Summary
В этой статье описывается метод, с помощью которого можно имитировать
Abstract
Мы описываем метод культивирования естественных бывший целого мозга дрозофилы. Это может быть использовано в качестве контрапункта к хроническому генетических манипуляций для изучения клеточной биологии и развития центральных структур мозга, позволяя острых фармакологических вмешательств и живые изображения клеточных процессов. В качестве примера техники, до работы из нашей лаборатории 1 показал, что ранее не субклеточных отсек находится между аксонов и somatodendritic отсеков аксонов мозга дрозофилы центральной. Развитие этого отделения, называют начальный сегмент аксона (АИС) 2, было показано генетически зависит от конкретного нейрона циклин-зависимой киназы, Cdk5. Здесь мы покажем, что экс лечение естественных дикого типа Drosophila личиночной мозги Cdk5 конкретных фармакологических ингибиторов росковитина и olomoucine 3 вызывает резкие изменения в организации актина ив локализации на поверхности клетки белок Fasciclin 2, которые имитируют изменения заметны и в мутантов, которые не имеют Cdk5 деятельности генетически.
Второй пример экс техника культуру естественных предусмотрена реконструкция связи эмбриональных тело гриба (МБ) гамма-нейронов во время метаморфоза личинки и взрослые. Гриб тело является центром обонятельного обучения и памяти в лету 4, и эти гамма-нейронов, обрезать их аксонального и дендритных ветвей в куколки, а затем повторно продлить отрасли на более поздний timepoint установить взрослых картина иннервации 5. Обрезка этих нейронов MB Было показано, что происходит через локальную дегенерация аксонов ветвей 6, с помощью механизма, который срабатывает экдизона, стероидных гормонов, действующие на рецепторы экдизона B1 7, и это зависит от активности убиквитин-протеасомной системы 6. Наш метод бывшего культивирования естественных может бE используется для дальнейшего допроса механизм развития ремоделирования. Мы обнаружили, что в бывшем настройки культуры естественных условиях, гамма-нейронов MB воспроизводятся в процессе развития, сокращение со временем конечно же, как в естественных условиях. Важно, однако, ждать 1,5 часа после пупария до культивирующий в искусственной среде ткани для того, чтобы совершить клетки необратимо метаморфоза, вскрытие животных пупаризации привело к практически без метаморфоз в культуре. Таким образом, при соответствующей модификации, экс подходе культура естественных условиях может быть применен для изучения динамических, а также устойчивый аспекты состояния центральной биологии мозга.
Protocol
А. Подготовка СМИ
- Подготовить всю СМИ фильтра стерилизации Шнайдер Drosophila СМИ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина / стрептомицина.
- СМИ должны быть готовы каждый раз свежее. Кроме того, свежий аликвоту предварительно замороженные средства массовой информации могут быть разморожены перед каждым использованием.
- До культивирования, добавить 10 мкг / мл инсулина и 2 мкг / мл экдизона в средствах массовой информации. Наркотики были подготовлены как концентрированных запасов и заморожены в небольшой порции. Талая аликвоты не замораживать.
- Все рабочие растворы должна поддерживаться на уровне 25 ° C.
Культивирование личинок Brains
1. Выбор и Препарирование личинок Brains
- Добавить 500 мкл среды на 12 мм Millicell вставки культуре клеток. Расчлененный мозги будут размещены в эти вставки для облегчения окрашивания.
- Добавьте небольшое количество подготовленных СМИ часовым стеклом рассечение.
- Uспеть небольшой шпатель, подобрать блуждающих третьего возраста личинок и поместить их в часовое стекло. (Мы полагаем, что экс метод культуры естественных бы в равной степени относятся и к первой или второй личинки возраста, но мы не проверяли это.)
- Проведение задний конец личинки с парой щипцов, тщательно открывают передним концом со второй парой # 5 щипцы.
- Быстро вскрыть из мозга, поддерживая брюшной нервной нетронутыми.
2. Ex естественных условиях культивирования личинок расчлененный Brains
- Использование предварительно увлажненный наконечники, передают мозгу тщательно в культуре клеток вставки, предварительно заполнены СМИ.
- Передача мозги, в средствах массовой информации, в инкубаторе при температуре 25 ° С до желаемого времени будет достигнута точка. Этот метод эффективно работает до 48 часов в культуре.
- Замените носитель на 8 часов. Кроме того, заменить половину средств массовой информации, каждые 5-6 часа.
3. Фармакологические манипуляцииМозги личинок
Этот метод бывшего культивирования естественных условиях могут быть использованы для фармакологической подтверждают генетических взаимодействий ранее продемонстрировали в нашей лаборатории 1.
- Добавить 100 росковитина мкм и 100 мкм olomoucine для подготовленных средствами массовой информации.
- Передача расчлененный мозги этой информации.
- Культура мозга при 25 ° С в течение 24 часов.
- Замените носитель на 8 часов. Кроме того, заменить половину средств массовой информации (с наркотиками) каждые 5-6 часов.
Культивирование куколки Brains
1. Выбор Куколки для Dissection
- Отметить белые куколки на бутылках / флаконов.
- Только выбирать куколок, которые полностью белым. Куколки с любым видом окраски не должны быть включены.
- Этот этап является 0 часов после пупария (НПФ).
- Эти куколки будет готов к вскрытии 1,5 часа после маркировки. Этот шаг является решающим для обеспечения развития обрезка происходит в бывших естественных
2. Препарирование Куколки
- Добавить 500 мкл среды на 12 мм Millicell вставки культуре клеток. (Расчлененный мозги будут размещены в эти вставки для облегчения окрашивания).
- Как только нужное время точка была достигнута, добавить небольшое количество подготовленных СМИ часовым стеклом рассечение.
- Используя небольшой мокрый шпателем, подобрать куколки ранее помеченные для вскрытия и поместить их в часовое стекло.
- Проведение заднем конце куколки с парой щипцов, осторожно откройте переднем конце случае куколка со второй парой # 5 щипцы.
- Быстро вскрыть из мозга, поддерживая брюшной нервной целости и прилагается.
3. Ex естественных Культивирование расчлененный куколки Brains
- Передача головного мозга осторожно в культуре клеток вставки, предварительно заполнены СМИ.
- Передача мозги, в средствах массовой информации, в инкубаторе при температуре 25 ° С до нужного времени-рoint достигнута. Мы использовали этот метод до 10 часов в культуре в течение эксперимента показали, но он может быть продлен на более длительный период наблюдения и лечения, если это необходимо.
- Для временных точках более чем на 8 часов APF, заменить средства массовой информации каждые 5-6 часа.
С этого шага на, протокол остается неизменной как для личинок и куколок.
B. Крепление расчлененный Brains
- Как только нужное время точка будет достигнута, средства массовой информации удалить и добавить 500 мкл 4% формальдегида в PBS 1x 0,5% Тритон Х-100 (PBST) в течение 30 минут, заменив свежей формальдегида через 15 минут.
- Убедитесь в том, чтобы не допустить мозги сушить при замене среды с фиксатором.
- Смыть формальдегида с четырьмя 10 минут мойки из 1x PBS с 0,5% TritonX-100 (PBST).
С. Окрашивание фиксированной Brains
- После того, как формальдегид был смывается, блокировать мозг в течение 1 часа в блокировании решения 1x PBS с 1% нормальныхСыворотки козьего и 1% бычьего сывороточного альбумина.
- Добавить первичных антител состоит в блокировании решения.
- Инкубируйте мозги ночи при 4 ° C.
- На следующее утро, смыть первичных антител с четырьмя 10 минут мойки из PBST.
- Добавить вторичных антител составил в блокировании решения.
- Оставить при комнатной температуре в течение 4 часов.
- Смыть вторичные антитела с четырьмя 10 минут мойки из PBST.
D. Монтаж фиксированных и окрашенных Мозги для микроскопии
- Равновесие в мозге Vectashield монтаж средств массовой информации в течение 1 часа.
- Установите мозги на стеклах использованием Vectashield монтаж средств массовой информации.
- Положите стекло чипов по обе стороны от мозга до начала монтажа крышки скольжения. Это предотвращает мозги от того, раздавленный, сохраняя при этом выборка достаточно тонким, чтобы проверять все фокальные плоскости с конфокальной микроскопии. Мозги были примерно ориентированный на монтаж для облегчения их просмотра особенностей интерес. При необходимости,мозг изображения были повернуты с Imaris программное обеспечение обеспечить оптимальный обзор документации и измерения.
- Печать покрытия квитанции с прозрачного лака для ногтей.
- Магазин скользит от света месте.
Представитель E. Результаты
На рисунке 1 показана панель третьего возраста личиночной мозга (А) дикого типа мухи и (B), мух, которые выражают доминантно-негативной производной Cdk5 (Cdk5DN) (Connell, Кроули и соавт., 2000). И экспресс-актин-GFP (зеленый) в нейронах MB гамма. Как было описано ранее (Трунова и соавт., 2011), есть область, в проксимальных аксонов дикого типа гамма-нейронов, которые не в состоянии накапливать актин-GFP, таким образом, появляется как "ясный зона" (, кронштейны), и fasciclin 2 белка (красный) накапливается в аксонов только до вентральной границы этой зоны (белая горизонтальная линия). Пунктирная линия на третьей панели на рисунке 1 (А) указывает положение Мб, подчеркнув актВ "чистый зоны" и его вентральной границы. В мухи выражения Cdk5DN, актин ясно зона отсутствует (B) и Fasciclin 2 (FasII) иммунореактивности распространяется сверху через этот регион. (Заметим, что переменное количество FasII-положительных проекта аксонов горизонтально Мб; это не относится к фенотипу). Шкала бар составляет 20 мкм.
Используя метод бывшего культивирования естественных условиях, мы относились к дикого типа мухи с комбинацией росковитина и olomoucine, фармакологические ингибиторы Cdk5 деятельности. На рисунке 2 показана панель третьего возраста личиночной мозги управления (A) и препарата обработанные (B ) дикого типа мухи. Как мухи выражения доминирующих отрицательных Cdk5 конструкции, мозг обрабатывают Cdk5 ингибиторов в течение 24 часов, показывают, характерными потери актина ясно зоны и изменение границ FasII (квадратные скобки). Белые линии показывают положение дикого границы FasII. Шкала бар составляет 20 мкм.
Фигу3 показано повторное представитель серии Drosophila тела грибов с 0-10 часов APF, меченных мембранно-целевой mCD8-GFP (зеленый). Скобки указывают на чашечке, то есть, дендритные проекции Мб. До метаморфоза, можно увидеть бегущую MB аксонов спинно-брюшном в толстые пачки, а также "туман" из флуоресцентного сигнала, возникающие из плотной дендритной беседка (кронштейн). Группа показывает мозги расчлененный на указанное время. Обратите внимание на сокращение дендритов в регионе свидетельствует квадратных скобках, например, что на 6-8 часов APF, дымка дендритных сигнал пошел (хотя аксонов сигнал не влияет). Мозги в панели B были вскрыты в 0 часов APF, перед внутренним экдизона шип (Трумэн и Riddiford, 2002), и бывший культурный естественных условиях, как указано. Они не показывают развития обрезка дендритов, а дендритные сигнал сохраняется в 10 часов НПФ. Чтобы обойти это, куколки отмечены в 0 часов APF, но расчлененные на 1,5 часа НПФ и культурно. Панельл C показывает, представитель серии этих грибов Drosophila органов от 0-10 APF часов. Как и в не-культурные образцы, дендритные сигнал не обнаруживается на 8 часов НПФ. Шкала бар составляет 20 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хронический генетических манипуляций структуру ткани и функции, в том числе мутаций и экспрессии трансгенов, как правило, производят сочетание непосредственного эффекта и позднего косвенные последствия, которые могут быть очень трудно отделить. В дополнение к генетической методы фармакологии может облегчить допрос время курс за фенотип. Например, это был мощный подход к рассекает вклады различных компонентов цитоскелета во время сперматогенеза у Drosophila 10. В данном примере, это позволило нам показать, что существует постоянная потребность в Cdk5 сохранить структуру АИС у дрозофилы. В других экспериментах мы также имели успех, используя препараты, цель других клеточных компонентов, включая протеинкиназы (иматиниб), полимеризации актина (цитохалазином, latrunculin и jasplakinolide) и микротрубочки (винбластин и таксол).
"> Экс методы естественных культуры также позволяет с высокой разрешающей анализ динамики процессов развития. Предыдущие исследования описаны краткосрочных живого изображения центрального мозга 11 или долгосрочной изображения других частей нервной системы, такие как 12 грудных ганглиев и сетчатки / оптические соединения доли 13. Здесь, в то время как мы сосредоточили свое внимание на анализ ткани иммунной основной материал, метод описан должно быть применимо к долгосрочным живого изображения центрального мозга. Например, правильная обрезка аксонов и дендритов в процессе развития тела гриба дрозофилы имеет важное значение для установления правильного соединения и иннервации закономерности в центральной нервной системе. Кроме того, отклонения в нейронной организации и реконструкции, как полагают, лежат в основе ряда нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, ALS и Паркинсона. Техника, описанная здесь, позволяет эмулировать в естественных условиях реконструкции нейритов в организме дрозофилы естественных бывший гриб, в культуре. Теперь мы можем изображение изменения в развитии в связи с генетическими изменениями, фармакологические методы лечения или изменения в окружающей среде.
Рисунок 1. Чрезмерное выражение Cdk5DN приводит к потере "ясно зоны актина и изменение границ FasII гамма-нейронов, тела гриба дрозофилы. Группа приведены три примера дикого мозга окрашивали актин-GFP (зеленый) и FasII (красный), а группа B приведены два примера голову над экспрессией Cdk5DN. Обратите внимание, что потери "ясно зоны актина (кронштейн) и переложить в FasII вентральной границы (горизонтальная белая линия) (B). Пунктирная линия (А) указывает положение тела гриба. Шкала бар составляет 20 мкм.
2 "/>
Рисунок 2. Лечение с помощью фармакологических Cdk5 ингибиторы росковитина и olomoucine имитирует Cdk5DN за выражение фенотипа в органах Drosophila грибов. Группа показывает две контрольные дикого мозга в то время как группа B показаны два препарата обработанные мозга, культивировали в течение 24 часов. Обратите внимание, что потери "ясно зоны актина (кронштейн), а также изменения в FasII границы (горизонтальная белая линия) (B). Шкала бар составляет 20 мкм.
Рисунок 3. В естественных условиях ремоделирования дендритов дендритов Drosophila гриб тело может быть резюмировал бывший естественных условиях. Группа показывает мозги расчлененным в то время указанных точках и окрашивали мембраной GFP (зеленый). Обратите внимание, исчезновение дендритных сигнала (диффузный, зеленый сигнал, подчеркнул кронштейн) по 8 часов НПФ. Группа B показывает, мозги расчлененный на 0 часов НПФ и культурный естественных бывший естественных для бывших раз указали. Эти мозги показать дендритов обрезка аналогичным тому, которое наблюдалось в естественных условиях (А). Шкала бар составляет 20 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить всех членов нашей лаборатории за их советы, полезные обсуждения и замечания по рукописи. Мы также хотели бы особенно хотел бы поблагодарить Марта Кох и Бассем Хасана за отличное предложение, что мы ждем до 1,5 часов APF до вскрытия мозг для культивирования в реконструкции экспериментов. Мы также благодарим объекта NHGRI изображений для использования их конфокальной микроскопии. Эта работа выполнена при финансовой поддержке программы Basic Neuroscience от NINDS Внутренние Программы исследований, NIH (Z01 NS003106).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider's Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | EMD Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
