Summary
Vi presenterar ett flödescytometri-baserad metod för att undersöka T-cell-utveckling
Abstract
Ett friskt immunsystem kräver att T-celler svarar på främmande antigener samtidigt som den är tolerant mot själv-antigener. Slumpvis omlagring av T-cell receptorn (TCR) α och β loci genererar en T-cell repertoar med stor mångfald i antigenspecificitet, både för sig själv och utländska. Val av repertoaren under utveckling i tymus är kritisk för att generera säkra och användbara T-celler. Defekter i tymus val bidra till utvecklingen av autoimmuna och immunbristsjukdomar 1-4.
T-cell stamfäder in tymus som dubbla negativa (DN) tymocyter som inte uttrycker CD4 eller CD8 co-receptorer. Redovisning av αβTCR och båda co-receptorer sker vid dubbla positiva (DP) steg. Interaktion av αβTCR med själv-peptid-MHC (pMHC) presenteras av tymusceller bestämmer ödet för DP tymocyt. Hög affinitet interaktioner leder till negativ selektion och elimineringning av självreaktiva tymocyter. Låg affinitet interaktioner resulterar i positiv selektion och utveckling av CD4 eller CD8 enda positiv (SP) T-celler kan känna igen främmande antigener presenteras av själv-MHC 5.
Positiv selektion kan studeras i möss med en polyklonal (vildtyp) TCR repertoar genom att observera alstring av mogna T-celler. Emellertid, är de inte ideala för studier av negativ selektion, som involverar deletion av små antigenspecifika populationer. Många modellsystem har använts för att studera negativ selektion men varierar i sin förmåga att rekapitulera fysiologiska händelser 6. Till exempel, in vitro-stimulering av tymocyter saknar tymus miljö som är intimt inblandad i valet, medan administrering av exogent antigen kan leda till icke-specifik deletion av tymocyter 7-9. För närvarande är de bästa verktygen för att studera in vivo negativ selektering är möss som uttrycker en transgENIC TCR specifik för endogen själv-antigen. Men många klassiska TCR transgena modeller som kännetecknas av tidig expression av den transgena TCRα kedjan vid DN stadiet, vilket resulterar i för tidig negativ selektion. Vårt laboratorium har utvecklat HY CD4-modellen, där transgena HY TCRα är villkorligt uttryck i DP stadiet, vilket negativt urval ske under DP SP övergång som sker i vildtyp möss 10.
Här beskriver vi ett flödescytometri-baserat protokoll för att undersöka tymus positiv och negativ selektion i HY CD4 musmodellen. Medan negativ selektion i HY CD4 möss är mycket fysiologisk, kan dessa metoder även tillämpas på andra TCR transgena modeller. Vi kommer också att presentera övergripande strategier för att analysera positiv selektion i en polyklonal repertoar som gäller för alla genetiskt manipulerade möss.
Protocol
Se figur 1 för en övergripande ordning av den experimentella protokollet.
1. Dissektion
- Placera steril stålnät skärmen i 60 x 15 mm petriskål. En enhet behövs per vävnadsprov.
- Tillsätt 5 ml av Hanks balanserade saltlösning (HBSS) till varje skål. Håll rätter på is.
- Euthanize möss med CO 2.
- Säker musen för att dissektion yta, ventrala sidan uppåt. Sprej mus med 70% etanol för sterilisering och för att säkerställa att pälsen tovigt ned.
- Med hjälp av kirurgiska saxar, börja dissektion genom en ventral snitt i buken huden precis ovanför könsorgan. Utöka snittet uppåt till hakan.
- Från mittlinjen, förlänga snittet ner längs alla lemmar. Dra tillbaka den lösa huden och stift ner till dissektion yta.
- Skörda bräss:
- Lyft den nedre bröstbensspets att göra ett snitt.
- Undvika levern, skär membranet att lossa bröstkorgen och sedan klippa bröstkorgen på varje sida. Skär bröstkorgen uppåt på varje sida, var noga med att undvika lungor och hjärta.
- Dra försiktigt ut bröstkorgen tillbaka med pincett. Bräss är en vit, bilobed organ ligger ovanför hjärtat. Använda den plana kanten av tången att förstå botten av loberna, försiktigt dra tymus och placera den på mesh.
- Skörda mjälten:
- Mjälten är en röd, surfbräda-formad organ ligger på vänster sida av musens bukhåla, under levern.
- Göra ett snitt i bukhålan. Dra försiktigt ut mjälten med en pincett, med det andra paret att retas bort bindväv. Placera mjälten på en separat mesh sikt.
2. Cellberedning
- Med hjälp av en kolv från en 3 ml spruta, slipaorgan till mesh tills endast bindväv och fett rester. Skölj nät med HBSS från skålen tre gånger. Använd en ny kolv för varje vävnadsprov.
- Andra alternativ för homogenisering vävnad kan användas i stället för detta förfarande.
- Räkna celler genom användning av en hemocytometer.
- Pelletera cellerna genom centrifugering vid 335 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
- Återsuspendera splenocyter i 500 pl av ACK lysbuffert (0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHC0 3, 0,1 mM Na 2 EDTA, pH 7,2) under 10 min vid rumstemperatur. Återsuspendera tymocyter vid 20 x 10 6 celler / ml i FACS buffert (PBS, 1% FCS, 0,02% natriumazid) och ställ åt sidan på is.
- Återgå splenocyter till isotonicitet genom tillsats av 5 ml HBSS. Pelletera splenocyter genom centrifugering och återsuspendera vid 20 x 10 6 celler / ml i FACS-buffert. Om celler måste förbli sterila, kan du använda steril RPMI + 10% FCS.
3.Färgade celler för flödescytometri
Syftet med detta protokoll är att beskriva strategier för analys av positiva och negativa urval med vildtyp (WT) och HY CD4 möss. För allmänna överväganden om flödescytometri experimentell design, förvärv och analys hänvisar vi läsaren till en utmärkt översyn av Tung et al. 11
- Alikvotera 4 x 10 6 tymocyter per flödescytometri prov till varje brunn i en 96-brunnars platta, samt 1 x 10 6 WT splenocyter per kompensation kontroll. Om du använder transgena möss, bör du inkludera en WT mus som kontroll i experimentet.
- Blockera Fc-receptorer genom att inkubera celler med anti-CD16/32 (klon 2.4G2) under 10 min på is.
- Spin plattan vid 335 xg vid 4 ° C under 5 min. Ta bort locket och skingra vätska från brunnarna genom att ställa plåten en gång, nedåt i en vask. Återsuspendera varje brunn i 200 | il FACS-buffert. Upprepa tvätten.
- Förbered antikropp drinkar som anges nedan, med den optimala koncentrationen av varje antikropp baserad på utspädning i 200 pl FACS-buffert per brunn. Den optimala koncentrationen av varje antikropp definieras som den lägsta koncentration som behövs för att ge den största separationen av positiva och negativa populationer. Om det inte finns någon negativ population för en given antikropp, bör en isotyp antikropp ingå. Den totala volymen per brunn kan skalas ned (t.ex. till 100 pl per brunn) om så önskas.
- WT thymus: anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 eller anti-CD5, anti-CD24
- HY CD4 tymus: anti-HY TCR (T3.70), anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69-eller anti-CD5-, anti-CD24
För att få bättre separation av CD69 LO och CD69 hej befolkningsgrupper i tymocyter, rekommenderas att en biotinylerad anti-CD69 primär antikropp användas, följt av en sekundär fläck innehåller fluorokrom-konjugerat streptavidin. Vi use samma strategi för CD5 färgning.
- Inkubera cellerna med 200 | il av antikropp cocktail i FACS-buffert under 30 min på is i mörker.
- Samtidigt med antikroppar cocktail färgning, fläck varje ersättning kontroll med en enda fluorokrom-konjugerad antikropp. Idealt, innefattar ersättning färgning samma antikroppar som används i antikropp cocktail. Emellertid kan färgning för varje enskild antigen inte vara möjligt för större experiment när många antigener som analyseras. Därför färgning för antingen anti-CD4 eller anti-CD8 rekommenderas på grund av hög expression av dessa antigener, eller användning av ersättning pärlor. Fläck i FACS-buffert under 30 min på is i mörker. Lämna en tryckutjämningskontroll ofärgade.
- Tvätta cellerna två gånger med FACS-buffert.
- Återsuspendera cellerna i FACS-buffert och överför till FACS-rör.
- Förvärva prov på flödescytometern. Inkludera förvärv av FSC-A och FSC-W till enllow för dubblett diskriminering.
4. Analys av data flödescytometrisystem - Icke-TCR Transgena möss
Vi använder FlowJo för flödescytometri dataanalys. Se Figur 2A för gating strategin för icke-TCR-transgena möss.
- Använda FSC-A genom SSC, elektroniskt porten på "lymfocyt" befolkning.
- Inom "lymfocyt" befolkningen använder FSC-A av FSC-W elektroniskt gate FSC-W Lo befolkning att utesluta cell dubbletter och aggregaten. Detta är den "singlett" grind.
- Använda händelserna i "singlett" grind, tomt CD8 av CD4. Rita grindar för DN, DP tråkig, DP ljusa, CD4 + CD8 lo, CD4SP och CD8SP populationer som avbildas i figur 2B.
- Enligt CD4SP och CD8SP grindar, skapa TCRβ med CD24 tomter. Använd kvadranten grind för att rita grindar, såsom visas i figur 2C.
- Skapa en new plot från "singlett" gate: TCRβ av CD69. Rita grindarna A, B, C, D som visas i figur 2D.
- Skapa en annan tomt från "singlett" gate: TCRβ med CD5. Rita grindar I, II, III, IV, såsom visas i figur 2E. Detta är en annan strategi för att undersöka positiv selektion.
- Applicera DN, DP tråkig, DP ljusa, CD4 int, CD4SP och CD8SP grindar från under "singlett" till grindarna I, II, III, IV, A, B, C, D (figur 2D, E).
- Beräkna antalet celler i en viss delmängd genom att multiplicera orgel cellulariteten av frekvensen av varje efterföljande porten tills du når din målgrupp. Till exempel skulle antalet TCRβ hi CD69-CD8SP tymocyter bestämmas genom bräss cellularitet x% TCR BHI CD69-(fraktion D) x% CD8SP.
- Räkna tar redan hänsyn till de levande och döda celler så inte inkludera "lymphocyte "grind i dina beräkningar.
5. Analys av data flödescytometrisystem - TCR-transgena möss
Se Figur 3A för gating strategin för TCR-transgena möss.
- Följ stegen 4,1 och 4,2 som i föregående avsnitt.
- Under "singlett" grind, skapa en T3.70 av Rymdbolaget tomt och grind på T3.70 + cellpopulationen att analysera antigen-specifika T-celler (Figur 3B). Under vissa omständigheter kan det vara av intresse att jämföra denna population till den icke-antigen-specifik (T3.70-) T-cellpopulationen.
- Inom T3.70 + populationen, rita DN, DP, CD4SP och CD8SP grindar (figur 3C).
- För WT kontrollprover, rita dessa portar under "singlett" grind eller skapa en T3.70-grind eftersom det kommer att vara mycket få T3.70 + celler.
- Enligt CD8SP porten, skapa enT3.70 av CD24 tomt. Använd kvadrant gating verktyget att dela celler i fyra populationer (figur 3F).
- Skapa en överlagrat histogram visar CD69-uttryck i UP fack WT möss och T3.70 + DP fack av HY CD4 möss (figur 4A). Upprepa undersöka CD5 uttryck (Figur 4B).
- Beräkna absoluta antalet celler i varje delmängd av intresse såsom i 4,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I fysiologiska TCR transgena modeller och WT möss, börjar positiv selektion på DP ljusa stadiet innan du flyttar in i DP tråkig steget efter antigen möter. DP tråkig tymocyter in sedan en övergångsperiod CD4 + CD8 Lo skede innan han blev CD4SP eller CD8SP tymocyter (Figur 2B). Mogna SP tymocyter kännetecknas av hög TCR expression och förlust av CD24 (figur 2C). Medan CD8 av CD4 profil kan avslöja brister i positiv selektion, undersöka TCRβ med CD69 eller CD5 kan ge ytterligare insikt i om felet ligger. Både CD69 och CD5 är uppregleras efter TCR-stimulering, med starkare interaktion vägbeskriving högre uttryck av dessa markörer.
På TCRβ med CD69 tomt, grind A (TCRβ lo CD69-) representerar en population av förval DP tymocyter, grind B (TCRβ int CD69 +) representerar en stansitional befolkning direkt efter TCR ingrepp, grind C (TCRβ hi CD69 +) representerar populationen av celler direkt efter positiv selektion, och grinden D (TCRβ hi CD69 -) representerar en mer mogen population av celler (Figur 2D). I en WT mus, grind A består av DP ljusa celler, medan grinden B främst består av DP ljus med några DP tråkig och CD4 + CD8 lo celler. Gate C består främst av DP tråkig, CD4 + CD8 lo och CD4SP celler, medan Gate D främst består av CD4SP och CD8SP. Avsaknad av befolkningen B och C kan tyda på försämrad positiv selektion. Förändringar i förhållandet CD4SP till CD8SP inom befolkningen D kan föreslå förändringar i härstamning engagemang. Förlusten av befolkningen C och D kan återspegla överlevnadsfrågor efter positiv selektion.
Undersöka TCRβ med CD5 är en annan strategi to identifiera pre-och post-positiv selektion populationer. Befolkning I (TCRβ Lo CD5 lo) representerar förval DP tymocyter och befolkning II (TCRβ lo CD5 int) är celler initierar positiv selektion (figur 2E). Dessa populationer är främst DPbright tymocyter. Befolkning iii (TCRβ int CD5 hi) representerar tymocyter i processen att genomgå positiv selektion och består främst av DP tråkig och CD4 + CD8 lo tymocyter. Befolkning IV (TCRβ hi CD5 hi) består främst av post-positiva tymocyter urval SP. Nedsatt generation befolkningen II och III föreslår defekt positiv selektion. Förändringar i förhållandet CD4SP till CD8SP inom befolkningen IV trots normala föregående populationer kan föreslå förändringar i härstamning engagemang. En avsaknad av befolkningen IV kan indikera minskad överlevnad efter positiv urvalning. Till exempel i TOX - / - möss leder defekt CD4SP differentiering till en drastisk minskning av populationer iv, C och D, medan positiv selektion förblir intakt 12. Sanna defekter i positiv selektion kan ses med Bcl11b inaktivering under DP stadiet, vilket leder till förlust av populationer B, C och D 13,14. RasGRP1-defekta möss har en tidigare defekt i positiv selektering, vilket resulterar i närvaro av endast population A (opublicerade data).
Som negativ selektion innebär borttagning av små antigenspecifika populationer är fel i denna process bäst observeras med TCR-transgena möss. I HY CD4 möss, kan tymocyter uttrycker transgena HY TCR detekteras med den monoklonala antikroppen T3.70 (figur 3B). Den HY TCR erkänner manligt specifika HY antigen presenteras inom MHC klass-ID b.. Således HY CD4 män (M) möss genomgår negativ urval av HY TCR
En varning för TCR transgena modeller är att transgena TCR uttrycks mycket hela tymocyt utveckling. Som ett resultat, är det svårt att ytterligare karakterisera positiv selektion genom att identifiera populationer baserat på TCR och CD69/CD5 uttryck. Emellertid korrelerar CD69 och CD5 uttryck med styrkan av TCR-signalering. I WT möss, inte genomgår de flesta DP tymocyter inte positiv eller negativ selektion, vilket kräver TCR engagemang pMHC och därmed inte uppreglerar CD69 eller CD5. HY CD4 F möss har en stor population av T3.70 + DP tymocyter som undergår positiv selektion, såsom indikeras av en ökning i CD69 + populationen jämfört med WT (Figur 4A). Negativ selektion involverar en högre affinitet TCR stimulans än positiv selektion, vilket indikeras genom högre uttryck av CD69 på T3.70 + DP tymocyter i HY CD4 M möss, resulterar i en förskjutning Of histogrammet toppen till höger. Liknande trender ses med CD5 uttryck (Figur 4B). Vid analys av tymus urval i genmanipulerade möss, undersöka CD69 eller CD5 uttryck kan avgöra om felet ligger hos TCR-signalering eller nedströms resultat av TCR-stimulering.
Figur 1. Total system för det experimentella protokollet.
Figur 2. Analysera tymus val i icke-TCR-transgena möss. (A) Gating strategi för analys tymus val i icke-TCR-transgena möss. (B) CD8 genom CD4 profil av en WT tymus. (C) Undersöka löptid SP tymocyter genom TCRβ och CD24 uttryck. (D) Stadier av positiv selektion kan särskiljas genomCD69 av TCRβ uttryck, tillsammans med CD8 och CD4 profilering i varje undergrupp. (E) TCRβ med CD5 är en annan strategi som kan användas för att separera utvecklingsstadier. Klicka här för att se större bild .
Figur 3. Analysera tymus urval i HY CD4 möss. (A) Gating strategi för analys tymus selektion i TCR-transgena möss. (B) Frekvensen av tymocyter uttrycker HY TCR (T3.70 +) i WT, HY CD4 F och HY CD4 M möss. (C) CD8 genom CD4-profiler av T3.70 + befolkningen i angivna möss. Förutom frekvenser, det absoluta antalet T3.70 + DP (D) och speciellt T3.70 + CD8SP (E) tymocyter är viktiga indikatorer på negativa urval. (F) Undersökalöptid på CD8SP tymocyter i angivna möss. Klicka här för att se större bild .
Figur 4. Redovisning av aktiveringsmarkörer CD69 (A) och CD5 (B) på den totala DP tymocyter från WT och T3.70 + DP tymocyter från HY CD4 F och HY CD4 M möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som presenteras här kan användas för att undersöka positiv och negativ selektion i icke-TCR transgena och TCR-transgena möss. Detta protokoll beskriver färgning av ytantigener. För ytterligare analys av molekylära mekanismer, är det ofta nödvändigt att utföra intracellulär färgning. Vi använder BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kit för de flesta intracellulära proteiner och BD Biosciences Foxp3 färgningskit för transkriptionsfaktorer. Vi förvärvar brukar våra prover direkt efter färgning. Emellertid kan proverna förvaras över natten i FACS buffert med 1% formaldehyd vid 4 ° C i mörker. Var medveten om att vissa fluorokromer och antikroppar inte kan vara förenligt med fixering.
För analys av positiv selektion, rekommenderar vi att du använder biotinylerat anti-CD69-eller anti-CD5 att ge bättre separation av negativa, mellan-och hög uttrycker populationer (figur 2). Som beskrivits i de representativa resultat,denna gating strategi kommer att hjälpa skilja defekter i positiv selektion från härstamning engagemang, eftersom två kan kräva olika uppföljning. Förutom generation mogna SP tymocyter kan positiv selektion bekräftas genom uppreglering av IL-7Rα och CCR7. Men dessa markörer uttrycks på låg nivå på post-val DP tymocyter jämfört med SP tymocyter 15,16. För detaljerad analys av mognad stadier inom DP facket kan intracellulärt ZAP70 uttryck mätas 17. Detta kan vara särskilt användbart för att visa att populationer med liknande uttryck av mognad markörer, såsom i och ii den TCRβ X CD5 tomt (Figur 2E), representerar olika utvecklingsstadier.
HY CD4 modellen har fördelarna att representera både positiv och negativ selektion, liksom fysiologisk expression av det transgena TCR. Emellertid kan dessa metoder användas förandra TCR transgena modeller med vissa överväganden. Alltid innehålla en antikropp mot transgena TCR val för att möjliggöra studier av antigen-specifika T-celler. För vissa analyser kan det vara av intresse att jämföra den antigenspecifika befolkning till den icke-specifika populationen som en intern kontroll. Studera negativt urval i andra TCR transgena modeller kräver ytterligare överväganden. Stadiet för tymocyt utveckling under vilken negativ selektion sker varierar mellan de olika TCR transgena modeller. HY CD4 tymocyter ingrepp pMHC i DP skede således analys av HY-specifika CD8SP avkomma befolkning är korrekt avläsning för negativ selektion 10,18 (figur 3). Om negativ selektion sker under DN till DP övergång som i klassiska HY möss 19, skulle analysen av intresse vara närvaron eller frånvaron av antigen-specifika DP tymocyter. Val mot den allestädes närvarande HY-antigenet sker i tymuskortex 20. Däremot sker negativ selektion mot vävnads-begränsade antigener i tymus medulla 21,22. OT-I RIP-mova möss rekapitulera denna typ av val som Ova antigenet uttrycks under kontroll av råttinsulin promotor, som är aktiv endast i tymus medulla och pankreas 23. Eftersom positiv selektion av DP tymocyter i tymus cortex först krävs för migrationen till märgen, avsaknaden av mogna (CD24 lo) OT-I TCR + CD8SP tymocyter indikerar lyckad negativ selektion i OT-I Rip-mova möss 24.
Vid användning TCR transgena möss har fördelen av att kunna studera en stor population av antigenspecifika celler, är en potentiell varning förändrad T-cell-utveckling på grund av begränsade ligander som kan mediera positiv och negativ selektion av transgena TCR. I RAG-tillräckliga HY CD4 möss, är en annan varning som samexpression av endogenous TCRα kedjor har potential att modulera positiv och negativ selektion på en minoritet av HY TCR + tymocyter. Denna protest är inte unikt för HY CD4-modellen, utan snarare TCR transgena modeller i allmänhet. De representativa HY presenterade CD4 härrör från HY CD4 möss på en trasa-tillräcklig bakgrund. Även något mer komplex till sin natur, det finns många sätt att studera tymocyt val i en mer fysiologisk miljö för begränsad prekursor frekvens. Till exempel, kan TCR transgena och WT blandade ben chimärer benmärg genereras för att minska den antigenspecifika tymocyt prekursor frekvens. Dessutom kan man använda möss som uttrycker endast en transgen TCRβ kedja, såsom VB8 kedjan av HY TCR 25 eller VB5 kedja OT-I TCR 26 att begränsa prekursor frekvens. Eftersom den transgena TCRβ kedjan paras med olika endogena TCRα kedjor, spårning av antigen-specifika tymocyter requires användning av pMHC tetramerer. En begränsning av denna metod är att TCR uttryck är för låg på DP tymocyter att möjliggöra detektion med tetramerer. Detta begränsar ytterligare studier av de molekylära mekanismerna i DP tymocyter som leder till positiv och negativ selektion. Mer nyligen har en kombination av pMHC tetramerer och magnetiska pärlor berikning använts för att räkna små antigenspecifika populationer av CD4 + T-celler i obehandlade möss 27.
Negativt urval medieras primärt av klonal radering av självreaktiva tymocyter via inre apoptos vägen. Apoptotiska tymocyter kan detekteras genom flödescytometri med användning av intracellulär färgning för kluven caspas-3. Det BH3 endast Bcl-2 familjemedlem Bim är viktigt för kaspas-3 aktivering i tymocyter som svar på TCR-stimulering 18,28. Genom att korsa Bim-brist möss till olika TCR transgena modeller har vårt laboratorium funnit att Bim krävs för negativ urvalskydd mot allestädes närvarande själv-antigener men inte vävnads-begränsade antigener, indikerar att det finns flera negativa urvalsmekanismer 18,29. Liknande tillvägagångssätt har inblandade den föräldralösa steroidreceptor Nur77 som en annan viktig förmedlare av tymus negativ selektering 30,31. Transkriptionell analys av DP tymocyter från HY CD4 möss har genererat en lista av gener specifikt induceras under positiv och negativ selektion 32. Tillämpning av de metoder som presenteras här till möss manipulerade i dessa gener kan ge insikt i de molekylära mekanismer tymisk urval.
Den är idealisk för att följa upp granskningen av tymus val med en analys av den perifera immun facket. Emellertid är det ofta svårt att skilja central och perifer radering. Negativ selektion slutligen reflekteras av frånvaron av autoimmunitet. Även om de har begränsningar, TCR transgena möss är ett kraftfullt och praktiskt sätt attstudera fysiologiska negativt urval. Crossing TCR transgena möss till möss med brist på vissa gener är ett effektivt sätt att undersöka de molekylära mekanismer negativ selektion. Det är viktigt att vara medveten, dock att perifera inflammation på grund av ett genfel orsaka icke-specifik tymocyt radering medierad av kortikosteroider och cytokiner 7-9. I sådana fall, kan den strategi som presenteras här kan tillämpas på analysen av Thymi från neonatala möss före uppkomsten av inflammation. Positiv selektion, å andra sidan, kan studeras i antingen TCR-eller icke-TCR transgena modeller, spara utredare oroligheterna i korsningar. En bättre förståelse av de molekyler som är involverade i positiv och negativ selektering kommer att leda till nya strategier för diagnos och behandling av autoimmuna och immunbristsjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Bing Zhang för hans tekniskt bistånd. Detta arbete har finansierats av den kanadensiska Institutes for Health Research (MOP-86.595). TAB är en CIHR ny utredare och AHFMR Scholar. QH stöds av en CIHR Canada Graduate Scholarship - Utbildning och AIHS Heltid STUDENTTILLVARO. SAN stöds av en drottning Elizabeth II Graduate Scholarship. AYWS stöds av en NSERC Utbildningsbidrag - Utbildning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HyClone Hank's balanced salt solution | Thermo Scientific | SH30030.02 | |
| Metal mesh screens | Cedarlane | CX-0080-E-01 | |
| Petri dishes (60 x 15 mm) | Fisher Scientific | 877221 | |
| Syringes (3 ml) | BD Biosciences | 309657 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62.554.205 | |
| Microscope | Zeiss - Primo Star | 415500-00XX-000 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| 96-well plate | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| Multichannel pipette | Fisherbrand | 21-377-829 | |
| Fetal calf serum | PAA | A15-701 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | SH3025802 | |
| Sodium azide | IT Baker Chemical Co. | V015-05 | |
| FcR blocking reagent | Clone 2.4G2 | ||
| Anti-mouse HY TCR | eBioscience | XX-9930-YY* | Clone T3.70 |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | XX-0042-YY* | Clone RM4-5 |
| Anti-mouse CD8α | eBioscience | XX-0081-YY* | Clone 53-6.7 |
| Anti-mouse CD24 | eBioscience | XX-0242-YY* | Clone M1/69 |
| Anti-mouse TCRβ | eBioscience | XX-5961-YY* | Clone H57-597 |
| Anti-mouse CD69 Biotinylated | eBioscience | 13-0691-YY* | Clone H1.2F3 |
| Anti-mouse CD5 Biotinylated | eBioscience | 13-0051-YY* | Clone 53-7.3 |
| Streptavidin | eBioscience | XX-4217-YY* | |
| Flow cytometer | BD Biosciences - FACS Canto | 338962 | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar - Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| HyClone RPMI - 1640 medium | Thermo Scientific | SH30027.01 | |
*XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
|||
References
- Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).
- Liston, A. Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity. J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).
- Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation. Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. Central tolerance: what have we learned from mice. Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).
- Zhan, Y. Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).
- Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo. J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).
- Martin, S., Bevan, M. J. Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection. European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).
- Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection. J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).
- Tung, J. W. Modern flow cytometry: a practical approach. Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).
- Aliahmad, P., Kaye, J. Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX. J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).
- Kastner, P. Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes. Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).
- Albu, D. I. BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes. J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).
- Van De Wiele, C. J. Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation. J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).
- Ueno, T. CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes. J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).
- Saini, M. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science signaling. 3, ra23 (2010).
- Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens. J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).
- Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self. Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).
- Anderson, M. S. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
- Kurts, C. Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo. J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).
- Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).
- Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity. 13, 829-840 (2000).
- Gallegos, A. M., Bevan, M. J. Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).
- Moon, J. J. Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27, 203-213 (2007).
- Bouillet, P. BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes. Nature. 415, 922-926 (2002).
- Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection. Immunity. 3, 273-282 (1995).
- Zhou, T. Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells. J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).
- Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo. J. Immunol. 179, 837-844 (2007).
