3-dimensionelt Resin Støbning og Imaging of Mouse Portal Vein eller Intrahepatisk galdegang System

Summary

En fremgangsmåde til visualisering og kvantificering af 3-dimensionale struktur af muse portårevenen eller intrahepatisk galdegang er beskrevet. Denne harpiks støbt teknik kan også anvendes på andre duktale eller vaskulære systemer og muliggør

Abstract

I organer, er den korrekte arkitektur af vaskulære og ductal strukturer uundværlig for korrekt fysiologisk funktion, og dannelsen og vedligeholdelsen af ​​disse strukturer er en stærkt reguleret proces. Analysen af ​​disse komplekse, tre-dimensionelle strukturer er i høj grad afhængig af enten 2-dimensional behandling i snit eller på farvning injektion undersøgelser. Disse teknikker er imidlertid ikke i stand til at give et komplet og kvantificerbar repræsentation af de duktale eller vaskulære strukturer de skal belyse. Alternativt arten af ​​3-dimensionale plastharpiks afstøbninger frembringer en permanent øjebliksbillede af systemet og er et hidtil ukendt og meget nyttig teknik til visualisering og kvantificering af 3-dimensionelle strukturer og netværk.

En afgørende fordel ved harpiksens støbning systemet er evnen til at bestemme den intakte og forbundet, eller kommunikere, strukturen af ​​et blodkar eller kanal. Strukturen af ​​vaskulære og duclæggende net er afgørende for organfunktion, og denne teknik har potentiale til at støtte undersøgelse af vaskulære og ductal net på flere måder. Harpiks støbning kan anvendes til at analysere normal morfologi og funktionelle arkitektur af en luminal struktur, identificere udviklingsmæssige morfogenetiske ændringer og afdække morfologiske forskelle i vævsarkitektur mellem normale og sygdomstilstande. Tidligere arbejde har udnyttet harpiks støbning for at studere, for eksempel, arkitektoniske og funktionelle defekter i mus intrahepatisk galde kanalsystem, som ikke var afspejlet i 2-dimensional analyse af strukturen ^1,2, ændringer i hjernen vaskulaturen af en Alzheimers sygdom musemodel ³ , vena abnormiteter i portal hypertensive og cirrotiske mus ^4, udviklingsmæssige skridt i rotte lymfatisk modning mellem umodne og voksne lunger ^5, umiddelbare mikrovaskulære ændringer i rotte lever, bugspytkirtel og nyre som respons på til kemisk skade^6.

Her præsenterer vi en metode til at generere en 3-dimensionel harpiks støbt af en mus vaskulær eller ductal netværk, der fokuserer specifikt på portalen vene og intrahepatisk galdegang. Disse afstøbninger kan visualiseres ved at fjerne eller udblødning af væv og kan derefter analyseres. Denne teknik kan anvendes til stort set alle vaskulære eller gangsystemet og ville være direkte anvendelse på enhver undersøgelse spørgende i udvikling, funktion, vedligeholdelse eller skade af en 3-dimensionel ductal eller vaskulær struktur.

Protocol

1. Forbered Kanyle

1. Varm en 1-tommer lang sektion af PE10 slange med fingerspidserne og strække det, så slangen bliver tynd.
   Bemærk: størrelsen af karret eller kanalen, der skal kanyle, vil bestemme graden af strækning kræves. Kanylen skal være godt strakt til galdegang kaster, men kan kun være forpligtet til at være moderat strakt til at passe i større portal vene.
2. Skær det strakte rør i en diagonal til at generere en affaset spids.
3. Skær den anden kant af slangen for at skabe en 5-6 cm segment.
4. Sæt en 32 gauge, ½ inch nålen ind i den ikke-skrå kant af røret.

2. Forbered Sprøjte med PBS

1. Fyld en 3 ml sprøjte med PBS.
2. Skru sprøjten på kanylen med vedhæftede trukket PE10 slange tidligere fremstillede.
3. Flick sprøjte og tryk sprøjtestemplet for at sikre, at PBS har fyldt nålen og slange ogder ikke er nogen luftbobler i sprøjten.
4. Placer den klargjorte sprøjte med PBS i en sprøjte-indehaver formet ud af modellervoks. Denne holder vil holde sprøjten stille, mens slangen er indsat i kanalen.

3. Andre Set-up

1. Afvej 0,1 g katalysator i en beholder, fx en brønd i en plade med 24 brønde.
2. Trækkes 1 ml harpiks i en 3 ml sprøjte.
   Bemærk: relative mængder af katalysator og harpiks kan justeres til at ændre hærdetid. Faldende mængde katalysator kan dog øge støbt krympning og fører til en mindre ønskelig støbt.
   Bemærk: ved håndtering harpiks, tage forholdsregler for at undgå kontakt med harpiks eller indånding af harpiksen dampe. Brug altid handsker og udføre trin, der involverer harpiks i et godt ventileret område, såsom en kemisk stinkskab
3. Skære et stykke af 5,0 silkesutur på cirka 5 inches til anvendelse som en ligatur.

4. Forbered Mouse

Sacrifice voksen mus. Lægge musen på ryggen og åbne bughulen.

Lægge musen dissektionsmikroskop platform. Placer en 15 ml konisk rør vinkelret under musen for at øge synligheden og adgang til leveren.

Fugt en vatpind med PBS og bruge det til at vende leveren opad og væk fra dig for at eksponere den dorsale billede af leveren sammen med ekstrahepatisk portvenen eller fælles galdegang.

For vena casts, kan du forhindre blodpropper ved at skylle venen med stuetemperatur PBS. Sæt en nål til en 3 ml sprøjte fyldt med PBS og indsæt nålen ind i ekstrahepatisk portal vene så langt fra leveren som du kan. Skub forsigtigt PBS igennem i portalen vene. Lav et nick i den fælles kardinal vene at dræne blod. Brug en våd vatpind til massage leveren, forbedre blod afløb. Dette trin anbefales ikke til galdegang og er ikke nødvendigt for alle vaskulære systemer.
Bemærk: Dette trin kan også være PerfoRMED med 4% paraformaldehyd i stedet for PBS. Anvendelse af 4% paraformaldehyd kan øge vaskulær integritet og føre til en mere præcis støbt, specielt for mindre karstrukturer.

5. Kanyle Ekstrahepatisk Portal vene eller fælles galdegang

1. Anvende buede pincet til at passere den kirurgiske sutur ligatur under portåren eller galdegang, ca ¼ inch fra leveren.
2. Bind suturen ind i en løs fælles knude. Spænd ikke knuden.
3. Hvis du arbejder med en åben system, kan det være nyttigt at binde og stramme en ligatur i den anden ende af systemet. Hvis du har åbnet den fælles kardinal vene at dræne blodet fra portalen vene, binde en ligatur omkring det at øge presset på portalen vene og forhindre harpiks lækage ind i den centrale hepatisk vene.
4. Brug foråret saks til at lave et lille snit i vena eller galdegang, ca ¼ tomme under suturen knude. Denne cut skulle trænge ikke mere end halvvejs gennem diameter af portalen vene eller galdegang.
5. Anvendelse af # 5 pincet, holde portåren eller galdegang på stedet for snittet og indsætte skrå ende af slangen i galdegang.
6. Skubbe spidsen af ​​røret forbi den før-bundne ligatur og mod leveren.
7. Test for kanylering nøjagtighed ved at injicere PBS gennem kanylen og ser at se, om det kommer ind i portalen vene eller galdegang.
8. Spænd ligatur for at holde kanylen på plads.

6. Resin Cast portvenen eller Intrahepatisk galdegang

1. Tilføj forhånd afmålt 1 ml harpiks på forhånd afmålt 0,1 g katalysator og blandes. Undgå at frembringe luftbobler.
2. Trækker harpiks-katalysatorblanding tilbage i 3 ml sprøjte. Fjern eventuelle luftbobler ved forsigtigt at zappe sprøjten og udvisning bobler.
   Bemærk: til støbning af små strukturer, kan det være nyttigt at anvende et vakuumkammer for at fjerne meget små luftbobler fra the harpiks og forbedre støbt kvalitet. At tillade tid til at udføre dette trin, vil det være nødvendigt at nedsætte katalysatoren / resin-forholdet fra det foreslået ovenfor, for at bremse resin hærdning.
3. Forsigtigt PBS-holdig sprøjte med harpiks-indeholdende sprøjte, hvilket efterlader de 32 gauge nål fastgjort til kanylen.
4. Langsomt og forsigtigt skubbe harpiks i portalen vene eller galdegang indtil modstanden stiger og lever er fyldt.
5. Brug våd vatpind til forsigtigt at massere leveren og tilskynde en endnu fyld.
6. Fjern kanylen fra strukturen og hurtigt stram ligatur at forhindre harpiks lækage.
7. Tillad musen til at ligge fladt ved stuetemperatur i 20 minutter, mens harpiksen hærder, derefter fjerne leveren.
8. Fortsæt med enten clearing eller udblødning leveren.

7. Clear Lever for Visualisering in situ

1. Fix leveren i 4% paraformaldehyd natten over ved 4 ° C, rocking.
2. Vask levereni PBS i mindst fire timer, vuggende. På dette punkt kan du adskille leveren lapper, hvis det ønskes.
3. Dehydrerer i 50% methanol og derefter i 100% methanol i mindst fire timer hver, rokkende ved stuetemperatur.
4. Fjerne leveren i en 1:2 opløsning af benzylalkohol og benzylbenzoat (Babb) i mindst 24 timer, rocking. Længere vask tider kan være nødvendige. Hvis leveren ikke forsvinder helt efter 2-3 dage, flytte tilbage til 100% methanol i 24 timer og gentag Babb clearing.
5. Nedsænkes lever i Babb i et glas petriskål til billeddannelse in situ.

8. Opblødes levervæv

1. Fjerne leveren fra mus og anbragt i en 50 ml konisk rør med vand. Vent 1 time til fuldstændig resin hærdning. Separate lever lapper om ønsket.
2. Hæld vand og flytte leveren til en glasflaske. Nedsænkes i 15% KOH. Forlade natten over ved stuetemperatur. Må ikke rock.
3. Hæld forsigtigt off KOH og vask støbt i destilleret vand. Bemærk: de medvirkende er very skrøbelig og skal behandles med største omhu. At forstyrre den støbte ved at tilføje eller fjerne fluidum fra røret.
4. Når harpiks cast er ren, blidt lægge på en Kimwipe at tørre, derefter overføre til en beholder, der skal lagres.

9. Repræsentative resultater

En vellykket støbt af portåren eller galdegang viser et kontinuerligt net af gradvis mindre grene strækker sig fra hilum til leveren periferi.

Figur 1 viser et portåren støbt som visualiseret in situ efter Babb clearing. Figur 1A viser støbt af hele venstre liver lobe og formen og størrelsen af afstøbningen. Figur 1B viser et nærbillede af den samme stemmer, der viser penetration af harpiksen ind i de mindste vena grene på leveren periferi.

Figur 2 viser et vena cast, der har undergået KOH maindvolde. Figur 2A viser hele venstre liver lobe og figur 2B er et nærbillede af de små perifere grene.

Denne teknik er også blevet anvendt med succes til intrahepatisk galdegang og offentliggjort via både Babb clearing og Koh maceration teknikker ^1,2,7.

Almindelige problemer omfatter ufuldstændig udfyldning, bobler i harpiksen, og overløb til omgivende systemer eller væv. Figur 3 viser, hvordan man kan genkende en ufuldstændig fyldning (figur 3A), bobler (figur 3A), og et overløb af harpiks fra vena til central vene (figur 3B).

Alle billeder er taget med et Leica MZ 16 FA stereoskop og QImaging RETIGA 4000R kamera.

Figur 1. Babb-ryddet harpiks støbt af hepatisk venstre lap portal vene. A. Resin støbt viser en hierarkisk forgrening, der strækker sig fra hilum til leveren periferi. Resin støbt vises i gul farve i blå-tonet lever lap. B. En tæt op viser, at harpiks fyld omfatter små grene i leveren periferien. Harpiks er hvidlig gennem ryddet leveren. Scale bar = 1 mm.

Figur 2. Tissue-opblødt harpiks støbt af hepatisk venstre lap portal vene. A. Resin støbt af hele leveren lap viser mange grene af varierende størrelser. B. Close-up viser mindre filialer i periferien af ​​leveren. Udtynding fremkomsten af ​​små grene repræsenterer harpiks fyldning af sinusformede rum og måske eller måske ikke være synlige på harpiks kaster og vil øge den tilsyneladende gren tæthed hvis det findes. Resin er hvid i farven. Scale bar = 1 mm.

Figur 3. Almindelige problemer med harpiks afstøbninger. A. Et ufuldstændigt fyld af venstre lap portvenen fremgår af nogle eller alle støbte grene undlader at udvide til leveren periferien. Dette stemmer viser også bobler, synlig som brud i strengstøbt (pil). B. På grund af nærhed af portalen vene og central vene grene i nogle steder, vil portalen vene harpiks ofte ind og fylde central vene. Dette kan indregnes, når der er to forskellige hilar grene (pile) og to filialer strukturer, der har forskellige mønstre og overlapning. Diskrimination mellem tekniske fejl og sande morfologiske ændringer kan gøres på to måder. For det første bør den støbte struktur sammenlignet med strukturen forventet baseret på 2-dimensional analyse eller andre metoder. For det andet er det vigtigt at udføre flere gentagelser, og når det er muligt, kvantificere structure og statistisk analyse for at bestemme reproducerbarheden og hvis der er en statistisk signifikant morfologisk ændring mellem og inden for forskellige eksperimentelle og kontrolgrupperne.

Discussion

Vi har beskrevet specifikke eksempler på, hvordan portvenen og intrahepatiske galdegangsceller systemer i leveren kan støbes, men denne teknik kan anvendes på praktisk talt alle andre ductal eller vaskulære system med små justeringer. Tidligere arbejde har påvist gennemførligheden af denne teknik i flere arter, herunder mus ^1,2,7-9, ælling ^10,11, kanin ^12,13, hund ¹⁴ og svin ^15, og i mange organer, herunder nasal kirtel ^14, hjertet ^16, blære ^12,13, og lever ^1,2,7,8. Disse afstøbninger kan anvendes til at sammenligne flere forskellige systemer (f.eks portvenen og galdegang) i det samme væv, den samme struktur på tværs af forskellige udviklingsstadier ^5, eller virkningen på en struktur af genetiske eller miljømæssige ændringer eller påvirkninger ^{1-4 , 6,7.} Den brede anvendelse af denne teknik på tværs af arter og organer gør harpiks støbning et meget værdifuldt redskab til studying morfologi vaskulære og ductal strukturer og har potentiale til i høj grad øge vores viden om den normale funktion af disse strukturer samt hvordan de påvirkes, eller hvordan de påvirker et organ, i dyremodeller.

Anvendelsen af ​​harpiks til at skabe 3-dimensionelle casts tilvejebringer et permanent billede af en ductal eller vaskulære system og har flere fordele i forhold til lignende teknikker. Først kan de medvirkende analyseres som en stand-alone struktur efter maceration, der tilbyder en fordel i forhold tusch eller lignende blæk injektioner. For det andet, permanens strukturen forøger analyseformål. Endelig evne til MercOx II harpiksen til at modstå Babb clearing procedure muliggør en enestående evne til at visualisere en struktur in situ selv i store eller tætte væv.

Der findes flere typer af harpiks fås med forskellige karakteristika. MercOx II er blevet valgt til denne teknik til dens mange advantages, MercOx II har en lav viskositet, så den kan trænge små perifer portvenen og galdegang grene, har hurtig og fuldstændig hærdning ved stuetemperatur, vigtigt at analysere enkeltstående macererede stemmer, har minimal krympning ved hærdning, og det modstår Babb væv clearing. En anden type harpiks, Microfil (Flowtech, Carver, MA), er blevet anvendt i adskillige publicerede undersøgelser ^8,9,15. Forholdsvis, er Microfil ikke helbrede fuldstændigt ved stuetemperatur og er bedst visualiseret gennem væv clearing. Microfil afstøbninger af portalen vene har tidligere været analyseret gennem 10% formalin fiksering og efterfølgende clearing med ethanolmethyl salicylat ^8.

Resin tilsætningsstoffer kan give yderligere metoder til støbt visualisering, tilsætning af farvede farvestoffer, fluorescerende molekyler, eller mikrokugler kan forbedre analysen. Der skal imidlertid være omhyggelig for at sikre, at farven valgte molekyler er tilstrækkeligt små til at penetrere intended vaskulær eller ductal struktur, at de ikke væsentligt ændrer egenskaberne af harpiksen, at de kan modstå enten tissue clearing eller udblødning, og at de er forenelige med den ønskede analysemetode. Valg af harpiks additiver vil især afhænge af den specifikke anvendelse: for eksempel er mikrosfærer (Molecular Probes) for store til at passere gennem de hepatiske sinusoider, hvilket gør dem uegnede til undersøgelse af normale sinusformede arkitektur, men et perfekt værktøj til at undersøge udviklingen af ​​portosystemisk shunts , som er store nok til at rumme mikrosfærer, i en genetisk ændret musemodel ^8.

Endelig kan harpiks støbt analyse foretages i enten cleares eller udblødt afstøbninger. Babb-ryddet casts er nyttige til måling af strukturen af ​​et system som den vedrører det organ, hvor det befinder sig. KOH-macererede casts kan analyseres på flere måder. Tidligere undersøgelser har anvendt scanningselektronmikroskopi (SEM) for at visualisere mikrocirkulationen netværk og fartøjets struktur ^12,13,17. Afstøbninger kan også kvantificeres for filial nummer, diameter og volumen med brug af MikroCT tomografi (microCT) ^{1,15,18, 19,20.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PE10 polyethylene tubing	Fisher Scientific	1417012P
5-0 surgical black braided silk	Roboz Surgical	SUT-15-1
Steriject 32 G x 13 mm needle	Air-tite	TSK3213
Spring scissors	Fine Science Tools	15000-08
Number 5 forceps	Fine Science Tools	91150-20
Mercox II kit	Ladd Research	21247
Benzyl alcohol	Fisher Scientific	1816-04	Only required for BABB-clearing
Benzyl benzoate	MP Biomedicals, LLC	154839	Only required for BABB-clearing
Phosphate-buffered saline (PBS)
Modeling clay
Scale
Laboratory scissors
15 ml cap polypropylene tubes
4% paraformaldahyde
15% potassium hydroxide (KOH)			Only required for maceration
Razor blade
100% methanol
3 ml luer lock syringe