יציקה והדמיה של וריד שער מאוס או מערכת צינור מרת intrahepatic שרף 3-Dimensional

Summary

שיטה של ​​הדמיה וכימות המבנה 3-הממדי של וריד עכבר כבד פורטל או צינור מרת intrahepatic מתוארת. טכניקת יציקת שרף זה יכול להיות מיושם גם למערכות ductal או כלי דם אחרות ומאפשרת

Abstract

באיברים, הארכיטקטורה הנכונה של מבנים וסקולריים וductal היא הכרחית לתפקוד פיסיולוגי תקין, ואת ההיווצרות והתחזוקה של מבנים אלה היא תהליך מוסדר מאוד. הניתוח של מבנים אלה מורכבים, 3-ממדיים שתלוי במידה רבה בשתי הבדיקות 2-הממדיות בסעיף או על מחקרי הזרקת צבע. טכניקות אלה, עם זאת, אינן מסוגלות לספק ייצוג מלא וכימות של מבני ductal או כלי דם שנועדו להבהיר. לחלופין, את הטבע של יציקות שרף פלסטיק 3-ממדיות יוצר תמונת מצב קבועה של המערכת והוא רומן וטכניקה שימושית נרחב המאפשרים הדמיה וכימות מבנים 3-ממדיים ורשתות.

יתרון מכריע של מערכת יציקת השרף הוא היכולת לקבוע, המבנה השלם ומחובר, או תקשורת של כלי דם או דביקה. המבנה של כלי דם ודוקרשתות טל הן חיוניות לתפקוד איברים, וטכניקה זו יש את הפוטנציאל לסייע למחקר של רשתות כלי דם וductal בכמה דרכים. ליהוק שרף יכול לשמש כדי לנתח מורפולוגיה נורמלית ואדריכלות פונקציונלית של מבנה luminal, לזהות שינויים התפתחותיים המוךפו"גנטי, ולחשוף הבדלים מורפולוגיים באדריכלות רקמות בין מדינות נורמליות ומחלה. עבודה קודמת ניצלה שרף ליהוק ללמוד, למשל, פגמים ארכיטקטוניים ופונקציונליים במערכת עכבר מרת intrahepatic הדביקה שלא באים לידי ביטוי בניתוח 2-ממדי של ^1,2 המבנה, שינויים בכלי דם במוח של עכבר מודל מחלת אלצהיימר ³ , מומי וריד שער בעכברים עם יתר לחץ דם ופורטל צירוטיים ^4, שלבים התפתחותיים בהתבגרות הלימפה עכברוש בין ריאות לא בשלות ובוגרים ^5, שינויים מיידיים כלי דם בכבד החולדה, הלבלב והכליות בתגובה לפגיעה בחומר כימי^6.

כאן אנו מציגים שיטה ליצירת גבס שרף 3-ממדי של עכבר רשת כלי דם או ductal, מתמקד במיוחד בוריד השער וצינור מרת intrahepatic. יציקות אלו ניתן דמיינו ידי ניקוי או קצוץ את הרקמה ולאחר מכן ניתן לנתח אותו. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כמעט בכל מערכת כלי דם או ductal ויהיה ישים ישירות לכל מחקר אל התפתחות, תפקוד, תחזוקה, או פגיעתו של מבנה ductal או כלי דם 3-ממדי.

Protocol

1. הכן קנייה

1. לחמם עוד סעיף 1-inch של PE10 צינורות בקץ האצבעות ולמתוח אותו כך שהצינורות הופכים דקים.
   הערה: גודלו של כלי השיט או לצינור cannulated יהיה לקבוע את המידה נדרש מתיחה. הצינורית צריכה להיות מתוחה היטב לצינור המרה מטילה אך עשוי רק תידרש להיות מתוחים למדי כדי להתאים לוריד השער הגדול יותר.
2. לחתוך את הצינור נמתח באלכסון כדי ליצור קצה קטום.
3. חותך את הקצה השני של הצינור כדי ליצור קטע 5-6 סנטימטר.
4. הכנס מד 32, ½ סנטימטר מזרק לתוך הקצה שאינו המשופע של הצינורות.

2. הכן את המזרק עם PBS

1. מלא מזרק 3 מ"ל עם PBS.
2. הברג את המזרק על המזרק עם מצורף משך PE10 צינורות הכינו בעבר.
3. מזרק קפיצי ובוכנת מזרק דחיפה כדי להבטיח שPBS מלא את המחט והצינורית ואין בועות אוויר במזרק.
4. הנח את המזרק המוכן עם PBS לתוך מזרק בעל עצב מפלסטלינה. בעל זה יהיה לשמור את המזרק יציב תוך הצינורות מוכנסים לתוך הצינור.

3. אחר הגדרה

1. שוקל 0.1 גרם של זרז למכל קטן, לדוגמה, אחד טוב של צלחת 24 היטב.
2. משוך שרף 1 מ"ל למזרק 3 מ"ל.
   הערה: כמויות יחסיות של זרז ושרף יכולה להיות מותאמת לשינוי זמן ריפוי. הקטנת כמות זרז ייתכן, עם זאת, להגדיל להטיל התכווצות ולהוביל לשחקנים פחות רצויים.
   הערה: בעת טיפול בשרף, לנקוט אמצעי זהירות כדי להימנע ממגע עם שרף או שאיפה של אדי השרף. תמיד ללבוש כפפות ולבצע פעולות הקשורות שרף באזור מאוורר היטב, כגון מנדף כימי
3. לחתוך חתיכה של תפר 5.0 משי של כ 5 סנטימטרים שישמשו כחוט תלייה.

4. הכן עכבר

להקריב את העכבר בוגר. הנח את העכבר על הגב שלו ופותח את חלל הבטן.

הנח את העכבר על ביתור פלטפורמת היקף. מקם צינור 15 מיליליטר חרוטי ניצב מתחת לעכבר כדי להגדיל את החשיפה ונגישות לכבד.

הרטב מקלון צמר גפן עם PBS ולהשתמש בו כדי להפוך את הכבד כלפי מעלה והרחק ממך לחשוף את הנוף הגבה של הכבד יחד עם וריד שער extrahepatic או צינור מרה משותפת.

ליציקות וריד שער, אתה יכול למנוע את קרישת דם על ידי שטיפת הווריד עם טמפרטורת החדר PBS. צרף מחט למזרק 3 מ"ל מלא PBS ולהכניס מחט לתוך וריד פורטל extrahepatic כרחוק מכבד שאתה יכול. דחף בעדינות דרך PBS לתוך וריד הפורטל. הפוך ניק בוריד הקרדינל המשותף לניקוז דם. השתמש במטלית כותנה רטובה לעיסוי כבד, משפר את ניקוז דם. צעד זה אינו מומלץ לצינור המרה וייתכן שלא יהיה צורך בכל המערכות של כלי הדם.
הערה: שלב זה יכול להיות גם performed עם paraformaldehyde 4% במקום PBS. שימוש בparaformaldehyde 4% עלול להגדיל יושרה ותוצאת כלי דם בגבס מדויק יותר, במיוחד של מבנים וסקולריים קטנים יותר.

5. Cannulate וריד פורטל extrahepatic או צינור מרה משותפת

1. השתמש במלקחיים מעוקלים לעבור קשירת התפר כירורגית מתחת לוריד השער או צינור מרה, כ ¼ אינץ מהכבד.
2. קושר בחוט לפקעת משותפת רופפת. אל תהדקו את הקשר.
3. אם אתה עובד עם מערכת פתוחה, זה עשוי להיות מועיל כדי לקשור ולהדק את קשירה בקצה השני של המערכה. אם פתחת וריד הקרדינל המשותף כדי לנקז את הדם מוריד השער, לקשור חוט תלייה סביבו כדי להגביר את הלחץ בתוך וריד השער ולמנוע דליפת שרף לתוך וריד הבדיה המרכזית.
4. השתמש במספריים באביב כדי לעשות חתך קטן בוריד השער או צינור מרה, כ ¼ סנטימטר מתחת לקשר התפר. זה מ"קלא צריך לחדור לא יותר ממחצית קוטרו של וריד השער או צינור מרה.
5. שימוש # 5 מלקחיים, להחזיק את וריד השער או צינור מרה באתר של החתך והכנס קצה מעוגל של הצינור לצינור המרה.
6. Push קצה צינור עבר הקשירה מראש, אילם וכיוון הכבד.
7. מבחן לדיוק cannulation ידי הזרקת PBS דרך הצינורית וצופה כדי לראות אם הוא נכנס לוריד שער או צינור מרה.
8. הדק את הקשירה להחזיק את הצינורית במקום.

6. שרף יצוק וריד השער או צינור מרת intrahepatic

1. הוסף שרף מדוד מראש 1 מ"ל לזרז מדוד מראש 0.1 g ומערבב היטב. הימנע מיצירת בועות אוויר.
2. צייר תערובת שרף זרז בחזרה לתוך מזרק 3 המ"ל. הסר את כל בועות אוויר על ידי מצליף בעדינות את המזרק וגירוש בועות.
   הערה: ליציקת מבנים קטנים, זה עשוי להיות מועיל כדי להשתמש בתא ואקום כדי להסיר בועות אוויר קטנות מאוד מהשרף הדואר ולשפר את איכות שחקנים. כדי לאפשר לזמן כדי לבצע שלב זה, יהיה צורך להקטין את יחס הזרז / שרף מזה שהוצע לעיל כדי להאט ריפוי שרף.
3. זהירות להחליף מזרק המכיל PBS עם מזרק המכיל שרף, ומשאיר את מחט המד 32 המצורפות לצינורית.
4. לאט ובעדינות לדחוף שרף לתוך וריד הפורטל או צינור מרה עד מגדיל את ההתנגדות וכבד מלא.
5. השתמש במטלית כותנה רטובה בעדינות לעסות את הכבד ומעודד גם מילוי.
6. הסרת צינורית מהמבנה ובמהירות הדקה מחדש הקשירה כדי למנוע דליפת שרף.
7. אפשר עכבר כדי שכב בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות ואילו את התרופות של השרף, ולאחר מכן להסיר כבד.
8. המשך בניקוי או קצוץ את הכבד.

7. כבד ברור להדמיה באתר

1. תקן את הכבד בparaformaldehyde הלילה 4% ב 4 ° C, נדנדה.
2. שטוף את הכבדב PBS במשך לפחות 4 שעות, נדנדה. בשלב זה, אתה יכול להפריד את האונה של הכבד אם רוצה.
3. לייבש במתנול 50% ולאחר מכן במתנול 100% לפחות 4 שעות כל אחד, מתנדנד בטמפרטורת חדר.
4. נקה את הכבד ב01:02 פתרון של נזיל אלכוהול ונזיל בנזואט (באב) במשך לפחות 24 שעות, נדנדה. פעמים יותר לשטוף עשויות להיות נחוצות. אם הכבד אינו ברור לחלוטין לאחר 2-3 ימים, לחזור למתנול 100% עבור 24 שעות ולחזור באב סליקה.
5. כבד להציף באב בצלחת פטרי זכוכית להדמיה באתר.

8. מסמס רקמת כבד

1. הסר כבד מעכבר והכניס לתוך צינור חרוטים 50 מ"ל עם מים. חכה 1 שעה לריפוי מלא שרף. אונה של כבד נפרדת אם תרצה בכך.
2. יוצק את המים ולהעביר את הכבד לבקבוק זכוכית. לצלול ב15% KOH. השאר למשך הלילה בטמפרטורת חדר. לא רוק.
3. זהירות לשפוך את KOH ולשטוף גבס במים מזוקקים. הערה: הגבס הוא verצריך להיות מטופל y שביר ובקפידה רבים. למנוע שיבוש הגבס כאשר הוספה או סר של נוזל מהצינור.
4. כשגבס שרף הוא נקי, בעדינות שכב על Kimwipe להתייבש, ולאחר מכן להעביר למכל לאחסון.

9. נציג תוצאות

צוות שחקנים מוצלח של וריד השער או צינור מרה יציג רשת רציפה של סניפים קטנים יותר בהדרגת ההארכה hilum לפריפרית הכבד.

האיור 1 מציג וריד שער לוהק דמיינו באתר לאחר אב סליקה. איור 1 א מציג את השחקנים של אונת הכבד השמאלית וכל צורה והגודל של השחקנים. 1B האיור מציג תצוגה מקרוב של אותו הגוון, הוכחה חדירה של השרף לענפי וריד השער הקטנים בפריפריה בכבד.

איור 2 מראה יצוק וריד שער שעבר KOH MAceration 2A. איור מציג את כל האונה השמאלית בכבד ובאיור 2B היא תקריב של סניפי הפריפריה הקטנים.

טכניקה זו גם יושמה בהצלחה לצינור מרת intrahepatic ופרסמה באמצעות שני טכניקות אב שריית Koh ^1,2,7 והסליקה.

בעיות נפוצות כוללות שלמות מילויים, בועות בשרף, וגלישה למערכות או רקמות הסובבות. איור 3 מדגימות כיצד לזהות מילוי שלם (איור 3 א), בועות (איור 3 א), והצפה של שרף מוריד הפורטל הווריד מרכזי (איור 3 ב ').

כל התמונות צולמה באמצעות סטריאוסקופ יקה MZ 16 FA וQImaging מצלמת 4000R RETIGA.

איור 1 גבס. אב פינה שרף של כבד השאיר וריד שער אונה. יציקת שרף א מראה מבנה היררכי מסתעף מהארכה hilum לפריפרית הכבד. יציקת שרף מופיעה בצבע צהוב בתוך אונת כבד צבוע כחול. ב מקרוב מראה כי מילוי שרף משתרע על סניפים קטנים בפריפריה בכבד. שרף הוא בנבן דרך כבד נוקה. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ.

איור 2. גבס רקמות-רוככו שרף של כבד השאיר וריד שער אונה. שרף א יצוק מאונת כבד שלמה מראה לו סניפים רבים בגדלים שונים. ב מקרוב מראה סניפים קטנים בפריפריה של כבד. ריכוך מראה של סניפים קטנים מייצג שרף מילוי חללי סינוסי ועשוי או לא עשוי להיות גלוי על שרף מטיל ויגדיל את צפיפות הסניף לכאורה אם הוא קיים. שרף הוא בצבע לבן. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ.

fo: לשמור-together.within עמודים = "תמיד">
איור 3. בעיות נפוצות ביציקות שרף. א מילוי חלקי של וריד שער האונה השמאלי הוא לכאורה על ידי חלק או את כל סניפים יצוקים הכושלים להארכה לפריפרית הכבד. גבס זו מציג גם בועות, גלוי כמו הפסקות ביציקה הרציפה (חץ). ב בשל הקרבה של וריד שער וריד מרכזיים וסניפים במקומות מסוימים, שרף וריד השער לעתים קרובות להיכנס ולמלא את הווריד המרכזי. זה יכול להיות מוכר כאשר יש שני ענפים נפרדים hilar (חיצים) ושני מבני הסתעפות כי יש דפוסים וחפיפה שונים. אפליה בין טעויות טכניות ושינויים מורפולוגיים אמיתיים יכולה להתבצע בשתי דרכים. ראשית, המבנה היצוק יש להשוות למבנה הצפוי מבוסס על ניתוח 2-ממדי או בשיטות אחרות. שנית, חשוב לבצע מספר חזרות, וכאשר דבר אפשרי, לכמת את structיור ולבצע ניתוח סטטיסטי כדי לקבוע שחזור ואם יש שינוי מורפולוגי משמעותי מבחינה סטטיסטית בין ובתוך ניסיוניים שונים ובקרת נשק.

Discussion

כבר תארנו דוגמאות ספציפיות לאיך וריד שער ומערכות צינור מרת intrahepatic של הכבד יכולים להיות יצוקים, אך טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על כמעט כל מערכת ductal או כלי דם אחרת בעיבודים קלים. עבודה קודמת הוכיחה את ההיתכנות של טכניקה זו במינים רבים, כולל עכבר ^1,2,7-9, הברווזון ^{10,11, 12,13} ארנב, כלב ^14, ו ^15, וחזיר באיברים רבים, כולל בלוטת אף ^14, לב ^{16, 12,13} שלפוחית ​​שתן, כבד ^ו1,2,7,8. יציקות אלו יכולים לשמש להשוואת מערכות מרובות (לדוגמה, וריד השער וצינור מרה) בתוך אותה הרקמה, באותו מבנה על פני שלבים שונים בהתפתחות ^5, או השפעה על מבנה של שינויים או השפעות ^1-4 גנטיים או סביבתיים ^{, 6,7.} היישום הרחב של שיטה זו על פני מינים ואיברים הופך שרף ליהוק כלי חשוב מאוד עבור studying המורפולוגיה של מבנים וסקולריים וductal ויש פוטנציאל להגדיל את הידע שלנו על התפקוד התקין של מבנים אלה, כמו גם כיצד הם מושפעים, או כיצד הם משפיעים על איברים רבים, במודלים של מחלות בבעלי חיים.

השימוש בשרף ליצירת יציקות 3-ממדיות מספק תמונת מצב קבועה של מערכת ductal או כלי דם ויש לו מספר יתרונות על פני שיטות דומות. ראשית, השחקנים יכולים להיות מנותחים כמבנה עצמאי לאחר שרייה, מציעים יתרון על פני הודו דיו או זריקות דיו דומות. שנית, הקביעות של המבנה מגדילה את הקלות של ניתוח. אחרון, היכולת של שרף Mercox השני לעמוד בהליך סליקת אב מאפשרת יכולת ייחודית כדי לחזות מבנה באתרו גם בתוך רקמות גדולות או צפופות.

ישנם מספר סוגים של שרף זמין עם מאפיינים שונים. Mercox השני נבחר לטכניקה זו לעו"ד הרבantages; Mercox II יש צמיגות נמוכה, המאפשר לה לחדור וריד קטן היקפי פורטל וסניפי צינור מרה, יש לו ריפוי מהיר ומלא בטמפרטורת חדר, חיוני לניתוח היצוק עצמאי רוככו, יש הצטמקות מינימאלית כאשר נרפא, וזה עומד סליקת רקמת אב. סוג נוסף של שרף, Microfil (Flowtech, קארבר, MA), נעשה שימוש במספר מחקרים שפורסמו ^8,9,15. יחסית, Microfil לא לרפא לחלוטין בטמפרטורת חדר, והוא טוב ביותר דמיין דרך סליקת רקמות. Microfil מטיל של וריד השער בעבר נתח באמצעות קיבוע 10% פורמלין וסליקה שלאחר מכן עם סליצילט ethanolmethyl ^8.

תוספי שרף יכולים לספק שיטות נוספות של הדמית גבס; תוספת של צבעים צבעוניים, מולקולות ניאון, או microspheres יכול לשפר את הניתוח. שיקול חייב להילקח, עם זאת, כדי להבטיח שמולקולות הצבע שנבחרו הם קטנים מספיק כדי לחדור inteמבנה nded כלי דם או ductal, שהם לא משמעותיים לשנות את המאפיינים של השרף, שהם מסוגלים לעמוד או סליקת רקמה או שרייה, וכי הם תואמים את השיטה הרצויה של ניתוח. בחירת תוספי שרף יהיה תלוי במידה רבה ביישום המסוים: למשל, microspheres (בדיקות מולקולריות) הם גדול מדי כדי לעבור את sinusoids הכבד, מה שהופך אותם מתאימים ללימודי ארכיטקטורת סינוסי נורמלית אבל כלי מושלם כדי לחקור את ההתפתחות של shunts portosystemic , שהם גדולים מספיק כדי להכיל microspheres, במודל של עכברים שעבר מוטציה גנטית ^8.

לבסוף, ניתוח יציקת שרף יכול להתבצע ביציקות מזכה או רוככו. אב פינה-יציקות שימושיות למדוד את המבנה של מערכת שהיא מתייחסת לאיבר שבו היא נמצאת. יציקות KOH-רוככו ניתן לנתח במספר דרכים. מחקרים קודמים השתמשו במיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM) כדי להמחיש רשתות זרימת דם ומבנה כלי ^12,13,17. יציקות גם ניתן לכמת למספר סניף, קוטר והנפח בשימוש בmicrocomputed טומוגרפיה (microCT) ^{1,15,18, 19,20.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PE10 polyethylene tubing	Fisher Scientific	1417012P
5-0 surgical black braided silk	Roboz Surgical	SUT-15-1
Steriject 32 G x 13 mm needle	Air-tite	TSK3213
Spring scissors	Fine Science Tools	15000-08
Number 5 forceps	Fine Science Tools	91150-20
Mercox II kit	Ladd Research	21247
Benzyl alcohol	Fisher Scientific	1816-04	Only required for BABB-clearing
Benzyl benzoate	MP Biomedicals, LLC	154839	Only required for BABB-clearing
Phosphate-buffered saline (PBS)
Modeling clay
Scale
Laboratory scissors
15 ml cap polypropylene tubes
4% paraformaldahyde
15% potassium hydroxide (KOH)			Only required for maceration
Razor blade
100% methanol
3 ml luer lock syringe