Summary
Este artigo descreve um método pelo qual se pode imitar
Abstract
Nós descrevemos um método para a cultura ex vivo de cérebros inteiros de Drosophila. Isto pode ser utilizado como um contraponto crónicas manipulações genéticas para investigar a biologia celular e desenvolvimento de estruturas cerebrais centrais, permitindo agudas intervenções farmacológicas e de imagiologia vivo de processos celulares. Como um exemplo da técnica, antes trabalhar a partir de nosso laboratório 1 demonstrou que um compartimento anteriormente não reconhecida subcelular situa-se entre os compartimentos axonais e somatodendritic de axónios do cérebro central Drosophila. O desenvolvimento deste compartimento, referido como o segmento de axónio inicial (AIS) 2, foi mostrado geneticamente depender da quinase neurónio específico dependente de ciclina, CDK5. Nós mostramos aqui que o tratamento ex vivo de cérebros de tipo selvagem de Drosophila larvais com a CDK5-farmacológico específico inibidores roscovitina e olomoucina 3 provoca alterações agudas em organização da actina, ena localização da proteína da superfície celular fasciclina 2, que imitam as alterações observadas nos mutantes que não possuem actividade CDK5 geneticamente.
Um segundo exemplo da técnica de cultura ex vivo está prevista a remodelação das ligações do corpo de cogumelo embrionário (MB) neurônios gama durante a metamorfose de larva a adulto. O corpo de cogumelo é o centro da aprendizagem e memória olfativa na mosca 4, e esses neurônios gama podar os galhos axonais e dendríticas durante o desenvolvimento pupal e então re-ramos se estendem em um ponto no tempo mais tarde para estabelecer o padrão de inervação adulto 5. Poda destes neurónios do MB tem sido demonstrado que ocorrem através degeneração local de ramos neurites 6, por um mecanismo que é desencadeada por ecdisona, uma hormona esteróide, actuando no receptor de ecdisona B1 7, e que é dependente da actividade do ubiquitina-proteassoma sistema 6. O nosso método de cultura ex vivo pode be usado para interrogar ainda mais o mecanismo de remodelação de desenvolvimento. Descobrimos que na configuração de ex vivo cultura, os neurónios gama do MB recapitulou o processo de poda do desenvolvimento com um curso de tempo semelhante ao que in vivo. Era essencial, no entanto, de esperar até 1,5 horas após a formação pupário antes explantar o tecido para que as células de cometer irreversivelmente a metamorfose; dissecação dos animais no início da pupariation levou a metamorfose pouca ou nenhuma em cultura. Assim, com a modificação apropriada, a abordagem de cultura ex vivo pode ser aplicado para estudar dinâmica bem como os aspectos de estado estacionário da biologia cérebro central.
Protocol
A. Preparação de Mídia
- Preparar meio completo pelo filtro esterilizante-Drosophila Schneider meio suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina / estreptomicina.
- Os meios devem ser preparados de fresco de cada vez. Alternativamente, uma nova porção da pré-congelados meios de comunicação podem ser descongelado antes de cada utilização.
- Antes da cultura, adicionam-se 10 ug / ml de insulina e 2 ecdisona ug / ml para os meios de comunicação. As drogas foram preparadas como concentrados e stocks congelados em pequenas alíquotas. Alíquotas não foram descongeladas recongelados.
- Todas as soluções de trabalho deve ser mantida a 25 ° C.
A cultura de Brains larval
1. Seleção e Dissecção da Brains larval
- Adicionar 500 ul de mídia para um Millicell 12 mm inserção de cultura de célula. Os cérebros dissecados será colocado no estas inserções para facilitar imunocoloração fácil.
- Adicionar uma pequena quantidade de meios de preparados para um vidro de relógio dissecção.
- Ucantar uma pequena espátula, pegar vagando larvas de terceiro estádio e colocá-los no vidro de relógio. (Supomos que o método de cultura ex vivo se aplica igualmente bem a primeira ou segunda larvas, mas não testei isso.)
- Segurando a extremidade posterior da larva com um par de pinças, cuidadosamente abrir a extremidade anterior com um segundo par de # 5 fórceps.
- Rapidamente dissecar o cérebro, mantendo o cordão nervoso ventral intacto.
2. Cultura ex vivo de Dissecada Brains larval
- Utilizando pontas de pré-molhadas pipeta, transferir o cérebro cuidadosamente nas inserções de cultura de células pré-preenchidos com meios de comunicação.
- Cérebros de transferência, em media, para uma incubadora a 25 ° C até que o desejado tempo de ponto é atingido. Este método funciona de forma eficiente para até 48 h em cultura.
- Substitua a mídia menos 8 horas. Além disso, substituir metade dos meios de comunicação a cada 5-6 horas.
3. Manipulação farmacológica doBrains larval
Este método de cultura ex vivo pode ser usada para farmacologicamente corroboram interacções genéticas previamente demonstrada no nosso laboratório 1.
- Adicionar 100 roscovitina mM e 100 mM olomoucina a mídia preparados.
- Transferência cérebros dissecados para essa mídia.
- Cérebros de cultura a 25 ° C durante 24 horas.
- Substitua a mídia menos 8 horas. Além disso, substituir metade dos meios de comunicação (com drogas) a cada 5-6 horas.
A cultura de Brains pupais
1. Seleção de pupas para Dissecção
- Marcar pupas branco em garrafas ou frascos.
- Só escolher pupas, que são completamente branco. Pupas com qualquer tipo de coloração não deve ser incluída.
- Esta fase é de 0 horas após a formação pupário (APF).
- Estes pupas estará pronto para dissecção 1,5 horas após a marcação. Esta etapa é crucial para garantir que a poda de desenvolvimento ocorre em ex vivo
2. Dissecção de pupas
- Adicionar 500 ul de mídia para um Millicell 12 mm inserção de cultura de célula. (Os cérebros dissecados será colocado no estas inserções para facilitar imunocoloração fácil).
- Uma vez que o desejado tempo de ponto-tiver sido atingido, adicionar uma pequena quantidade de meios de preparados para um vidro de relógio dissecção.
- Usando uma espátula pequena, molhada, pegar pupas anteriormente marcado para dissecção e colocá-los no vidro de relógio.
- Segurando a extremidade posterior do pupas com um par de pinças, cuidadosamente abrir a extremidade anterior do processo pupa com um segundo par de # 5 fórceps.
- Rapidamente dissecar o cérebro, mantendo o cordão nervoso ventral intacto e em anexo.
3. A cultura ex vivo de Dissecada Brains pupais
- Transferir o cérebro cuidadosamente nas inserções de cultura de células pré-preenchidos com meios de comunicação.
- Cérebros de transferência, em media, para uma incubadora a 25 ° C até o desejado tempo de ponto é atingido. Utilizou-se este método para até 10 horas em cultura para a experiência mostrado, mas pode ser estendida para períodos mais longos de observação e tratamento, se necessário.
- Para prazos mais de 8 pontos APF horas, substituir a mídia a cada 5-6 horas.
A partir deste passo em diante, o protocolo permanece inalterado, tanto para larvas e pupas.
B. Fixação Brains Dissecada
- Uma vez que o desejado tempo de ponto é atingido, remover meios de comunicação e adicionar 500 uL de formaldeído a 4% em PBS 1x com 0,5% de Triton X-100 (PBST) durante 30 minutos, substituindo com formaldeído fresca depois de 15 minutos.
- Certifique-se de não permitir que cérebros para secar ao substituir a mídia com fixador.
- Lavar formaldeído com quatro lavagens de 10 minutos de 1x PBS com 0,5% tritonX-100 (PBST).
C. Coloração Brains fixos
- Depois de formaldeído foi lavada, bloquear cérebros durante 1 hora numa solução de bloqueio de 1x PBS com 1% NormalSoro de cabra e 1% albumina sérica bovina.
- Adicionar anticorpos primários formados em solução de bloqueio.
- Cérebros incubar durante a noite a 4 ° C.
- Na manhã seguinte, lave anticorpos primários com quatro lavagens 10 minutos de PBST.
- Adicionar anticorpos secundários formados em solução de bloqueio.
- Deixar à temperatura ambiente durante 4 horas.
- Lavar anticorpos secundários com quatro lavagens 10 minutos de PBST.
D. Montagem Brains fixos e corado para microscopia
- Equilibrar cérebros na mídia Vectashield montagem para 1 hora.
- Monte cérebros em lâminas de vidro, utilizando os meios de comunicação Vectashield de montagem.
- Colocar fichas de vidro em ambos os lados dos cérebros antes da montagem do deslizamento da tampa. Isso impede que os cérebros de ser esmagado, mantendo amostra fina o suficiente para digitalizar todos os planos focais com um microscópio confocal. Cérebros eram aproximadamente orientados sobre a montagem para facilitar a visualização das características de interesse. Quando necessário,imagens do cérebro foram rodados com software Imaris para proporcionar uma visão ideal para documentação e medição.
- Vedação da tampa desliza com unhas polonês claro.
- Loja desliza longe da luz.
Resultados E. Representante
A Figura 1 mostra um painel de terceiro instar-cérebros de larvas de (A) do tipo selvagem moscas e (B) moscas que expressam um derivado dominante negativo de CDK5 (Cdk5DN) (Connell-Crowley et ai., 2000). Ambos expressam actina-GFP (verde) nos neurônios gama MB. Tal como descrito anteriormente (Trunova et al., 2011), há uma região em que os axônios proximais dos neurónios do tipo selvagem gama que falha a acumular-se actina-GFP, mostrando assim como um "zona clara" (A, o suporte) e, fasciclina proteína 2 (vermelha) se acumula nos axônios apenas até a borda ventral desta zona (linha horizontal branca). A linha pontilhada no terceiro painel da Figura 1 (A) indica a posição do MB, realçando o actona "zona clara" e sua borda ventral. Em moscas que expressam Cdk5DN, a zona de actina claro está ausente (B) e fasciclina 2 (FasII) imunorreactividade espalha dorsalmente por aquela região. (Note que os números variáveis de FasII positivo projeto axônios horizontalmente em toda a MB, estes não são relevantes para o fenótipo). Barra de escala representa 20 microns.
Utilizando este método de cultura ex vivo, foram tratados de tipo selvagem moscas com uma combinação de roscovitina e olomoucina, inibidores farmacológicos de CDK5 actividade. A Figura 2 mostra um painel de terceiro instar-cérebros de larvas de controlo (A) e tratados com droga (B ) do tipo selvagem moscas. Semelhante ao moscas que expressam um dominante negativo CDK5 construto, os cérebros tratados com inibidores de CDK5 durante 24 horas, mostram a perda característica de actina zona clara e mudança na fronteira FasII (parênteses rectos). Linhas brancas mostram a posição de tipo selvagem fronteira FasII. Barra de escala representa 20 microns.
FIGUre 3 mostra uma série representativo de organismos de cogumelo de Drosophila de 0-10 horas APF, rotulado com membrana-alvo mCD8-GFP (verde). Parêntesis indicam o cálice, isto é, as projecções dendríticas do MB. Antes de metamorfose, pode-se ver axónios MB coursing dorsoventralmente em feixes de espessura, bem como uma 'neblina' de sinal fluorescente resultante da densa dendrítica mandril (suporte). O painel A mostra cérebros dissecados à hora indicada. Note-se a poda de dendritos na região indicada pelos parênteses, de tal forma que por 6-8 hrs APF, a neblina de sinal dendrítica se foi (embora o sinal axonal não é afetada). Brains no painel B foram dissecados em 0 horas APF, antes do interno ecdisona pico (Truman e Riddiford, 2002), e ex vivo de cultura, como indicado. Estes mostram nenhuma poda de desenvolvimento de dendritos, mas sim o sinal dendrítica persiste em 10 horas da APF. Para contornar isso, pupas são marcados em 0 APF horas, mas dissecado em 1,5 horas APF e culta. Painell C mostra uma série representativo destes corpos de cogumelo de Drosophila a partir de 0-10 APF horas. Tal como nas amostras não cultivadas, o sinal dendrítica é indetectável por 8 hr APF. Barra de escala representa 20 microns.
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Discussion
Crónicas manipulações genéticas da estrutura e função dos tecidos, incluindo mutações e expressão de transgenes, produzem tipicamente uma combinação de efeitos imediatos e tardios consequências indirectas que podem ser muito difíceis de separar. Complementando métodos genéticos com a farmacologia pode facilitar o interrogatório do curso de tempo atrás de um fenótipo. Por exemplo, esta tem sido uma poderosa abordagem para dissecar as contribuições dos diferentes componentes do citoesqueleto durante a espermatogênese em Drosophila 10. No exemplo actual, que nos permitiu mostrar que existe uma exigência para persistente CDK5 para manter a estrutura da AIS em Drosophila. Em outros experimentos que também tiveram sucesso usando drogas que têm como alvo outros componentes celulares, incluindo proteínas quinases (imatinib), actina de polimerização (citocalasina, latrunculin e jasplakinolide) e microtúbulos (taxol e vinblastina).
"> Ex métodos de cultura in vivo também permitem alta resolução análise da dinâmica dos processos de desenvolvimento. Estudos anteriores têm descrito a curto prazo de imagem vivo do cérebro central 11, ou a longo prazo de imagem de outras porções do sistema nervoso, tais como o 12 gânglios torácicos e retina / conexões do lobo óptica 13. Aqui, enquanto temos focado na análise de tecido por imunocoloração de material fixo, o método que descrevemos devem ser aplicáveis a longo prazo de imagens ao vivo do cérebro central. Por exemplo, poda adequada de axónios e dendritos durante o desenvolvimento do corpo de cogumelo de Drosophila é essencial para o estabelecimento de ligações correctas e padrões inervação no sistema nervoso central. Além disso, anormalidades na organização neuronal e remodelação são pensados para subjacentes várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica e de Parkinson. A técnica descrita aqui permite-nos imitar em remodelação in vivo de neurites na ex vivo Drosophila cogumelo corpo, em cultura. Podemos agora mudanças de imagem em desenvolvimento, em resposta a alterações genéticas, tratamentos farmacológicos ou mudanças no meio ambiente.
Figura 1. Mais de expressão de Cdk5DN provoca a perda de "zona clara" de actina e uma mudança na fronteira FasII em gama-neurônios do corpo cogumelo Drosophila. O painel A mostra três exemplos de tipo selvagem cérebros coradas para a actina-GFP (verde) e FasII (vermelho), enquanto O painel B mostra dois exemplos de cérebros sobre-expressam Cdk5DN. Observe a perda de "zona clara" a actina (suporte) e deslocar na fronteira FasII ventral (linha branca horizontal) em (B). A linha pontilhada em (A) indica a posição do corpo de cogumelo. Barra de escala representa 20 microns.
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Figura 2. O tratamento com inibidores farmacológico CDK5 roscovitina e olomoucina imita o Cdk5DN a sobre-expressão fenótipo em corpos de cogumelo de Drosophila. O painel A mostra duas controlo do tipo selvagem cérebros enquanto painel B mostra duas tratados com droga cérebros, cultivadas durante 24 horas. Observe a perda de "zona clara" a actina (suporte) e mudança na FasII fronteira (linha branca horizontal) em (B). Barra de escala representa 20 microns.
Figura 3. Na remodelação in vivo de dendrites dos dendritos corpo de Drosophila cogumelo pode ser reproduzido ex vivo. Painel A. Mostra cérebros dissecados nos pontos de tempo indicados e coradas para ligada à membrana GFP (verde) Observe o desaparecimento do sinal dendrítica (sinal, difusa verde, com destaque para o suporte) por 8hr APF. O painel B mostra cérebros dissecados em 0 horas APF e ex vivo de cultura ex vivo para os tempos indicados. Estes mostram cérebros poda dendrite semelhante à observada in vivo (A). Barra de escala representa 20 microns.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a todos os membros de nosso laboratório para os seus conselhos, discussões e comentários úteis sobre o manuscrito. Gostaríamos também de agradecer particularmente Marta Koch e Bassem Hassan para a excelente sugestão que esperar até 1,5 horas APF antes de dissecar o cérebro para cultura em experimentos de remodelação. Agradecemos também a facilidade de imagem NHGRI para o uso de seu microscópio confocal. Este trabalho foi financiado pelo Programa de Neurociência Básica do Programa de Pesquisa Intramural NINDS, NIH (Z01 NS003106).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider's Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | EMD Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
