Summary
Dit artikel beschrijft een werkwijze waarbij men kunnen nabootsen
Abstract
Wij beschrijven een werkwijze voor ex vivo kweken van Drosophila geheel hersenen. Dit kan gebruikt worden als een tegenhanger van chronische genetische manipulaties voor het onderzoeken van de celbiologie en de ontwikkeling van het centrum van hersenstructuren door toe te staan acute farmacologische interventies en live beeldvorming van cellulaire processen. Als voorbeeld van de techniek vóór werken ons laboratorium 1 is gebleken dat een eerder opgenomen subcellulair compartiment ligt tussen het axonale en somatodendritisch compartimenten axonen van Drosophila centrale hersenen. De ontwikkeling van dit compartiment, aangeduid als axon eerste segment (AIS) 2 is getoond genetisch afhankelijk van de neuron-specifieke cycline afhankelijke kinase, Cdk5. We laten hier zien dat ex vivo behandeling van wild-type Drosophila larven hersenen met de Cdk5-specifieke farmacologische remmers roscovitine en olomoucine 3 acute veranderingen in het actine organisatie veroorzaakt, enin de lokalisatie van de cel-oppervlakte-eiwit Fasciclin 2, dat de veranderingen gezien in mutanten die Cdk5 activiteit missen genetisch na te bootsen.
Een tweede voorbeeld van de ex vivo cultuur techniek is bedoeld voor herinrichting van de aansluitingen van de embryonale paddestoel lichaam (MB) gamma-neuronen tijdens metamorfose van larve tot volwassen. De paddestoel lichaam is het centrum van olfactorische leren en geheugen in de vlieg 4, en deze gamma-neuronen hun axonale en dendritische takken te snoeien tijdens de pop ontwikkeling en vervolgens weer uit te breiden takken op een later tijdstip bepaald aan de volwassen innervatie patroon 5 vast te stellen. Snoeien van deze neuronen van de MB is aangetoond gebeuren door plaatselijke degeneratie van neurite takken 6, door een mechanisme dat wordt geactiveerd door ecdyson een steroid hormoon, die op de ecdyson receptor B1 7 en is afhankelijk van de activiteit van de ubiquitine-proteasoom-systeem 6. Onze methode van ex vivo kweken kan be gebruikt om verder te ondervragen het mechanisme van ontwikkeling remodeling. We hebben gevonden dat in de ex vivo cultuur instelling gamma neuronen van de MB het proces van ontwikkeling snoeien samengevat een tijdsverloop vergelijkbaar met die in vivo. Het was echter van essentieel belang om tot 1,5 uur na puparium vorming wachten voordat explanteren van het weefsel, zodat de cellen onherstelbaar te zetten voor metamorfose, dissectie van dieren bij het begin van de verpopping leidde tot weinig of geen metamorfose in cultuur. Zo, met de juiste modificatie, kan de ex vivo cultuur aanpak worden toegepast om te studeren dynamische en steady-state aspecten van de centrale hersenen biologie.
Protocol
A. Bereiding van de Media
- Bereid complete media door filter-gesteriliseerd Schneider Drosophila media waaraan 10% foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine.
- De media moeten vers worden bereid per keer. Als alternatief kan een nieuwe hoeveelheid vooraf ingevroren media worden ontdooid voor elk gebruik.
- Voorafgaand aan kweken voeg 10 ug / ml insuline en 2 ug / ml ecdyson de media. Drugs werden bereid zoals geconcentreerde voorraden en ingevroren in kleine fracties. Ontdooide porties waren niet ingevroren.
- Alle werkoplossingen te handhaven op 25 ° C.
Het kweken van larven Brains
1. Selectie en dissectie van larvale Brains
- Voeg 500 ul van media op een 12 mm Millicell celkweek insert. De hersenen ontleed zal worden geplaatst in deze inserts gemakkelijk immunokleuring te vergemakkelijken.
- Voeg een kleine hoeveelheid bereid uit een ontleding horlogeglas.
- Uzingen een kleine spatel, pick-up zwerven derde instar larven en plaats ze in het horlogeglas. (We veronderstellen dat de ex vivo kweekmethode zou even goed van toepassing zijn op de eerste of tweede instar larven, maar we hebben dit niet getest.)
- Houd het achterste eind van de larve met een pincet voorzichtig het openstellen van de voorste einde met een tweede paar # 5 tang.
- Snel ontleden van de hersenen, het bijhouden van de ventrale zenuw koord intact.
2. Ex vivo kweken van Ontleed larven Brains
- Met behulp van pre-wet pipetpunten, zorgvuldig over te dragen van de hersenen in de cel cultuur van inserts, vooraf gevuld met media.
- Transfer hersenen, in media met een incubator bij 25 ° C tot de gewenste tijd-punt is bereikt. Deze methode werkt efficiënt voor maximaal 48 uur in de cultuur.
- Vervang de media op 8 uur. Buiten dat, vervang dan de helft van de media om de 5-6 uur.
3. Farmacologische manipulatie vanLarvale Brains
Deze methode van ex vivo kweken kan worden farmacologisch bevestigen genetische interacties eerder aangetoond in ons laboratorium 1.
- Voeg 100 uM roscovitine en 100 uM olomoucine aan geprepareerde media.
- Overdracht ontleed hersenen van deze media.
- Culture hersenen bij 25 ° C gedurende 24 uur.
- Vervang de media op 8 uur. Buiten dat, vervang dan de helft van de media (met medicijnen) om de 5-6 uur.
Het kweken van pop Brains
1. Selectie van Poppen voor Dissection
- Markeer witte poppen op flessen / flacons.
- Kies alleen poppen die helemaal wit. Poppen met enige vorm van kleuring dient niet te worden opgenomen.
- Deze fase is 0 uur Na puparium Vorming (APF).
- Deze poppen klaar voor dissectie zijn 1,5 uur na markering. Deze stap is cruciaal om ervoor te zorgen dat de ontwikkeling snoeien vindt plaats in ex vivo
2. Dissectie van Poppen
- Voeg 500 ul van media op een 12 mm Millicell celkweek insert. (De hersenen ontleed zal worden geplaatst in deze inserts gemakkelijk immunokleuring te vergemakkelijken).
- Als de gewenste tijd-punt is bereikt, toe een kleine hoeveelheid bereid uit een ontleding horlogeglas.
- Met behulp van een kleine, natte spatel, pick-up poppen die eerder gemarkeerd voor dissectie en plaats ze in het horlogeglas.
- Houd het achterste einde van de poppen met een pincet, voorzichtig open het voorste uiteinde van de pop geval een tweede paar # 5 tang.
- Snel ontleden van de hersenen, het bijhouden van de ventrale zenuw koord intact en de bijgevoegde.
3. Ex vivo kweken van Ontleed pop Brains
- Breng voorzichtig de hersenen in de cel cultuur van inserts, vooraf gevuld met media.
- Transfer hersenen, in media met een incubator bij 25 ° C tot de gewenste tijd-point bereikt. We gebruikten deze methode voor maximaal 10 uur in de cultuur voor de getoonde experiment, maar het kan worden uitgebreid tot een langere periode van observatie en behandeling, indien nodig.
- Voor tijdstippen langer dan 8 uur APF, vervang dan de media om de 5-6 uur.
Vanaf deze stap op, het protocol ongewijzigd blijft voor zowel de larven en poppen.
B. Bevestiging Ontleed Brains
- Nadat de gewenste tijd-punt is bereikt, verwijder media en voeg 500 pi 4% formaldehyde in 1x PBS met 0,5% Triton X-100 (PBST) gedurende 30 minuten vervangen verse formaldehyde na 15 minuten.
- Zorg ervoor dat niet toe te staan hersenen om te drogen bij het vervangen van media met een fixatief.
- Was formaldehyde met vier 10 minuten wasbeurten van 1x PBS met 0,5% TritonX-100 (PBST).
C. Kleuring Vaste Brains
- Na formaldehyde is gewassen, blokkeren hersenen gedurende 1 uur in een blokkeeroplossing van 1x PBS met 1% NormaalGeit Serum en 1% runds serum albumine.
- Voeg primaire antilichamen in blokkeeroplossing gemaakt.
- Incubeer hersenen overnacht bij 4 ° C.
- De volgende ochtend, wassen primaire antilichamen met vier 10 minuten wasbeurten van PBST.
- Voeg secundaire antilichamen in het blokkeren oplossing gemaakt.
- Laat bij kamertemperatuur gedurende 4 uur.
- Was secundaire antilichamen met vier 10 minuten wasbeurten van PBST.
D. Montage gefixeerd en gekleurd Brains voor Microscopie
- Equilibreer hersenen in Vectashield montage media voor 1 uur.
- Monteer hersenen op glasplaatjes met behulp van de Vectashield montage media.
- Plaats glas chips aan weerszijden van de hersenen bij montage van de dekglas. Dit voorkomt de hersenen van dat onderdrukt, terwijl monster dun genoeg alle beeldvlakken scannen met een confocale microscoop. Brains waren ruwweg gericht op de montage te vergemakkelijken het bekijken van de kenmerken van belang. Indien nodig,hersenen beelden waren gedraaid met Imaris software om een optimaal zicht voor de documentatie en de meting te verstrekken.
- Dicht dekglaasjes met duidelijke nagellak.
- Store glijdt weg van het licht.
E. representatieve resultaten
Figuur 1 toont een panel van derde larvale instar hersenen van (A) wild-type gemeten, en (B) vliegen een dominant-negatieve derivaat van Cdk5 (Cdk5DN) (Connell-Crowley et al., 2000). Drukken. Zowel express actine-GFP (groen) in MB gamma-neuronen. Zoals eerder beschreven (Trunova et al.., 2011), is er een regio in het proximale axonen van wild-type gamma-neuronen die niet op te hopen actine-GFP, dus weergegeven als een "clear zone" (A, beugel), en fasciclin 2 eiwit (rood) hoopt zich op in de axonen slechts tot de ventrale rand van deze zone (witte horizontale lijn). De stippellijn in het derde paneel van figuur 1 (A) geeft de positie van de MB markeren handelingin "clear zone" en de ventrale grens. In vliegen uiten Cdk5DN, de actine clear zone is afwezig (B) en Fasciclin 2 (FasII) immunoreactiviteit verspreidt dorsaal door middel van die regio. (Merk op dat de variabele aantal FasII-positieve axonen project horizontaal over de MB, deze niet relevant zijn voor het fenotype). Schaal balk vertegenwoordigt 20 urn.
Met deze methode van ex vivo kweken we wild-type vliegen behandeld met een combinatie van roscovitine en olomoucine, farmacologische remmers van Cdk5 activiteit. Figuur 2 toont een panel van derde larvale instar hersenen van controle (A) en met geneesmiddel behandelde (B ) wild-type vliegen. Net als bij vliegen expressie van een dominant negatieve Cdk5 constructie, de hersenen behandeld met Cdk5-remmers gedurende 24 uur, tonen de karakteristieke verlies van actine heldere zone en de verschuiving in FasII grens (vierkante haakjes). Witte lijnen tonen positie van wild-type FasII grens. Schaal balk vertegenwoordigt 20 urn.
Figure 3 toont een representatieve reeks van Drosophila mushroom bodies 0-10 uur APF, voorzien van membraan-gerichte mCD8-GFP (groen). Haakjes geven de kelk, dat wil zeggen de projecties van de dendritische MB. Voorafgaand aan de metamorfose, kan men zien MB axonen coursing dorso-ventraal in dikke bundels, evenals een 'waas' van fluorescerende signaal als gevolg van de dichte dendritische Arbor (beugel). Paneel A toont hersenen ontleed op de aangegeven tijd. Let op het snoeien van dendrieten in de regio wordt aangegeven door de haakjes, zoals dat door het 6-8 uur APF, de waas van dendritische signaal is weg (hoewel het axonale signaal wordt niet beïnvloed). Brains in panel B werden ontleed om 0 uur APF, voordat de interne ecdyson spike (Truman en Riddiford, 2002), en gekweekte ex vivo zoals aangegeven. Deze tonen geen ontwikkeling snoeien van dendrieten, maar veeleer de dendritische signaal blijft op 10 uur APF. Om dit te omzeilen, worden poppen gemarkeerd om 0 uur APF, maar ontleed in 1,5 uur APF en gekweekte. Paneell C toont een representatieve reeks van deze Drosophila mushroom bodies 0-10 uur APF. Zoals in de niet-gekweekte monsters wordt dendritische signaal niet aantoonbaar met 8 uur APF. Schaal balk vertegenwoordigt 20 urn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chronische genetische manipulaties van weefsel structuur en functie, met inbegrip van mutaties en de expressie van transgenen, meestal produceren een combinatie van directe effecten en late indirecte gevolgen dat kan heel moeilijk zijn te scheiden. Als aanvulling op genetische methoden met de farmacologie kan vergemakkelijken ondervraging van de tijd natuurlijk achter een fenotype. Zo is dit een krachtige aanpak voor het ontleden van de bijdragen van verschillende cytoskelet componenten tijdens de spermatogenese in Drosophila 10. In het huidige voorbeeld is het mogelijk om te tonen dat er een aanhoudende behoefte aan Cdk5 de structuur van de AIS in Drosophila handhaven. In andere experimenten hebben we ook succes gehad met drugs die zich richten op andere cellulaire componenten, zoals proteïne kinasen (imatinib), actine polymerisatie (cytochalasine, latrunculin en jasplakinolide) en microtubuli (vinblastine en taxol).
"> Ex vivo cultuur Eveneens is het mogelijk met een hoge resolutie analyse van de dynamiek van de ontwikkelingsprocessen. Eerdere studies hebben op korte termijn live-beeldvorming van de centrale hersenen 11, of langere termijn beeldvorming van andere delen van het zenuwstelsel beschreven, zoals de thoracale ganglia 12 en netvlies / optische lob verbindingen 13. hier, terwijl we ons gericht op de analyse van weefsel door immunokleuring van vaste materiaal, dient de methode die we beschrijven van toepassing zijn op de lange termijn live-beeldvorming van de centrale hersenen. bijvoorbeeld: snoeien van axonen en dendrieten tijdens de ontwikkeling van de Drosophila paddestoel lichaam is van essentieel belang voor het vaststellen van de juiste verbindingen en innervatie patronen in het centrale zenuwstelsel. Bovendien, afwijkingen in de neuronale organisatie en remodeling wordt gedacht aan verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder Alzheimer, ALS en Parkinson ten grondslag liggen. De hier beschreven techniek stelt ons in staat om na te streven in vivo herinrichting van neurieten in het Drosophila paddestoel lichaam ex vivo, in cultuur. We kunnen nu beeld veranderingen in de ontwikkeling naar aanleiding van genetische veranderingen, farmacologische behandelingen of veranderingen in de omgeving.
Figuur 1. Over-expressie van Cdk5DN veroorzaakt verlies van het actine 'clear zone' en een verschuiving in de FasII grens in gamma-neuronen van de Drosophila paddestoel lichaam. Paneel A toont drie voorbeelden van wild-type hersenen gekleurd actine-GFP (groen) en FasII (rood), terwijl Paneel B toont twee voorbeelden van hersenen overexpressie Cdk5DN. Gewezen op het verlies van het actine 'clear zone' (beugel) en verschuiven in de FasII ventrale grens (horizontale witte lijn) in (B). De stippellijn in (A) geeft de positie van de paddestoel lichaam. Schaal balk vertegenwoordigt 20 urn.
2 "/>
Figuur 2. Behandeling met de farmacologische Cdk5 remmers roscovitine en olomoucine bootst de Cdk5DN overexpressie fenotype in Drosophila mushroom bodies. Paneel A toont twee controle wild-type hersenen tijdens het paneel B toont twee drug-behandelde hersenen, gekweekt voor 24 uur. Gewezen op het verlies van het actine 'clear zone' (beugel) en de verschuiving in FasII grens (horizontale witte lijn) in (B). Schaal balk vertegenwoordigt 20 urn.
Figuur 3. In vivo herinrichting van dendrieten van de Drosophila paddestoel lichaam dendrieten kunnen worden samengevat ex vivo. Paneel A toont hersenen ontleed bij de aangegeven punten en gekleurd membraangebonden GFP (groen). Opmerking verdwijnen van dendritische signaal (diffuse, groene signaal, met als hoogtepunt beugel) door 8hr APF. Paneel B toont hersenen ontleed om 0 uur APF en beschaafde ex vivo ex vivo gedurende de aangegeven tijdsduren. Deze hersenen tonen dendriet snoeien vergelijkbaar met dat in vivo (A). Schaal balk vertegenwoordigt 20 urn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen alle leden van ons lab bedanken voor hun advies, nuttige discussies en commentaar op het manuscript. We zouden ook bijzonder graag Marta Koch en Bassem Hassan bedanken voor de uitstekende suggestie dat wij tot 1,5 uur APF wachten voordat het ontleden van hersenen voor het kweken van in remodeling experimenten. We danken ook de NHGRI imaging faciliteit voor het gebruik van hun confocale microscoop. Dit werk werd ondersteund door de basis Neuroscience Programma van de NINDS Intramurale Research Program, NIH (Z01 NS003106).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider's Drosophila Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (heat-inactivated) | Invitrogen | 10082-147 | 10% |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 1% |
| Insulin | Invitrogen | 12585-014 | 10μg/ml |
| Ecdysone | Sigma-Aldrich | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | Sigma-Aldrich | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | Sigma-Aldrich | O0886 | 100μM |
| Normal Goat Serum | Invitrogen | 50062Z | 1% |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | M9501 | 1% |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | D4551 | 4% |
| Triton-X 100 | Fisher Scientific | BP151 | 0.5% |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| Millicell Cell Culture Inserts | EMD Millipore | PI8P01250 | |
| Multidish, 4 well | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-548-5M |
References
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
