthymocytes בתגובה לגירוי TCR 18,28. באמצעות חציית עכברים Bim-לקויים לדגמים שונים TCR מהונדסים, המעבדה שלנו מצאה כי Bim נדרש לselec השליליtion נגד אנטיגנים עצמיים בכל מקום, אך לא אנטיגנים רקמות מוגבלים, המעידים על קיומם של מנגנוני סלקציה שליליים מרובים 18,29. גישות דומות מעורבות Nur77 הקולטן סטרואידי היתום כמתווך מפתח נוסף של סלקציה שלילית הרתי 30,31. ניתוח תעתיק של thymocytes העקור מעכברי ח.י. CD4 יצר רשימה של גנים הנגרמים במיוחד במהלך בחירה החיובית ושלילית 32. יישום השיטות שהוצגו כאן לעכברי מניפולציה בגנים אלה עשויים לספק תובנה על המנגנונים המולקולריים של בחירה הרתי.
הוא אידיאלי למעקב בדיקת הבחירה הרתי עם ניתוח של התא החיסוני ההיקפי. עם זאת, הוא לעתים קרובות קשה להפריד מחיקה מרכזית והיקפית. סלקציה שלילית משתקפת סופו של דבר על ידי היעדר אוטואימוניות. למרות שיש להם מגבלות, עכברים הטרנסגניים TCR הם דרך רבה עצמה ומעשיתללמוד סלקציה שלילית פיזיולוגית. עכברים הטרנסגניים TCR מעבר לעכברים חסרים בגנים מסוימים הם דרך יעילה כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של סלקציה שלילית. חשוב להיות מודע, עם זאת, כי דלקת היקפית עקב פגם גנטי יכולה לגרום למחיקת thymocyte אינה ספציפית מתווכת על ידי סטרואידים וציטוקינים 7-9. במקרים כאלה, את האסטרטגיה שהוצגה כאן יכולה להיות מיושמת על הניתוח של thymi מעכברים ילודים לפני תחילת הדלקת. סלקציה חיובית, לעומת זאת, ניתן ללמוד באו TCR או דגמים שאינו TCR המהונדסים, שמירת חוקרי הצרות של הכלאות. הבנה טובה יותר של המולקולות המעורבות בסלקציה חיובית ושלילית תוביל לאסטרטגיות חדשניות לאבחון והטיפול בהפרעות אוטואימוניות וכשל חיסוניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לינג ג'אנג לסיוע הטכני שלו. עבודה זו מומנה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (MOP-86595). TAB הוא ניו חוקר ומלומד CIHR AHFMR. QH נתמך על ידי מלגת CIHR קנדה למוסמכים - דוקטורנטים וStudentship AIHS במשרה מלאה. SAN נתמך על ידי מלגת מלכת אליזבת השנייה בוגר. AYWS נתמך על ידי מלגות לתארים מתקדמים NSERC - דוקטורט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone Hank's balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss - Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences - FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar - Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI - 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
|||
References
- Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
- Liston, A. Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
- Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
- Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
- Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
- Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
- Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
- Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
- Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
- Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
- Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
- Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
- Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
- Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23 (2010).
- Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
- Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
- Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
- Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
- Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
- Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
- Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).
