Summary
Vi presentiamo un metodo basato citometria di flusso per esaminare lo sviluppo delle cellule T
Abstract
Un sistema immunitario sano è necessario che le cellule T rispondono agli antigeni estranei, pur rimanendo tolleranza di auto-antigeni. Riarrangiamento casuale del recettore delle cellule T (TCR) α e β loci genera un repertorio T cella con grande diversità nella specificità antigenica, sia per sé ed esteri. Selezione del repertorio durante lo sviluppo nel timo è critica per generare le cellule T sicuro e utile. Difetti di selezione timica contribuire allo sviluppo di malattie autoimmuni e immunodeficienza 1-4.
Progenitori delle cellule T inserire il timo come doppi negativi (DN) timociti che non esprimono CD4 o CD8 co-recettori. Espressione del αβTCR ed entrambi co-recettori avviene a doppio positivo (DP) stadio. Interazione del αβTCR con auto-peptide-MHC (pMHC) presentata da parte delle cellule del timo determina il destino del timociti DP. Interazioni ad alta affinità portare alla selezione negativa e di eliminazionezione di auto-reattivi timociti. Bassa affinità risultato interazioni in selezione positiva e sviluppo di CD4 o CD8 singoli positivi (SP) cellule T capaci di riconoscere antigeni estranei presentati da auto-MHC 5.
Selezione positiva può essere studiata in topi con un anticorpo (tipo selvatico) repertorio TCR osservando la generazione di cellule T mature. Tuttavia, essi non sono ideali per lo studio di selezione negativa, che comporta l'eliminazione di piccoli antigene-specifiche popolazioni. Molti sistemi modello sono stati utilizzati per studiare selezione negativa, ma variano nella loro capacità di ricapitolare eventi fisiologici 6. Per esempio, stimolazione in vitro dei timociti manca dell'ambiente timica che è intimamente coinvolto nella selezione, mentre la somministrazione di antigene esogeno può portare a non-specifico delezione di timociti 7-9. Attualmente, i migliori strumenti per lo studio in vivo selezione negativa sono topi che esprimono una transgENIC specifico TCR per endogena auto-antigene. Tuttavia, molti classici modelli transgenici TCR sono caratterizzati dalla prematura espressione della catena transgenico TCRα nella fase DN, con conseguente prematuro selezione negativa. Il nostro laboratorio ha sviluppato il modello HY cd4, in cui il transgenico HY TCRα condizionatamente espressa nella fase DP, consentendo la selezione negativa a verificarsi durante il DP di transizione SP come avviene nei topi di tipo selvatico 10.
Qui, si descrive un protocollo basato citometria di flusso per esaminare timica selezione positiva e negativa nel topo HY modello CD4. Mentre la selezione negativa in topi CD4 HY è altamente fisiologica, questi metodi possono essere applicati anche ad altri modelli transgenici TCR. Ci sarà anche la presentazione delle strategie generali per l'analisi di selezione positiva in un repertorio policlonale applicabile a tutti i topi geneticamente manipolati.
Protocol
Fare riferimento alla Figura 1 per uno schema generale del protocollo sperimentale.
1. Dissezione
- Luogo sterile setaccio a maglia d'acciaio in 60 x 15 millimetri capsula di Petri. Una unità è necessaria per campione di tessuto.
- Aggiungere 5 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a ogni piatto. Tenere i piatti sul ghiaccio.
- Eutanasia topi con CO 2.
- Del mouse sulla superficie protetta dissezione, lato ventrale rivolto verso l'alto. Mouse spruzzo con 70% etanolo per la sterilizzazione e per assicurare che il pelo è arruffati giù.
- Usando forbici chirurgiche, cominciano dissezione facendo una incisione nella pelle ventrale addominale appena sopra i genitali. Estendere incisione verso l'alto fino al mento.
- Dalla linea mediana, estendere l'incisione giù lungo tutti gli arti. Tirare indietro la pelle flaccida e il pin verso il basso sulla superficie dissezione.
- Raccolto il timo:
- Sollevare la punta inferiore dello sterno per fare un'incisione.
- Evitare il fegato, tagliare il diaframma per staccare la gabbia toracica e poi tagliare la gabbia toracica per ogni lato. Tagliare i cassa toracica verso l'alto su entrambi i lati, avendo cura di evitare i polmoni e il cuore.
- Estrarre delicatamente il retro cassa toracica con una pinza. Il timo è un bianco, organo bilobato situato sopra il cuore. Utilizzando il bordo piatto della pinza per afferrare la parte inferiore dei lobi, tirare delicatamente il timo e posizionarlo sullo schermo maglia.
- Raccogliere la milza:
- La milza è un rosso, a forma di tavola da surf organo situato sul lato sinistro della cavità addominale del mouse, sotto il fegato.
- Effettuare un'incisione nella cavità addominale. Estrarre delicatamente la milza con un paio di pinze, con la seconda coppia per prendere in giro via del tessuto connettivo. Posizionare la milza su uno schermo a rete separata.
2. Preparazione cellulare
- Utilizzando uno stantuffo di una siringa da 3 ml, macinareorgani nello schermo maglia fino tessuto connettivo e solo resti di grasso. Sciacquare maglia con HBSS dal piatto tre volte. Utilizzare un pistone nuovo per ogni campione di tessuto.
- Altre opzioni per omogeneizzare tessuto può essere utilizzato al posto di questo metodo.
- Contare le cellule con un emocitometro.
- Pellet di cellule per centrifugazione a 335 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Splenociti Risospendere in 500 pl di tampone di lisi ACK (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHC0 3, 0,1 mM Na 2 EDTA, pH 7,2) per 10 min a temperatura ambiente. Timociti Risospendere a 20 x 10 6 cellule / ml in FACS tampone (PBS, 1% FCS, sodio azide 0,02%) e mettere da parte su ghiaccio.
- Ritorno splenociti di isotonicità aggiungendo 5 ml di HBSS. Splenociti pellet per centrifugazione e risospendere a 20 x 10 6 cellule / ml in tampone FACS. Se le cellule hanno bisogno di rimanere sterile, è possibile utilizzare sterile RPMI + 10% FCS.
3.Le cellule colorazione per Citometria a Flusso
Lo scopo di questo protocollo è quello di delineare strategie per l'analisi di selezione positiva e negativa utilizzando tipo selvatico (WT) e topi CD4 HY. Per considerazioni di carattere generale in materia di citometria a flusso di progettazione sperimentale, l'acquisizione e l'analisi, si rimanda ad un eccellente recensione di Tung et al 11.
- Aliquotare 4 x 10 6 timociti per campione di citometria a flusso per ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, così come 1 x 10 6 splenociti WT per il controllo di compensazione. Se si utilizza topi transgenici, è necessario includere un topo WT come un controllo in un esperimento.
- Bloccare i recettori Fc incubando le cellule con anti-CD16/32 (clone 2.4G2) per 10 min in ghiaccio.
- Spin piastra a 335 xg a 4 ° C per 5 min. Togliere il coperchio e dissipare liquido dai pozzetti muovendo la piastra una volta, a faccia in giù in un lavandino. Risospendere ogni pozzetto in 200 pl di tampone FACS. Ripetere il lavaggio.
- Preparare cocktail di anticorpi come di seguito elencati, usando la concentrazione ottimale di ciascun anticorpo base diluizione in 200 pl di tampone FACS per pozzetto. La concentrazione ottimale di ciascun anticorpo è definita come la concentrazione minima necessaria per fornire il più grande separazione di popolazioni positive e negative. Se non c'è popolazione negativa per un determinato anticorpo, un anticorpo isotipo dovrebbero essere inclusi. Il volume totale per pozzetto può essere ridotta (ad esempio a 100 pl per pozzetto), se desiderato.
- WT timo: anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 o anti-CD5, anti-CD24
- CD4 HY timo: anti-HY TCR (T3.70), anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 o anti-CD5, anti-CD24
Per ottenere una migliore separazione di CD69 e CD69 lo popolazioni hi in timociti, si raccomanda che un anticorpo biotinilato anti-CD69 primaria essere utilizzato, seguito da una macchia secondaria contenente fluorocromo coniugato streptavidina. Abbiamo use la stessa strategia per CD5 colorazione.
- Incubare le cellule con 200 ml di cocktail di anticorpi in tampone FACS per 30 min in ghiaccio, al buio.
- In concomitanza con colorazione anticorpo cocktail, macchia ogni controllo di compensazione con un solo fluorocromo coniugato anticorpo. Idealmente, colorazione compensazione comporta gli stessi anticorpi utilizzati nel cocktail di anticorpi. Tuttavia, colorazione per ciascun antigene specifico non può essere fattibile per grandi esperimenti quando molti antigeni sono stati dosati. Pertanto, sia per colorazione anti-CD4 e anti-CD8 è raccomandato per l'alta espressione di questi antigeni, o l'uso di perline di compensazione. Macchia in tampone FACS per 30 min in ghiaccio, al buio. Lascia un controllo di compensazione senza macchia.
- Lavare le cellule due volte con tampone FACS.
- Risospendere le cellule in tampone FACS e trasferimento tubi FACS.
- Acquisire campioni su citofluorimetro. Include l'acquisizione di FSC-A e FSC-W a unallow di discriminazione doppietto.
4. Analisi dei dati Citometria a flusso - non TCR topi transgenici
Usiamo FlowJo per citometria a flusso l'analisi dei dati. Fare riferimento alla Figura 2A per la strategia di gating per i non-TCR topi transgenici.
- Utilizzo di FSC-A da SSC, cancello elettronico sulla popolazione "linfociti".
- All'interno della popolazione "linfociti", utilizzare FSC-A da FSC-W per via elettronica porta del FSC-W popolazione lo escludere doppietti cellulari e aggregrates. Questa è la porta "singoletto".
- Con gli eventi del cancello "singoletto", la trama da CD4 CD8. Disegna cancelli per DN, DP sordo, DP luminoso, CD4 + CD8 popolazioni ecco, CD4SP e CD8SP come illustrato nella figura 2B.
- Sotto le porte CD4SP e CD8SP, creare TCRβ da CD24 trame. Utilizzare lo strumento gating quadrante per disegnare cancelli come illustrato in Figura 2C.
- Creare una new trama dal cancello "singoletto": TCRβ da CD69. Disegnare porte A, B, C, D, come illustrato nella Figura 2D.
- Creare un altro grafico dal cancello "singoletto": TCRβ da CD5. Disegnare porte I, II, III, IV come illustrato nella Figura 2E. Questa è un'altra strategia per l'esame di selezione positiva.
- Applicare DN, DP sordo, DP luminoso, int CD4, CD4SP e CD8SP porte da sotto "singoletto" ai cancelli i, ii, iii, iv, A, B, C, D (Figura 2D, E).
- Calcolare il numero di cellule in un particolare sottoinsieme moltiplicando cellularità organo per la frequenza di ogni porta successiva fino a raggiungere la popolazione target. Per esempio, il numero di TCRβ hi-CD69 CD8SP timociti sarebbe determinata dal timo cellularità x% TCR BHI-CD69 (frazione D) x CD8SP%.
- Conteggio tiene già conto delle cellule vive e morte in modo da non includere il "lymphocYTE "porta nei calcoli.
5. Analisi dei dati Citometria a flusso - TCR topi transgenici
Fare riferimento alla Figura 3A per la strategia di gating per TCR topi transgenici.
- Seguire i punti 4.1 e 4.2, come nella sezione precedente.
- Sotto il cancello "singoletto", creare un T3.70 dalla trama SSC e cancello sul T3.70 + popolazione cellulare per analizzare antigene-specifiche cellule T (Figura 3B). In alcune circostanze, può essere interessante confrontare questa popolazione alla non-antigene specifico (T3.70) popolazione delle cellule T.
- All'interno della popolazione T3.70 +, disegnare DN, DP, CD4SP e CD8SP porte (Figura 3C).
- Per i campioni di controllo WT, disegnare questi cancelli sotto la porta "singoletto" o creare un T3.70-gate come ci saranno pochissimi T3.70 + cellule.
- Sotto il cancello CD8SP, creare unT3.70 da CD24 trama. Utilizzare lo strumento di gating quadrante per dividere le celle in quattro popolazioni (Figura 3F).
- Creare un istogramma sovrapposto raffigurante CD69 espressione nel vano DP di topi WT e T3.70 + vano DP di CD4 HY topi (Figura 4A). Ripetere esaminare CD5 espressione (Figura 4B).
- Calcolare il numero assoluto di cellule in ciascun sottoinsieme di interesse come in 4,8.
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Representative Results
In fisiologiche TCR modelli transgenici e topi WT, selezione positiva inizia nella fase DP luminoso prima di passare alla fase di DP opaca dopo l'incontro di antigene. Timociti DP opaco quindi inserire una transizione CD4 + CD8 lo stadio prima di diventare CD4SP o timociti CD8SP (Figura 2B). Timociti maturi SP sono caratterizzati da elevata espressione TCR e perdita di CD24 (Figura 2C). Mentre il CD8 da CD4 profilo può rivelare difetti di selezione positiva, esaminando TCRβ da CD69 e CD5 in grado di fornire una visione più completa in cui il difetto si trova. Sia CD69 e CD5 sono sovraregolati dopo stimolazione TCR, con forti interazioni di guida più alta espressione di questi marcatori.
Sulla TCRβ da CD69 trama, porta A (TCRβ lo CD69-) rappresenta una popolazione di pre-selezione timociti DP, porta B (TCRβ int CD69 +) rappresenta una trpopolazione ansitional direttamente dopo TCR impegno, cancello C (TCRβ hi CD69 +) rappresenta la popolazione di cellule direttamente post-selezione positiva, e porta D (TCRβ hi CD69 -) rappresenta una popolazione di cellule più mature (Figura 2D). In un mouse WT, porta A è costituito da cellule DP brillanti, mentre cancello B è costituito principalmente da DP luminoso con un po 'opaco DP e CD4 + CD8 Lo. Gate C costituita principalmente da DP sordo, CD4 + e le cellule CD8 lo CD4SP, mentre porta D è costituito principalmente da CD4SP e CD8SP. Assenza di popolazioni B e C possono essere indicativi di compromissione selezione positiva. Le variazioni del rapporto tra CD4SP a CD8SP all'interno popolazione D può suggerire alterazioni impegno lignaggio. La perdita delle popolazioni C e D possono riflettere problemi di sopravvivenza a seguito selezione positiva.
Esaminando TCRβ da CD5 è un altro t strategiao individuare le popolazioni di selezione pre-e post-positivo. Popolazione i (TCRβ lo CD5 lo) rappresenta la preselezione timociti DP e la popolazione ii (TCRβ lo CD5 int) sono cellule che iniziano selezione positiva (Figura 2E). Queste popolazioni sono costituite principalmente da timociti DPbright. Popolazione iii (TCRβ int CD5 hi) rappresenta timociti nel processo di subire selezione positiva e sono costituiti principalmente da DP noiosa e CD4 + CD8 Lo timociti. Popolazione iv (TCRβ hi hi CD5) è costituito principalmente da timociti di selezione post-positivi SP. Ridotta generazione di popolazioni ii e iii suggerisce difettoso selezione positiva. Le variazioni del rapporto tra CD4SP a CD8SP all'interno popolazione iv nonostante normali popolazioni precedenti possono suggerire alterazioni impegno lignaggio. L'assenza di popolazione iv può indicare una ridotta sopravvivenza dopo selezione positivazione. Per esempio, in TOX - / - mice, difettoso differenziazione CD4SP porta ad una drastica riduzione popolazioni iv, C e D, mentre la selezione positiva rimane intatto 12. Difetti reali a selezione positiva può essere visto con inattivazione Bcl11b durante la fase DP, che porta alla perdita di popolazioni B, C e D 13,14. RasGRP1-topi hanno un difetto in precedenza selezione positiva, conseguente alla presenza della popolazione solo A (dati non pubblicati).
Come selezione negativa comporta l'eliminazione di piccoli antigene-specifiche popolazioni, difetti di questo processo sono i più osservati con TCR topi transgenici. In topi HY CD4, timociti che esprimono il TCR transgenico HY può essere rilevato con l'anticorpo monoclonale T3.70 (Figura 3B). Il TCR HY riconosce il maschio-specifico antigene HY presentata entro MHC di classe ID b. Così, CD4 HY maschi (M) topi sottoposti a selezione negativa di HY TCR
Un avvertimento di TCR modelli transgenici è che il TCR transgenico è espresso molto durante lo sviluppo dei timociti. Come risultato, è difficile caratterizzare ulteriormente la selezione positiva identificando popolazioni basato su TCR e CD69/CD5 espressione. Tuttavia, CD69 e CD5 espressione si correlano con la forza di TCR segnalazione. In topi WT, la maggior parte dei timociti DP non subiscono selezione positiva o negativa, che richiede l'impegno di TCR pMHC, e quindi non upregulate CD69 o CD5. CD4 HY F topi hanno una grande popolazione di T3.70 + timociti DP sottoposti a selezione positiva, come indicato da un aumento della popolazione CD69 + rispetto al WT (Figura 4A). Selezione negativa comporta uno stimolo maggiore affinità TCR di selezione positiva, questo è indicato con maggiore espressione di CD69 sulla T3.70 + DP timociti CD4 HY M topi, determinando uno spostamento of il picco istogramma verso destra. Tendenze simili sono visti con CD5 espressione (Figura 4B). Nell'analizzare selezione timica in topi geneticamente manipolati, esaminando CD69 o CD5 espressione può determinare se il difetto si trova con TCR segnalazione o un esito valle di stimolazione TCR.
Figura 1. Schema generale del protocollo sperimentale.
Figura 2. Analizzando selezione timica in non-topi transgenici TCR. (A) strategia di gating per l'analisi di selezione timica in non-TCR topi transgenici. (B) CD8 CD4 dal profilo di un timo WT. (C) Esaminare la maturità dei timociti SP da TCRβ e CD24 espressione. (D) Le fasi di selezione positiva si distingue perCD69 dall'espressione TCRβ, insieme a CD8 e CD4 profiling per ogni fascicolo. (E) TCRβ da CD5 è un'altra strategia che può essere utilizzato per separare le fasi di sviluppo. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Analisi selezione timica CD4 HY topi. (A) strategia di gating per l'analisi di selezione timica TCR in topi transgenici. (B) La frequenza dei timociti che esprimono il TCR HY (T3.70 +) in WT, HY e HY cd4 F cd4 M topi. (C) CD8 dai profili della popolazione CD4 + in topi T3.70 indicati. Oltre alle frequenze, il numero assoluto di T3.70 + DP (D) e in particolare T3.70 CD8SP + (E) timociti sono importanti indicatori di selezione negativa. (F) L'esame dellamaturazione dei timociti CD8SP nei topi indicati. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. L'espressione di marcatori di attivazione CD69 (A) e CD5 (B) sul totale dei timociti DP dal WT e T3.70 + timociti DP dal F cd4 HY e HY cd4 M topi.
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Discussion
Il protocollo qui presentato può essere utilizzato per esaminare selezione positiva e negativa in non-transgenici TCR e TCR topi transgenici. Questo protocollo descrive la colorazione degli antigeni di superficie. Per un'ulteriore analisi dei meccanismi molecolari, è spesso necessario eseguire la colorazione intracellulare. Usiamo il BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit per la maggior parte delle proteine intracellulari e la Foxp3 BD Biosciences Kit di colorazione per fattori di trascrizione. Noi di solito acquistare i nostri campioni immediatamente dopo la colorazione. Tuttavia, i campioni possono essere conservati notte in tampone FACS con 1% di formaldeide a 4 ° C al buio. Essere consapevoli del fatto che alcuni fluorocromi e gli anticorpi potrebbero non essere compatibili con fissaggio.
Per l'analisi di selezione positiva, si consiglia di utilizzare biotinilato anti-CD69 o anti-CD5 per fornire una migliore separazione delle popolazioni negativo, intermedio, e altamente esprimere (Figura 2). Come descritto nei risultati rappresentativi,questa strategia di gating che aiutano a distinguere i difetti di selezione positiva dall'impegno lignaggio, come i due può richiedere diversi follow-up. Oltre alla generazione di SP timociti maturi, selezione positiva può essere confermata dalla sovraregolazione di IL-7Rα e CCR7. Tuttavia, questi marcatori sono espressi a livello basso post-selezione timociti DP rispetto ai timociti SP 15,16. Per un'analisi dettagliata di stadi maturativi nel vano DP, intracellulare ZAP70 espressione può essere misurata 17. Questo può essere particolarmente utile a dimostrare che le popolazioni con l'espressione di marcatori di maturazione simile, come ad esempio I e II del CD5 TCRβ x plot (Figura 2E), rappresentano diverse fasi di sviluppo.
Il modello HY CD4 ha i vantaggi di rappresentare sia positivo e selezione negativa, nonché espressione fisiologica del TCR transgenico. Tuttavia, questi metodi possono essere applicati aaltri modelli TCR transgenici con alcune considerazioni. Comprendono sempre un anticorpo contro il TCR transgenico di scelta per consentire uno studio di antigene-specifiche cellule T. Per alcune analisi, può essere interessante confrontare l'antigene-specifica popolazione alla popolazione non specifico come controllo interno. Studiando selezione negativa in altri modelli transgenici TCR richiede ulteriori considerazioni. La fase di sviluppo dei timociti, durante il quale si svolge la selezione negativa varia tra i diversi TCR modelli transgenici. HY timociti CD4 pMHC impegnarsi nella fase DP, quindi l'analisi del HY-specifica popolazione CD8SP progenie è la lettura corretta per selezione negativa 10,18 (Figura 3). Se la selezione negativa si verifica durante il DN di transizione DP come nei topi HY classici 19, l'analisi di interesse sarebbe la presenza o assenza di antigene-specifici timociti DP. Selezione contro l'antigene HY onnipresente avviene nel timocorteccia 20. In contrasto, la selezione negativa contro il tessuto-ristrette antigeni avviene nel midollo timico 21,22. OT-I topi RIP-Mova ricapitolare questo tipo di selezione come antigene Ova è espresso sotto il controllo del promotore dell'insulina di ratto, che è attivo solo nella midollare del timo e pancreas 23. Dal momento che la selezione positiva dei timociti DP nella corteccia timica è prima necessaria per la migrazione nel midollo, l'assenza di una matura (CD24 lo) OT-I TCR + timociti CD8SP indica successo selezione negativa in OT-I Rip-Mova topi 24.
Mentre utilizzando topi transgenici TCR ha il vantaggio di essere in grado di studiare una vasta popolazione di cellule antigene-specifici, un avvertimento potenziale viene alterato lo sviluppo delle cellule T per ligandi limitate che possono mediare selezione positiva e negativa del TCR transgenico. In RAG-sufficienti topi HY CD4, un altro avvertimento è che la co-espressione di endogenenous catene TCRα ha il potenziale per modulare selezione positiva e negativa in una minoranza di HY + TCR timociti. Questo avvertimento non è univoco per il modello HY cd4, ma piuttosto modelli transgenici TCR in generale. I cd4 HY rappresentativi presentati sono derivati da CD4 HY topi su un Rag-sufficiente sfondo. Anche se un po 'più complessa in natura, ci sono molti modi per studiare la selezione dei timociti in un contesto più fisiologico della frequenza precursore limitata. Per esempio, TCR transgenico e WT misti chimere midollo osseo può essere generato per ridurre l'antigene-specifica frequenza timociti precursore. Inoltre, si possono usare i topi che esprimono solo una catena TCRβ transgenica, come la catena VB8 del TCR HY 25 o il VB5 catena del OT-I TCR 26 per limitare la frequenza precursore. Poiché la catena TCRβ transgenico è accoppiato con varie catene endogeni TCRα, il monitoraggio di antigene-specifica re timocitiquaderni l'utilizzo di tetrameri pMHC. Un limite di questo metodo è che l'espressione di TCR è troppo bassa sui timociti DP per consentire il rilevamento con tetrameri. Questo limita ulteriore studio dei meccanismi molecolari in timociti DP che portano a selezione positiva e negativa. Più recentemente, una combinazione di tetrameri e pMHC magnetica arricchimento tallone è stato utilizzato per enumerare piccole, antigene-specifiche popolazioni di cellule T CD4 + in topi non manipolata 27.
Selezione negativa è principalmente mediata da delezione clonale di auto-reattivi timociti attraverso la via intrinseca dell'apoptosi. Timociti apoptotici può essere rilevata mediante citometria a flusso utilizzando la colorazione intracellulare per spaccati caspasi-3. Il BH3-only Bcl-2 Bim familiare è essenziale per l'attivazione della caspasi-3 in timociti in risposta alla stimolazione TCR 18,28. Attraversando Bim-carente topo a diversi TCR modelli transgenici, il nostro laboratorio ha scoperto che è necessario per Bim negativo selezionezione contro i più diffusi auto-antigeni, ma non tessuto-ristrette antigeni, che indicano l'esistenza di molteplici meccanismi di selezione negativi 18,29. Approcci simili sono implicati il Nur77 orfano recettori steroidei come un altro mediatore chiave di timo selezione negativa 30,31. Analisi trascrizionale dei timociti DP dal CD4 HY topi ha generato una lista di geni specificamente indotti durante la selezione positiva e negativa 32. Applicando i metodi presentati qui per topi manipolati in questi geni possono fornire informazioni sui meccanismi molecolari di selezione timica.
E 'ideale per seguire esame della selezione timica con un'analisi del compartimento periferico immunitario. Tuttavia, è spesso difficile separare soppressione centrale e periferico. Selezione negativa ultima analisi, è l'assenza di autoimmunità. Anche se hanno dei limiti, TCR topi transgenici sono un modo potente e pratico perstudio fisiologico selezione negativa. Crossing TCR topi transgenici per topi deficienti di particolari geni è un modo efficace per studiare i meccanismi molecolari di selezione negativa. È importante tenere presente, tuttavia, che l'infiammazione periferica dovuta a un difetto genetico può causare non-specifico delezione timociti mediata da corticosteroidi e citochine 7-9. In tali casi, la strategia qui presentata può essere applicato all'analisi di thymi da topi neonati prima della comparsa di infiammazione. Selezione positiva, invece, possono essere studiate sia in TCR-o non-TCR modelli transgenici, risparmiando investigatori i problemi di ibridazione. Una migliore comprensione delle molecole coinvolte nella selezione positiva e negativa porterà a nuove strategie per la diagnosi e il trattamento di disordini autoimmuni e immunodeficienza.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Bing Zhang per la sua assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dal Canadian Institutes for Health Research (MOP-86595). TAB è un investigatore CIHR Nuovo e Scholar AHFMR. QH è sostenuto da una borsa di studio CIHR Canada Graduate - Dottorato e un AIHS tempo pieno Studentship. SAN è sostenuto da una borsa di studio Queen Elizabeth II Graduate. AYWS è sostenuto da una borsa di studio post-laurea NSERC - Dottorato.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone Hank's balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss - Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences - FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar - Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI - 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
|||
References
- Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
- Liston, A. Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
- Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
- Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
- Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
- Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
- Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
- Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
- Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
- Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
- Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
- Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
- Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
- Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23 (2010).
- Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
- Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
- Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
- Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
- Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
- Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
- Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).
