Summary
Метод визуализации и количественной оценки 3-мерной структуры мышь печеночной воротной вены или канал внутрипеченочных желчных описано. Эта техника литой изоляцией могут быть применены и к другим протоков или сосудистой системы и позволяет
Abstract
В органах, правильная архитектура сосудистой и протоковой структур является необходимым для надлежащего физиологические функции, а формирование и поддержание этих структур является строго регулируется процесс. Анализ этих сложных, 3-мерные структуры в значительной степени зависела от любой 2-мерной экспертизы в разделе, или на красителях исследований инъекции. Эти методы, однако, не в состоянии обеспечить полное и количественной представленности протоков или сосудистых структур, они предназначены для выяснения. Кроме того, природа 3-мерных пластиковых отливок смолы создает постоянную снимок системы и является новым и широко полезный метод для визуализации и количественной 3-мерной структуры и сети.
Важным преимуществом системы литья смол является возможность определения нетронутыми и подключены, или общения, структура кровеносных сосудов или протоков. Структура сосудистой и герцогаТаль сети имеют решающее значение для функции органа, и этот метод имеет потенциал, чтобы помочь изучению сосудистой и протоковой сети несколькими способами. Смола литья могут быть использованы для анализа нормальной морфологии и функциональной архитектуры просвета структуру, определить развитие морфогенетических изменений, и выявить морфологические различия в архитектуре ткани между нормальным и болезненных состояний. Предыдущая работа использованы смолы литья для изучения, например, архитектурных и функциональных дефектов в желчных внутрипеченочных мыши системе воздуховодов, которые не были отражены в 2-мерном анализе структуры 1,2, изменениями в мозге сосудистой болезни Альцгеймера мыши модель 3 , портал нарушения вены портал гипертонической и циррозом мышей 4, шаги в развитии крыс созревания лимфатических между незрелых и взрослых легких 5, непосредственные микрососудистых изменений в печени крыс, поджелудочной железы, почек и в ответ в химической травмы6.
Здесь мы представляем способ создания 3-мерного литой изоляцией из мыши или протоковой сосудистой сети, с особым акцентом на воротной вены и внутрипеченочных желчных проток. Эти слепки могут быть визуализированы, сняв или размягчения тканей и затем могут быть проанализированы. Эта техника может быть применена практически к любому сосудистой или протоковой системе и будет непосредственно применимы к любому исследованию, расследовавшей развития, функции, обслуживание или повреждение 3-мерное протоков или сосудистые структуры.
Protocol
1. Подготовка Канюля
- Теплые 1-дюймовый длинный участок трубы PE10 кончиками пальцев и растянуть его так, чтобы трубка становится тонким.
Примечание: размер судна или канал для канюлировали будет определять степень растяжения требуется. Канюля должна быть хорошо растягивается на желчных протоков бросает, но может быть только должны быть умеренно напряжены до вписываются в более крупную воротной вены. - Отрежьте трубки растянутую по диагонали для создания скошенных чаевых.
- Вырезать другой край трубки, чтобы создать 5-6 дюймовый сегмент.
- Вставьте в 32 калибра, ½ дюйма шприц для подкожных инъекций в не скошенный край трубки.
2. Подготовить шприц с PBS
- Наполните шприц 3 мл с PBS.
- Винт шприц на шприц с прикрепленными вытащил PE10 труб предварительно подготовленных.
- Шприц Flick и поршень шприца толчок, чтобы PBS наполнил иглу и насосно-компрессорные инет пузырьков воздуха в шприце.
- Поместите подготовленный шприц с PBS в шприц-держатель форму из пластилина. Этот держатель будет держать шприц устойчивой в то время как трубка вставляется в воздуховод.
3. Другие Установки
- Взвесить 0,1 г катализатора в небольшой контейнер, например, одной из лунок 24-луночный планшет.
- Вытяните 1 мл смолы в 3 шприца мл.
Примечание: относительное количество катализатора и смолы может быть скорректирована, чтобы изменить время отверждения. Уменьшение количества катализатора, однако, может увеличить бросить усадки и приводят к менее желательным актеров.
Примечание: При обращении смолы, принять меры предосторожности, чтобы избежать контакта со смолой или вдыхание паров смолы. Всегда надевайте перчатки и выполните шаги с участием смолы в хорошо проветриваемых помещениях, таких как химический вытяжной шкаф - Вырежьте кусок шелка 5,0 шов около 5 дюймов для использования в качестве лигатуры.
4. Подготовить мышь
Примечание: Этот шаг также может быть перфорированнойrmed 4% параформальдегидом вместо PBS. Использование 4% параформальдегида может увеличить сосудистой целостности и в результате более точных броска, в частности меньшей сосудистых структур.
5. Иглу Внепеченочные воротной вены или общего желчного протока
- Использование изогнутых щипцов пройти хирургические шовные лигатуры под воротной вены или желчных протоков, примерно ¼ дюйма от печени.
- Привяжите нить в свободную общих узлов. Не затягивайте этот узел.
- Если вы работаете с открытой системой, она может быть полезной, чтобы связать и затянуть лигатуры на другом конце системы. Если вы открыли общей кардинальной вены стечь крови из воротной вены, завязать лигатуру вокруг него, чтобы увеличить давление в воротной вене и предотвращения утечки смолы в центральную вену печени.
- Используйте весной ножницами, чтобы сделать небольшой разрез в воротной вене или желчных протоков, примерно ¼ дюйма ниже шва узла. Этот у.е.т должны проникать не более чем на половину диаметра воротной вены или желчных протоков.
- Используя № 5 щипцы, держа воротной вены или желчных протоков на месте разреза и вставьте скошенный конец трубки в желчный проток.
- Нажмите кончик трубки прошлом предварительно связали лигатуры и к печени.
- Тест для катетеризации точности путем инъекции PBS через канюлю и смотреть, чтобы увидеть, если она входит в воротной вене или желчных протоков.
- Затянуть лигатуру провести канюли на месте.
6. Литой воротной вены или канал внутрипеченочных желчных
- Добавить предварительно измеренных 1 мл смолы предварительно измеренных 0,1 г катализатора и тщательно перемешайте. Избегайте образования пузырьков воздуха.
- Ничья смола-катализатор смесь обратно в шприц 3 мл. Удалите пузырьки воздуха, осторожно стряхивая шприц и изгнания пузырей.
Примечание: для литья мелких структур, это может быть полезно использовать вакуумную камеру для удаления очень маленьких пузырьков воздуха из йСмола е и повышения качества литья. Для того чтобы учесть время, чтобы выполнить этот шаг, то это будет необходимо уменьшить катализатор / смола отношение от предложенного выше, для того, чтобы замедлить смолы отверждения. - Осторожно установите PBS-содержащих шприца со смолой, содержащей шприц, оставив 32-иглой прикреплены к канюлю.
- Медленно и осторожно надавите смолы в воротной вене или желчных протоков, пока сопротивление увеличивается и печень заполнена.
- Использование мокрых ватным тампоном нежно массировать и стимулировать печень, даже заливки.
- Удалите канюлю от структуры и быстро подтянуть лигатуры для предотвращения утечки смолы.
- Разрешить мыши, чтобы лежать при комнатной температуре в течение 20 мин, а смолы лечит, а затем удалить печень.
- Продолжайте либо очистки или настаиванием печени.
7. Очистить печень для визуализации на месте
- Исправить печени в 4% параформальдегид в течение ночи при 4 ° C, качалки.
- Промыть печеньPBS в течение не менее четырех часов, качалки. На данный момент, вы можете отделить печень долях, если это необходимо.
- Высушить в 50% метанола, а затем в 100% метаноле, по крайней мере, четыре часа каждый, раскачиваясь при комнатной температуре.
- Очистить печень в 1:2, решение бензиловый спирт и бензил бензоат (Babb), по крайней мере, 24 часа в сутки, качалки. Дольше мыть раз могут быть необходимы. Если печень не полностью ясно после 2-3 дней, вернуться к 100% метанола в течение 24 часов и повторите Babb очистки.
- Погрузитесь в печени Babb в чашке Петри стекла для работы с изображениями на месте.
8. Размочите ткани печени
- Удалить печени от мыши и помещали в 50 мл коническую трубку с водой. Подождите 1 час для полного отверждения смолы. Отдельные долей печени при желании.
- Слейте воду и двигаться печени в стеклянную бутылку. Погрузитесь в 15% КОН. Оставить на ночь при комнатной температуре. Не качаться.
- Осторожно вылейте KOH и мыть литых в дистиллированной воде. Примечание: приведение версииУ хрупкой и должны быть обработаны с особой тщательностью. Избегайте нарушая литья при добавлении или удалении жидкости из трубки.
- Когда литой чисто, аккуратно лежали на Kimwipe высохнуть, а затем перенести в контейнер для хранения.
9. Представитель Результаты
Успешный бросок воротной вены или желчных протоков покажет непрерывной сетью все меньше отраслей простирается от рубчика в печени периферии.
На рисунке 1 показана воротной вены брошен как визуализировать на месте после Babb очистки. Рисунок 1А показывает литой всей левой доли печени и форма и размер литья. Рис. 1б показывает крупным планом одного и того же актеров, демонстрирующих проникновение смолы в наименьшей портала ветвей вены в печень периферии.
На рисунке 2 показан портала литых вену, которая претерпела KOH маceration. Рисунок 2А показывает всю левую долю печени и рис. 2В является крупным планом мелких периферических ветвей.
Эта техника также успешно применяется для внутрипеченочных желчных протоков и опубликован с использованием как Babb очистки и KOH мацерации методы 1,2,7.
Среди распространенных проблем неполной заливки, пузыри в смоле и переполнения в окружающие ткани или системы. Рисунок 3 показывает, как признать неполное заполнение (рис. 3А), пузыри (рис. 3А), и переполнение смолы из воротной вены в центральной вены (рис. 3В).
Все изображения, сделанные с помощью Leica MZ 16 FA стереоскоп и QImaging RETIGA 4000R камеру.
Рисунок 1. Бабб-очистили литой печеночных вен оставили доли портал. А. литой показывает иерархическую структуру ветвления простирается от рубчика в печени периферии. Литой появляется в желтый цвет в сине-тонированные доли печени. B. крупным планом показывает, что смола заполнения распространяется на небольшие филиалы в печени периферии. Смола является беловатый через очищается печень. Шкала бар = 1 мм.
Рисунок 2. Tissue-мацерированном литой изоляцией печеночных вен оставили доли портал. А. литой целой доли печени показывает, что многие филиалы различных размеров. B. крупным планом показывает мелкие ветви на периферии печени. Оперение появление мелких ветвей представляет смолы заполнения синусоидальной пространства и могут или не могут быть видны на смолу бросает и приведет к увеличению кажущейся плотности филиал если он присутствует. Смола имеет белый цвет. Шкала бар = 1 мм.
Рисунок 3. Общие проблемы со смолой отливок. А. неполное заполнение левой воротной вены доли очевидно, по некоторым или всем отраслям литой не в состоянии распространяться на печень периферии. Это литой также отображает пузыри, видно, как разрывы в непрерывном литье (стрелка). B. Благодаря близости от воротной вены и центральной ветвей вены в некоторых местах, портал смолы вены часто входят и заполнить центральную вену. Это может быть признана, когда существуют два различных прикорневых ветвей (стрелки) и два ветвящиеся структуры, которые имеют различные узоры и перекрытия. Различение между техническими ошибками и истинный морфологических изменений может быть сделано двумя способами. Во-первых, литой структуры должны быть по сравнению со структурой ожидать на основе 2-мерный анализ или другие методы. Во-вторых, важно выполнять несколько дубликатов, и, когда это возможно, дать количественную оценку структурыЮр и выполнить статистический анализ, чтобы определить воспроизводимость и если есть статистически значимые морфологические изменения внутри и между различными экспериментальными и контроля над вооружениями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описали конкретные примеры того, как воротной вены и внутрипеченочных желчных протоков системы печени может быть приведен, но эта техника может быть применена практически к любой другой протоков или сосудистая система с небольшими изменениями. Предыдущие исследования продемонстрировали возможности этого метода в несколько видов, в том числе мыши 1,2,7-9, утенок 10,11, 12,13 кролика, собаки, 14 и свиней 15, а во многих органах, включая носовые железы 14, Сердце 16, 12,13 мочевого пузыря и печени 1,2,7,8. Эти слепки могут быть использованы для сравнения нескольких систем (например, воротной вены и желчных протоков) в пределах одной ткани, такую же структуру в различных стадиях развития 5, или влияние на структуру генетических или экологических изменений и влияний 1-4 , 6,7. Широкое применение этого метода у разных видов и органов делает смолы литья весьма ценным инструментом для сtudying морфологии сосудистой и протоковой структуры и имеет потенциал, чтобы значительно увеличить наши знания о нормальной функции этих структур, а также, как они страдают, и как они влияют на орган, в животных моделях болезни.
Использование смолы для создания 3-мерного отливок обеспечивает постоянную снимок протоков или сосудистой системы и имеет ряд преимуществ по сравнению с аналогичными методами. Во-первых, литой может быть проанализирован как автономные структуры после мацерации, предлагая преимущества по сравнению с тушью или аналогичные инъекции чернил. Во-вторых, постоянство структуры повышает удобство анализа. Последнее, способность смолы Mercox II выдержать процедуру Babb очистки позволяет уникальная способность визуализировать структуры на местах даже в больших или плотной ткани.
Есть несколько типов смол доступны с различными характеристиками. Mercox II был выбран для этой техники для многих продвинутыхantages; Mercox II имеет низкую вязкость, что позволяет ему проникать небольших периферийных воротной вены и филиалов желчных протоков, она имеет быстрого и полного отверждения при комнатной температуре, необходимой для анализа автономного мацерированном литья, он имеет минимальную усадку при отверждении, и это Выдерживает Babb ткани поляне. Другой тип смолы, Microfil (Flowtech, Carver, Массачусетс), была использована в нескольких опубликованных исследований 8,9,15. Для сравнения, Microfil не вылечить полностью при комнатной температуре и лучше всего представима через ткань очистки. Microfil бросает из воротной вены ранее были проанализированы с помощью 10%-ного формалина фиксации и последующей очистки с ethanolmethyl салицилат 8.
Смола добавок может обеспечить дополнительные методы литья визуализации; добавлением цветных красителей, флуоресцентных молекул, или микросферы могут улучшить анализ. Рассмотрение должно быть принято, однако, чтобы убедиться, что молекулы красителя выбрали достаточно малы, чтобы проникать в инnded сосудистой или протоковой структурой, что они существенно не изменяют свойства смолы, что они способны выдерживать либо очистки ткани или мацерации, и что они совместимы с желаемым методом анализа. Выбор смолы добавки во многом будет зависеть от конкретного применения: например, микросферы (молекулярные зонды) слишком велики, чтобы пройти через печеночные синусоиды, что делает их непригодными для изучения нормальной синусоидальной архитектуры, но идеальный инструмент для исследования развития портосистемное шунты , которые являются достаточно большими, чтобы разместить микросферы, в генетически измененных мышах 8.
Наконец, анализ литой изоляцией могут быть выполнены в любом очищен или вымачивают отливок. Бабб-очистили слепков могут быть использованы для измерения структуры системы, как он относится к органу, в котором он находится. KOH-мацерированном слепков могут быть проанализированы различными способами. Предыдущие исследования использовались сканирующей электронной микроскопии (SEM) для визуализации микроциркуляции сетей и конструкции судна 12,13,17. Литейного также может быть количественно номер ветви, диаметра и объема с использованием microcomputed томографии (microCT) 1,15,18, 19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья (NIH) для SSH (R01-DK078640), из Медицинского института Говарда Хьюза (HHMI) через HHMI / Vanderbilt University Программа Сертификата в области молекулярной медицины в TJW (GRDOT56006779), Vanderbilt диабета исследовательский и учебный центр (P30-DK020593) и пищеварительной Vanderbilt болезни исследовательский центр (P30-DK058404) предоставление основных услуг.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE10 polyethylene tubing | Fisher Scientific | 1417012P | |
| 5-0 surgical black braided silk | Roboz Surgical | SUT-15-1 | |
| Steriject 32 G x 13 mm needle | Air-tite | TSK3213 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Mercox II kit | Ladd Research | 21247 | |
| Benzyl alcohol | Fisher Scientific | 1816-04 | Only required for BABB-clearing |
| Benzyl benzoate | MP Biomedicals, LLC | 154839 | Only required for BABB-clearing |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Modeling clay | |||
| Scale | |||
| Laboratory scissors | |||
| 15 ml cap polypropylene tubes | |||
| 4% paraformaldahyde | |||
| 15% potassium hydroxide (KOH) | Only required for maceration | ||
| Razor blade | |||
| 100% methanol | |||
| 3 ml luer lock syringe |
References
- Sparks, E. E., Perrien, D. S., Huppert, K. A., Peterson, T. E., Huppert, S. S. Defects in hepatic Notch signaling result in disruption of the communicating intrahepatic bile duct network in mice. Dis. Model Mech. 4, 359-367 (2011).
- Vanderpool, C. Genetic interactions between hepatocyte nuclear factor-6 and notch signaling regulate mouse intrahepatic bile duct development in vivo. Hepatology. 55, 233-243 (2012).
- Meyer, E. P., Ulmann-Schuler, A., Staufenbiel, M., Krucker, T. Altered morphology and 3D architecture of brain vasculature in a mouse model for Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 3587-3592 (2008).
- Van Steenkiste, C. Vascular corrosion casting: analyzing wall shear stress in the portal vein and vascular abnormalities in portal hypertensive and cirrhotic rodents. Lab Invest. 90, 1558-1572 (2010).
- Dickie, R., Cormack, M., Semmler-Behnke, M., Kreyling, W. G., Tsuda, A. Deep pulmonary lymphatics in immature lungs. Journal of Applied Physiology. 107, 859-863 (2009).
- Kelly, D. M., McEntee, G. P., McGeenery, K. F., Fitzpatrick, J. M. Microvasculature of the pancreas, liver, and kidney in cerulein-induced pancreatitis. Archives of Surgery. 128, 293-295 (1993).
- Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).
- Carlson, T. R. Endothelial expression of constitutively active Notch4 elicits reversible arteriovenous malformations in adult mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9884-9889 (2005).
- Hemmeryckx, B., Emmerechts, J., Bovill, E. G., Hoylaerts, M. F., Lijnen, H. R. Effect of ageing on the murine venous circulation. Histochem. Cell Biol. , (2012).
- Hossler, F. E., Olson, K. R. Microvasculature of the nasal salt gland of the duckling, Anas platyrhynchos: quantitative responses to osmotic adaptation and deadaptation studied with vascular corrosion casting. J. Exp. Zool. 254, 237-247 (1990).
- Hossler, F. E., West, R. F. Venous valve anatomy and morphometry: studies on the duckling using vascular corrosion casting. Am. J. Anat. 181, 425-432 (1988).
- Hossler, F. E., Monson, F. C. Structure and blood supply of intrinsic lymph nodes in the wall of the rabbit urinary bladder--studies with light microscopy, electron microscopy, and vascular corrosion casting. Anat. Rec. 252, 477-484 (1998).
- Hossler, F. E., Monson, F. C. Evidence for a unique elastic sheath surrounding the vesicular arteries of the rabbit urinary bladder--studies of the microvasculature with microscopy and vascular corrosion casting. Anat. Rec. 252, 472-476 (1998).
- Hossler, F. E., Kao, R. L. Microvasculature of the urinary bladder of the dog: a study using vascular corrosion casting. Microsc. Microanal. 13, 220-227 (2007).
- Wischgoll, T., Choy, J. S., Kassab, G. S. Extraction of morphometry and branching angles of porcine coronary arterial tree from CT images. Am J Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1949-H1955 (2009).
- Hossler, F. E., Douglas, J. E., Douglas, L. E. Anatomy and morphometry of myocardial capillaries studied with vascular corrosion casting and scanning electron microscopy: a method for rat heart. Scan Electron Microsc. , 1469-1475 (1986).
- Hossler, F. E., Douglas, J. E. Vascular Corrosion Casting: Review of Advantages and Limitations in the Application of Some Simple Quantitative Methods. Microsc. Microanal. 7, 253-264 (2001).
- Mondy, W. L. Micro-CT of corrosion casts for use in the computer-aided design of microvasculature. Tissue Eng. Part C Methods. 15, 729-738 (2009).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Quantitative Assessment of the Rat Intrahepatic Biliary System by Three-Dimensional Reconstruction. The American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Hepatic Artery and Portal Vein Remodeling in Rat Liver: Vascular Response to Selective Cholangiocyte Proliferation. The American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).
