Summary
Denne artikkelen beskriver en metode der man kan etterligne
Abstract
Vi beskriver en metode for ex vivo dyrkning av hele Drosophila hjerner. Dette kan brukes som et kontrapunkt til kroniske genetiske manipulasjoner for å undersøke cellebiologi og utvikling av sentrale strukturer i hjernen ved at akutte farmakologiske intervensjoner og levende bilder av cellulære prosesser. Som et eksempel på teknikken, før arbeide fra vår lab 1 har vist at en tidligere ikke subcellulære rom ligger mellom de aksonale og somatodendritic avdelinger av axoner i Drosophila sentrale hjernen. Utviklingen av denne avdelingen, kalt axon første segmentet (AIS) 2, ble vist genetisk til å avhenge av nervecellen-spesifikke cyclin-avhengige kinase, Cdk5. Vi viser her at ex vivo behandling av vill type Drosophila larver hjerner med Cdk5-spesifikk farmakologisk hemmere roscovitine og olomoucine tre forårsaker akutte forandringer i aktin organisasjon, ogi lokalisering av celle-overflate protein 2 Fasciclin, som etterligner endringene sett i mutanter som mangler Cdk5 aktivitet genetisk.
Et annet eksempel på ex vivo kulturen teknikk gis for ombygging av tilkoblinger av embryonale sopp kroppen (MB) gamma neuroner under metamorfose fra larve til voksen. Soppen Kroppen er sentrum for olfactory læring og hukommelse i flua 4, og disse gamma nevronene beskjære sine aksonale og dendrittiske grener under pupal utvikling og deretter re-strekker greiner på et senere endepunktet for å etablere den voksne innervasjon mønster fem. Beskjæring av disse nevronene i MB har vist seg å skje via lokale degenerasjon av neurite grener 6, med en mekanisme som utløses av ecdysone, et steroid hormon, som skuespiller i en ecdysone reseptoren B1 7, og som er avhengig av aktiviteten i ubiquitin-proteasome system seks. Vår metode for ex vivo dyrkning kan be brukes til å avhøre ytterligere mekanisme utviklingsmessige remodeling. Vi fant at i ex vivo kulturen innstilling, gamma neurons av MB rekapitulert prosessen med utviklingsmessige beskjæring med en gang kurs lik som in vivo. Det var viktig, men å vente til 1,5 timer etter puparium formasjon før eksplantasjon vevet for at cellene til å forplikte seg irreversibelt til metamorfose, dissekering av dyr ved utbruddet av pupariation ført til liten eller ingen metamorfose i kulturen. Dermed, med passende endring, kan ex vivo kulturen tilnærming brukes til å studere dynamiske så vel som steady state aspekter av sentral hjerne biologi.
Protocol
A. Forberedelse av Media
- Forbered komplette media ved filter-sterilisering Schneider Drosophila Media supplert med 10% Fetal Bovine serum og 1% penicillin / streptomycin.
- Media bør være forberedt på frisk hver gang. Alternativt kan en fersk delmengde av pre-frosne media tines før hver bruk.
- Før dyrking, tilsett 10 mikrogram / ml insulin og 2 mikrogram / ml ecdysone til media. Narkotika ble utarbeidet som konsentrerte bestander og frosset i små alikvoter. Tint alikvoter var ikke fryses på nytt.
- Alle arbeidsgrupper løsninger bør opprettholdes ved 25 ° C.
Dyrkning av larvenes Hjerner
1. Utvalg og Dissection av larvenes Hjerner
- Legg til 500 mL av media til en 12 mm Millicell cellekultur innsatsen. De dissekerte hjerner vil bli plassert i disse innsatser for å forenkle farging.
- Legg til en liten mengde preparerte media til en disseksjon urglass.
- Usynge en liten spatel, plukke opp vandrende tredje instar larver og plassere dem i urglass. (Vi antar at ex vivo kulturen metoden ville gjelde like godt for første eller andre instar larver, men vi har ikke testet dette.)
- Hold bakre enden av larven med en pinsett, forsiktig åpne opp den fremre enden med en andre par # 5 tang.
- Raskt dissekere ut hjernen, holder ventrale nerve ledningen intakt.
2. Ex vivo dyrking av dissekert larve Hjerner
- Ved hjelp av pre-våte pipettespisser, overføre hjernen forsiktig inn i cellekultur inserts, pre-fylt med media.
- Transfer hjerner, i media, til en inkubator ved 25 ° C til ønsket tid-punktet er nådd. Denne metoden fungerer effektivt for opp til 48 timer i kulturen.
- Bytt media på 8 timer. Utover det, erstatte halvparten av media hver 5-6 time.
3. Farmakologisk Manipulering avLarve Hjerner
Denne metoden for ex vivo dyrkning kan brukes til farmakologisk underbygge genetiske interaksjoner tidligere demonstrert i vår lab en.
- Tilsett 100 mM roscovitine og 100 mikrometer olomoucine til preparerte media.
- Overføring dissekerte hjerner til dette mediet.
- Kultur hjerner ved 25 ° C i 24 timer.
- Bytt media på 8 timer. Utover det, erstatte halvparten av media (med narkotika) hver 5-6 time.
Dyrkning av Pupal Hjerner
1. Valg av puppe for Dissection
- Marker hvit puppe på flasker / hetteglass.
- Bare velge puppe som er helt hvite. Puppe med noen form for hårfarging bør ikke inkluderes.
- Denne fasen er 0 timer etter Puparium Formation (APF).
- Disse puppe vil være klar for disseksjon 1,5 timer etter merking. Dette trinnet er avgjørende for å sikre at utviklingsmessige beskjæring skjer i ex vivo
2. Disseksjon av puppe
- Legg til 500 mL av media til en 12 mm Millicell cellekultur innsatsen. (De dissekerte hjerner vil bli plassert i disse innsatser for å forenkle farging).
- Når ønsket tid-punkt er nådd, legger en liten mengde preparerte media til en disseksjon urglass.
- Bruk en liten, våt slikkepott, plukke opp puppe tidligere markert for disseksjon og plassere dem i urglass.
- Hold bakre enden av puppe med en pinsett, nøye åpne fremre enden av puppe tilfellet med en andre par # 5 tang.
- Raskt dissekere ut hjernen, holder ventrale nerve ledningen intakt og festet.
3. Ex vivo dyrking av dissekert Pupal Hjerner
- Overfør hjernen forsiktig inn i cellekultur inserts, pre-fylt med media.
- Transfer hjerner, i media, til en inkubator ved 25 ° C til ønsket tid-point er nådd. Vi brukte denne metoden for opptil 10 timer i kultur for forsøket vist, men det kan bli utvidet til lengre perioder med observasjon og behandling, om nødvendig.
- For time-poeng mer enn 8 timer APF, erstatte media hver 5-6 time.
Fra dette trinnet på, forblir protokollen uendret for både larver og pupper.
B. Fixing dissekert Hjerner
- Når ønsket tid-punktet er nådd, fjerne media og legge 500 mL 4% formaldehyd i 1x PBS med 0,5% Triton X-100 (PBST) i 30 minutter, erstatte med frisk formaldehyd etter 15 minutter.
- Pass på ikke å tillate hjerner tørke mens erstatte medier med fiksativ.
- Vask formaldehyd med fire 10-minutters vasker 1X PBS med 0,5% TritonX-100 (PBST).
C. Fargetrau Faste Hjerner
- Etter formaldehyd har blitt vasket av, blokkerer hjernen for en time i en blokkering løsning av 1x PBS med 1% NormalGoat Serum og 1% Bovine serum albumin.
- Legg primære antistoffer som består i å blokkere løsning.
- Inkuber hjerner overnatting på 4 ° C.
- Den neste morgen, vaske av primære antistoffer med fire 10-minutters vasker av PBST.
- Legg sekundære antistoffer gjort opp i blokkering løsning.
- La ved romtemperatur i 4 timer.
- Vask sekundære antistoffer med fire 10-minutters vasker av PBST.
D. Montering Faste og Stained Hjerner for Mikroskopi
- Stabilisere hjerner i Vectashield montering media i 1 time.
- Monter hjerner på glassplater som bruker Vectashield montering media.
- Plasser glass chips på hver side av hjernen før montering av dekkglass. Dette hindrer hjernen fra å være klemt, samtidig prøve tynn nok til å skanne alle kontaktpunkter flyene med en confocal mikroskop. Hjerner var omtrent orientert ved montering for å lette vise funksjoner av interesse. Når det er nødvendig,hjernen bilder var rotert med Imaris programvaren for å gi en optimal visning for dokumentasjon og måling.
- Tetningshus slips med klar neglelakk.
- Lagres glir vekk fra lyset.
E. Representative Resultater
Figur 1 viser et panel av tredje instar larver hjernen til (A) vill type fluer og (B) fluer som uttrykker en dominerende-negativ derivat av Cdk5 (Cdk5DN) (Connell-Crowley et al., 2000). Både express aktin-GFP (green) i MB gamma nevroner. Som beskrevet tidligere (Trunova et al., 2011), det er en region i proksimale axons av vill type gamma nevroner som ikke klarer å samle actin-GFP, og dermed viser seg som en «klar sone" (A, brakett), og fasciclin 2 protein (rød) akkumuleres i axons bare opp til ventrale grensen denne sonen (hvit horisontal linje). Den stiplede linjen i tredje panel i figur 1 (A) angir posisjonen til MB, fremhever handlingi "klar sone" og dens ventral grensen. I fluer uttrykker Cdk5DN, er aktin klar sonen fraværende (B) og Fasciclin 2 (FasII) immunoreaktivitets sprer dorsally gjennom denne regionen. (Merk at variable antall FasII-positive axoner prosjekt horisontalt over MB, og disse er ikke relevant for fenotypen). Scale linjen representerer 20 mikrometer.
Ved å bruke vår metode for ex vivo dyrkning, behandlet vi vill type fluer med en kombinasjon av roscovitine og olomoucine, farmakologiske hemmere av Cdk5 aktivitet. Figur 2 viser et panel av tredje instar larver hjerner av kontroll (A) og narkotika-behandlet (B ) vill type fluer. I likhet med fluer som uttrykker en dominerende negativ Cdk5 konstruksjon, hjerne behandlet med Cdk5 hemmere for 24 timer, viser den karakteristiske tapet av aktin klar sone og skifte i FasII grensen (firkantet parentes). Hvite linjer viser plasseringen av villtype FasII grensen. Scale linjen representerer 20 mikrometer.
Figure 3 viser en representativ serie Drosophila sopp organer fra 0-10 timer APF, merket med membran-målrettede mCD8-GFP (green). Parentes angir begeret, som er de dendrittiske projeksjoner av MB. Før metamorfose, kan man se MB axoner coursing dorso-ventrally i tykke bunter, samt en "dis" av fluorescerende signal som følge av den tette dendrittiske arbor (brakett). Panel A viser hjerner dissekert på dette tidspunkt tilsa. Legg merke til beskjæring av dendritter i regionen angitt med parentes, slik at ved 6-8 timer APF, disen av dendrittiske signalet er borte (selv om aksonal signalet er upåvirket). Hjerner i panel B ble dissekert på 0 timer APF, før den interne ecdysone spike (Truman og Riddiford, 2002), og kultivert ex vivo som angitt. Disse viser ingen utviklingsmessige beskjæring av dendritter, snarere dendrittiske signalet vedvarer på 10 timer APF. For å omgå dette, er puppe merket på 0 timer APF, men dissekert på 1,5 timer APF og kultivert. Panel C viser en representativ serie av disse Drosophila sopp organer fra 0-10 timer APF. Som i de ikke-kultiverte prøvene, er dendrittiske signal oppdages av 8 hr APF. Scale linjen representerer 20 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kroniske genetiske manipulasjoner av vev struktur og funksjon, inkludert mutasjoner og uttrykk for transgener, typisk produsere en kombinasjon av umiddelbare virkninger og sen indirekte konsekvenser som kan være svært vanskelig å skille. Utfyller genetiske metoder med farmakologi kan lette avhør av tiden selvfølgelig bak en fenotype. For eksempel har dette vært en kraftig tilnærming for å dissekere bidrag fra ulike cytoskeletal komponenter under spermatogenesen i Drosophila 10. I dagens eksempel har det tillatt oss å vise at det er en vedvarende krav om Cdk5 å opprettholde strukturen av AIS i Drosophila. I andre forsøk har vi også hatt suksess med narkotika som er rettet mot andre cellulære komponenter, inkludert protein kinaser (imatinib), actin polymerisasjon (cytochalasin, latrunculin og jasplakinolide) og mikrotubuli (vinblastin og Taxol).
"> Ex vivo kultur metoder også tillate høy oppløsning analyse av dynamikken i utviklingsprosesser. Har tidligere studier beskrives kort sikt levende avbildning av den sentrale hjernen 11, eller lengre sikt avbildning av andre deler av nervesystemet, slik som thorax ganglier 12 og netthinnen / optikk lobe tilkoblinger 13. her, mens vi har fokusert på analyse av vev ved farging av fast materiale, skal den metoden vi beskriver være gjeldende for langsiktig levende avbildning av den sentrale hjernen. For eksempel riktig beskjæring av axoner og dendritter under utviklingen av Drosophila sopp kroppen er avgjørende for å etablere riktige forbindelser og innervasjon mønstre i det sentrale nervesystemet. tillegg er unormalt i neuronal organisasjon og ombygging tenkt å ligge til grunn flere nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers, ALS og Parkinsons. The Teknikken er beskrevet her tillater oss å etterligne i vivo ombygging av neurites i Drosophila sopp kroppen ex vivo, i kulturen. Vi kan nå image endringer i utviklingen i respons til genetiske endringer, farmakologisk behandling eller endringer i miljøet.
Figur 1. Over-uttrykk for Cdk5DN forårsaker tap av aktin 'klare sone "og et skifte i FasII grensen i gamma-nevroner i Drosophila sopp kroppen. Panel A viser tre eksempler på vill-type hjerner farget for actin-GFP (grønn) og FasII (rød) mens Panel B viser to eksempler på hjerner over-uttrykke Cdk5DN. Legg merke tapet av aktin 'klare sone' (brakett) og skift i FasII ventrale grensen (horisontal hvit linje) i (B). Den stiplede linjen i (A) viser plasseringen av sopp kroppen. Scale linjen representerer 20 mikrometer.
2 "/>
Figur 2. Behandling med farmakologiske Cdk5 hemmere roscovitine og olomoucine etterligner Cdk5DN over-uttrykk fenotypen i Drosophila sopp organer. Panel A viser to kontrollsystemer villtype hjerner mens panel B viser to narkotika-behandlede hjerne, dyrket i 24 timer. Legg merke tapet av aktin 'klare sone' (brakett) og skift i FasII grensen (horisontal hvit linje) i (B). Scale linjen representerer 20 mikrometer.
Figur 3. In vivo ombygging av dendritter i Drosophila sopp kroppen dendritter kan rekapitulert ex vivo. Panel A viser hjernene dissekert på tidspunkter angitt og farget for membran-bundet GFP (green). Merk forsvinningen av dendrittiske signalet (diffus, grønn signal, fremhevet av brakett) ved 8hr APF. Panel B viser hjerner dissekert på 0 timer APF og kultivert ex vivo ex vivo for tiden angitt. Disse hjerner viser dendrite beskjæring lik den som ses in vivo (A). Scale linjen representerer 20 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke alle medlemmene i vårt laboratorium for sine råd, nyttige diskusjoner og kommentarer på manuskriptet. Vi vil også spesielt takke Marta Koch og Bassem Hassan for den gode forslag som vi vente til 1,5 timer APF før dissekere hjerner for dyrking i remodeling eksperimenter. Vi takker NHGRI bildebehandling anlegg for bruk av deres confocal mikroskop. Dette arbeidet ble støttet av Basic Neuroscience Program av NINDS egenutført Research Program, NIH (Z01 NS003106).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider's Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | EMD Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
