Summary
Werkwijze voor visualiseren en kwantificeren van de 3-dimensionale structuur van muis poortader of intrahepatische galgang beschreven. Deze hars gegoten techniek kan ook worden toegepast op andere ductale of vasculaire systemen en staat
Abstract
In organen de juiste architectuur van vasculaire en ductale structuren onmisbaar voor een goede fysiologische functie en de vorming en instandhouding van deze structuren is een sterk gereguleerd proces. De analyse van deze complexe, 3-dimensionale structuren sterk afhankelijk of 2-dimensionale onderzoek punt of kleurstof injectie studies. Deze technieken zijn echter niet in staat om een volledige en kwantificeerbare weergave van de ductale of vasculaire structuren zij moeten ophelderen verschaffen. Ook de aard van 3-dimensionale kunsthars worpen genereert een permanente snapshot van het systeem en is een nieuwe en zeer bruikbare techniek voor het visualiseren en kwantificeren van 3-dimensionale structuren en netwerken.
Een cruciaal voordeel van het hars gieten systeem is de mogelijkheid om de intacte en aangesloten, of communiceren, structuur van een bloedvat of kanaal te bepalen. De structuur van vasculaire en ductal netwerken zijn cruciaal voor orgaanfunctie en deze techniek heeft de potentie om studie van vasculaire en ductale netwerken steun op verschillende manieren. Hars gieten kan worden gebruikt om normale morfologie en functionaliteit van een luminale structuur analyseren, morfogenetische ontwikkeling veranderingen en ontdekken morfologische verschillen in weefselarchitectuur tussen normale en ziektetoestanden. Eerder werk heeft gebruikt kunstharsproducten te bestuderen, bijvoorbeeld, architectonische en functionele gebreken in de muis intrahepatische galwegen systeem dat niet weerspiegeld in 2-dimensionale analyse van de structuur 1,2, veranderingen in de hersenen vasculatuur van de ziekte van Alzheimer een muismodel 3 , poortader afwijkingen in portaal hypertensieve en cirrose muizen 4, ontwikkelingsstappen in de rat lymfatische rijping tussen onvolwassen en volwassen longen 5, onmiddellijke microvasculaire veranderingen in de rat lever, alvleesklier en nieren onder invloed van de chemische letsel6.
Hier presenteren we een methode voor het genereren van een 3-dimensionale hars gegoten van een muis vasculaire of ductaal netwerk, specifiek gericht op de poortader en intrahepatische galwegen. Deze afgietsels kunnen worden gevisualiseerd door het opruimen of macereren het weefsel en kan vervolgens worden geanalyseerd. Deze techniek kan worden toegepast op vrijwel alle vasculaire of ductale systeem en zou rechtstreeks op een studie onderzoek naar de ontwikkeling, functie, onderhoud of letsel van een 3-dimensionaal ductale of vasculaire structuur.
Protocol
1. Bereid canule
- Verwarm een 1-inch lange sectie van PE10 slang met uw vingertoppen en zo uitrekken dat de slang dun wordt.
Let op: de grootte van het vat of kanaal te worden voorzien van een canule zal de mate van uitrekken nodig vast te stellen. De canule moet goed gespannen voor galgang werpt, maar kan alleen worden verlangd tot matig worden uitgerekt om te passen binnen het grotere poortader. - Snijd de gestrekte buis bij een diagonaal een afgeschuinde punt genereren.
- Snijd de andere rand van de slang aan een 5-6 inch segment te maken.
- Plaats een 32 gauge, ½ inch injectienaald in de niet-schuine rand van de buis.
2. Bereid Spuit met PBS
- Vul een 3 ml spuit met PBS.
- Draai de spuit op de injectienaald met bijgevoegde getrokken PE10 leidingen eerder is bereid.
- Flick spuit en druk zuiger dat PBS zorgen heeft vulde de naald en leidingen ener geen luchtbellen in de spuit.
- Plaats de voorbereide injectiespuit met PBS in een spuit-houder gevormd uit klei. Deze houder zal de spuit stabiel, terwijl de buis wordt ingebracht in het kanaal.
3. Andere Set-up
- Weeg 0,1 g katalysator in een kleine container, bijvoorbeeld een putje van een plaat met 24 putjes.
- Trek 1 ml hars in een 3 ml spuit.
Opmerking: relatieve hoeveelheden katalysator en hars worden aangepast uithardingstijd veranderen. Afnemende hoeveelheid katalysator kan echter verhogen gegoten krimp en leiden tot een minder gewenst gegoten.
Let op: bij het hanteren van hars, voorzorgsmaatregelen treffen om contact te vermijden met hars of inademing van de dampen hars. Draag altijd handschoenen en voert u de stappen met hars in een goed geventileerde ruimte, zoals een chemische dampkap - Snijd een stuk van 5,0 zijden hechtdraad van ongeveer 5 cm worden gebruikt als een ligatuur.
4. Bereid Mouse
Opmerking: deze stap kan ook perfoEurosysteem bevestigde met 4% paraformaldehyde in plaats van PBS. Gebruik van 4% paraformaldehyde kan toenemen vasculaire integriteit en resulteren in een meer nauwkeurige cast, met name kleinere vasculaire structuren.
5. Canule Extrahepatisch Portal ader of galwegen
- Gebruik gebogen tang om de chirurgische hechtdraad ligatuur passeren onder de poortader of galwegen, ongeveer ¼ inch uit de lever.
- Bind de hechtdraad in een losse gemeenschappelijke knoop. Draai de knoop.
- Als u werkt met een open systeem, kan het nuttig zijn om te binden en een ligatuur draai aan de andere kant van het systeem. Als u hebt geopend de gemeenschappelijke hoofdader om het bloed afvoer van de poortader, das een ligatuur omheen om de druk te verhogen in de poortader en hars lekkage te voorkomen in de centrale hepatische ader.
- Gebruik de lente schaar om een klein sneetje in de poortader of galwegen, ongeveer ¼ inch onder de hechtdraad knoop te maken. Dit cut moeten dringen niet meer dan halverwege de diameter van de poortader of galgang.
- Met # 5 forceps, houdt de poortader of galgang op de plaats van de snede en steek afgeschuinde uiteinde van de slang in de galwegen.
- Duw tip van buizen langs de pre-gebonden ligatuur en naar de lever.
- Test voor canulatie nauwkeurigheid door het injecteren van PBS door de canule en kijken om te zien of het komt in de poortader of galgang.
- Draai de ligatuur om de canule op zijn plaats.
6. Resin Cast de poortader of Intrahepatische Bile Duct
- Voeg pre-gemeten 1 ml hars voor uw gemeten 0,1 g katalysator en meng. Vermijd het genereren van luchtbellen.
- Terug te trekken met hars katalysator mengsel in de 3 ml spuit. Verwijder eventuele luchtbellen door voorzichtig vegen de spuit en het verdrijven van bubbels.
Opmerking: voor het gieten kleine structuren, kan het nuttig zijn om een vacuümkamer gebruiken om zeer kleine luchtbellen uit the hars en verbeteren cast kwaliteit. Om de tijd tot deze stap uit te voeren, is het noodzakelijk om de katalysator / hars verhouding van die hierboven voorgestelde om uitharding vertragen hars verlagen. - Plaats voorzichtig PBS bevattende spuit met hars bevattende spuit, waarbij de 32 gauge naald bevestigd aan de canule.
- Langzaam en duw hars in de poortader of galgang tot weerstand neemt toe en de lever is gevuld.
- Gebruik nat wattenstaafje zachtjes masseren lever en een nog te vullen aan te moedigen.
- Verwijder de canule van de structuur en snel draai de ligatuur aan hars lekkage te voorkomen.
- Laat de muis om plat bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten terwijl de hars uithardt en verwijder lever.
- Ga met ofwel het opruimen of macereren de lever.
7. Clear Lever voor visualisatie in situ
- Bevestig de lever in 4% paraformaldehyde gedurende de nacht bij 4 ° C, rocking.
- Was de leverin PBS gedurende ten minste vier uur, schudden. Op dit punt, kunt u scheiden van de lever lobben indien gewenst.
- Drogen in 50% methanol en vervolgens in 100% methanol gedurende ten minste vier uur elk, schommelen bij kamertemperatuur.
- Verwijder de lever in een 1:2 oplossing van benzylalcohol en benzylbenzoaat (BABB) gedurende ten minste 24 uur, schudden. Langere wastijden nodig zijn. Als de lever niet verdwijnt volledig na 2-3 dagen, terug te gaan naar 100% methanol gedurende 24 uur en herhaal BABB clearing.
- Lever onderdompelen in BABB in een glazen petrischaal voor beeldvorming in situ.
8. Macereren leverweefsel
- Verwijderen lever van muizen en in een 50 ml conische buis met water. Wacht 1 uur voor complete hars uitharden. Afzonderlijke leverlobben indien gewenst.
- Giet water af en zet de lever aan een glazen fles. Dompel in 15% KOH. Reactie overnacht bij kamertemperatuur. Niet rocken.
- Giet af KOH en was gegoten in gedestilleerd water. Let op: de cast is very kwetsbaar en moet worden met uiterste zorg behandeld. Te verstoren de cast bij het toevoegen of verwijderen van vocht uit de buis.
- Wanneer hars gegoten schoon voorzichtig leggen op een Kimwipe drogen en overbrengen in een vat worden opgeslagen.
9. Representatieve resultaten
Een succesvolle cast van de poortader of galgang toont een continu netwerk van steeds kleinere vertakkingen zich vanaf de navel naar de lever omtrek.
Figuur 1 toont een poortader gegoten als gevisualiseerd in situ na BABB clearing. Figuur 1A de cast van de gehele linker leverkwab en de vorm en grootte van de cast toont. Figuur 1B toont een close-up van dezelfde cast, het aantonen van de penetratie van het hars in de kleinste poortader takken op lever omtrek.
Figuur 2 een poortader cast dat reeds KOH maceration. Figuur 2A toont de gehele linker leverkwab en figuur 2B is een close-up van de kleine perifere takken.
Deze techniek is ook met succes toegepast op de intrahepatische galwegen en gepubliceerd door zowel de BABB clearing en KOH maceratie technieken 1,2,7.
Veel voorkomende problemen zijn incomplete vult, bellen in de hars, overloopt omliggende systemen of weefsels. Figuur 3 toont hoe een incomplete vulling (figuur 3A), bubbles (figuur 3A), en een overloop hars herkennen aan de poortader naar de centrale ader (Figuur 3B).
Alle beelden worden genomen met behulp van een Leica MZ 16 FA stereoscoop en QImaging RETIGA 4000R camera.
Figuur 1. BABB-goedgekeurde hars gegoten in de lever linker kwab poortader. A. hars gegoten toont een hiërarchische boomstructuur zich vanaf de navel naar de lever omtrek. Hars gegoten verschijnt in gele kleur in blauw getint leverkwab. B. Een dichte verschijnt dat hars vullen zich uitstrekt tot kleine vestigingen in de lever periferie. Hars is witachtig via gewist lever. Schaal bar = 1 mm.
Figuur 2. Tissue-gemacereerde hars gegoten in de lever linker kwab poortader. A. Resin gieten van hele lever kwab toont vele takken van verschillende grootte. B. Close-up blijkt uit kleinschalige vestigingen in periferie van de lever. Bevedering verschijnen van kleine takken vertegenwoordigt hars vullen van sinusoïdale ruimten en al dan niet zichtbaar op hars zet en zal de schijnbare dichtheid branch toenemen indien aanwezig. Hars is wit van kleur. Schaal bar = 1 mm.
Figuur 3. Veel voorkomende problemen met hars afgietsels. A. Een onvolledige vulling van de linker kwab poortader is duidelijk door een aantal of alle gegoten takken niet uit te breiden naar de lever periferie. Dit gegoten geeft ook bellen, zichtbaar als onderbrekingen in de continu gegoten (pijl). B. Vanwege de nabijheid van de poortader en de centrale ader vestigingen in sommige plaatsen, zal de poortader hars vaak voer en vul de centrale ader. Dit kan worden herkend als er twee verschillende hilaire takken (pijlen) en twee vertakkende structuren die verschillende patronen en overlap hebben. Onderscheid te maken tussen technische fouten en echte morfologische veranderingen kan op twee manieren. Ten eerste moet de cast structuur worden vergeleken met de verwachte structuur op basis van 2-dimensionale analyse of andere methoden. Tweede is het belangrijk te voeren meerdere herhalingen, en indien mogelijk gekwantificeerd structUre en statistische analyses om reproduceerbaarheid te bepalen en als er een statistisch significante morfologische veranderingen tussen en binnen verschillende experimentele en controlegroepen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben beschreven specifieke voorbeelden hoe de poortader en intrahepatische galkanaal systemen van de lever kan worden gegoten, maar deze techniek kan worden toegepast op vrijwel elk ander ductaal of vasculaire systeem met kleine aanpassingen. Eerder werk heeft aangetoond dat het mogelijk deze techniek in verschillende soorten, waaronder muis 1,2,7-9, eendje 10,11, 12,13 konijn, hond 14 en varkens 15, en in veel organen, zoals nasale gland 14, hart 16, blaas 12,13, en lever 1,2,7,8. Deze mallen kunnen worden gebruikt om meerdere systemen (bijvoorbeeld de poortader en galwegen) vergelijken binnen hetzelfde weefsel, dezelfde structuur in verschillende ontwikkelingsstadia 5 of het effect op een structuur van genetische of omgevingsfactoren veranderingen of invloeden 1-4 , 6,7. De brede toepassing van deze techniek bij verschillende diersoorten en organen maakt hars gieten van een zeer waardevol instrument voor studying de morfologie van vasculaire en ductale structuren en heeft het potentieel om sterk toenemen kennis van de normale functie van deze structuren en hoe zij worden beïnvloed, of de invloed ervan een orgaan, in dierlijke ziektemodellen.
Het gebruik van hars 3-dimensionale casts maken geeft een permanent momentopname van een ductaal of vasculaire systeem heeft verschillende voordelen ten opzichte van vergelijkbare technieken. Ten eerste kan de cast worden geanalyseerd als een stand-alone-structuur na maceratie, het aanbieden van een voordeel ten opzichte van Oost-Indische inkt of soortgelijke inkt injecties. Ten tweede, de duurzaamheid van de structuur verhoogt het gemak van de analyse. Laatste, het vermogen van de Mercox hars II BABB de clearing procedure weerstaan zorgt voor een unieke mogelijkheid om een structuur in situ te visualiseren, zelfs in grotere of dichte weefsels.
Er zijn verschillende soorten hars met verschillende eigenschappen. Mercox II is gekozen voor deze techniek om de vele advantages; Mercox II een lage viscositeit, waardoor het kleine perifere poortader en galwegen takken binnendringen, snelle en volledige uitharding bij kamertemperatuur, essentieel voor het analyseren van de stand-alone gemacereerde cast, heeft minimale krimp na uitharding en bestand tegen BABB weefsel clearing. Een ander type hars, Microfil (Flowtech, Carver, MA) werd gebruikt in een aantal gepubliceerde studies 8,9,15. Relatief, is Microfil niet volledig genezen bij kamertemperatuur en wordt het best weergegeven door het weefsel clearing. Microfil afgietsels van de poortader eerder zijn geanalyseerd door middel van 10% formaline fixatie en de daarop volgende open plek met ethanolmethyl salicylaat 8.
Harsadditieven kunnen aanvullende methoden cast visualisatie; toevoeging van gekleurde kleurstoffen, fluorescerende moleculen of microsferen kunnen verbeteren analyse. Aanmerking worden genomen, echter dat de gekozen kleurstofmoleculen zijn klein genoeg om de inte dringennded vasculaire of ductale structuur, die niet wezenlijk veranderen de eigenschappen van de hars, dat zij kunnen zowel weefsel of clearing maceratie en dat zij verenigbaar zijn met de gewenste analysemethode weerstaan. Kiezen harsadditieven zal grotendeels afhangen van de specifieke toepassing, bijvoorbeeld microsferen (Molecular Probes) zijn te groot om door de lever sinusoïden, waardoor ze ongeschikt voor het onderzoek van normale sinusvormige architectuur maar een perfect gereedschap om de ontwikkeling van portosystemische shunts onderzoeken die groot genoeg zijn om microsferen geschikt, in een genetisch veranderde muis model 8.
Ten slotte kan hars gegoten analyse worden uitgevoerd in een van beide gewist of gemacereerd afgietsels. BABB-casts gewist zijn nuttig om de structuur van een te meten in relatie tot het orgaan waarbinnen deze zich bevindt. KOH-gemacereerde casts kunnen worden geanalyseerd op meerdere manieren. Eerdere studies hebben gebruikt scanning elektronenmicroscopie (SEM) om de microcirculatie netwerken en schip structuur 12,13,17 visualiseren. Afgietsels kan ook worden gekwantificeerd filiaalnummer, diameter en volume met gebruik van microcomputed tomografie (microCT) 1,15,18, 19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH) voor SSH (R01-DK078640), van het Howard Hughes Medical Institute (HHMI) door de HHMI / Vanderbilt University Certificate Program in Molecular Medicine aan TJW (GRDOT56006779), de Vanderbilt Diabetes Research en Training Center (P30-DK020593) en de Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30-DK058404) het verstrekken van Core Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE10 polyethylene tubing | Fisher Scientific | 1417012P | |
| 5-0 surgical black braided silk | Roboz Surgical | SUT-15-1 | |
| Steriject 32 G x 13 mm needle | Air-tite | TSK3213 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Mercox II kit | Ladd Research | 21247 | |
| Benzyl alcohol | Fisher Scientific | 1816-04 | Only required for BABB-clearing |
| Benzyl benzoate | MP Biomedicals, LLC | 154839 | Only required for BABB-clearing |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Modeling clay | |||
| Scale | |||
| Laboratory scissors | |||
| 15 ml cap polypropylene tubes | |||
| 4% paraformaldahyde | |||
| 15% potassium hydroxide (KOH) | Only required for maceration | ||
| Razor blade | |||
| 100% methanol | |||
| 3 ml luer lock syringe |
References
- Sparks, E. E., Perrien, D. S., Huppert, K. A., Peterson, T. E., Huppert, S. S. Defects in hepatic Notch signaling result in disruption of the communicating intrahepatic bile duct network in mice. Dis. Model Mech. 4, 359-367 (2011).
- Vanderpool, C. Genetic interactions between hepatocyte nuclear factor-6 and notch signaling regulate mouse intrahepatic bile duct development in vivo. Hepatology. 55, 233-243 (2012).
- Meyer, E. P., Ulmann-Schuler, A., Staufenbiel, M., Krucker, T. Altered morphology and 3D architecture of brain vasculature in a mouse model for Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 3587-3592 (2008).
- Van Steenkiste, C. Vascular corrosion casting: analyzing wall shear stress in the portal vein and vascular abnormalities in portal hypertensive and cirrhotic rodents. Lab Invest. 90, 1558-1572 (2010).
- Dickie, R., Cormack, M., Semmler-Behnke, M., Kreyling, W. G., Tsuda, A. Deep pulmonary lymphatics in immature lungs. Journal of Applied Physiology. 107, 859-863 (2009).
- Kelly, D. M., McEntee, G. P., McGeenery, K. F., Fitzpatrick, J. M. Microvasculature of the pancreas, liver, and kidney in cerulein-induced pancreatitis. Archives of Surgery. 128, 293-295 (1993).
- Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).
- Carlson, T. R. Endothelial expression of constitutively active Notch4 elicits reversible arteriovenous malformations in adult mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9884-9889 (2005).
- Hemmeryckx, B., Emmerechts, J., Bovill, E. G., Hoylaerts, M. F., Lijnen, H. R. Effect of ageing on the murine venous circulation. Histochem. Cell Biol. , (2012).
- Hossler, F. E., Olson, K. R. Microvasculature of the nasal salt gland of the duckling, Anas platyrhynchos: quantitative responses to osmotic adaptation and deadaptation studied with vascular corrosion casting. J. Exp. Zool. 254, 237-247 (1990).
- Hossler, F. E., West, R. F. Venous valve anatomy and morphometry: studies on the duckling using vascular corrosion casting. Am. J. Anat. 181, 425-432 (1988).
- Hossler, F. E., Monson, F. C. Structure and blood supply of intrinsic lymph nodes in the wall of the rabbit urinary bladder--studies with light microscopy, electron microscopy, and vascular corrosion casting. Anat. Rec. 252, 477-484 (1998).
- Hossler, F. E., Monson, F. C. Evidence for a unique elastic sheath surrounding the vesicular arteries of the rabbit urinary bladder--studies of the microvasculature with microscopy and vascular corrosion casting. Anat. Rec. 252, 472-476 (1998).
- Hossler, F. E., Kao, R. L. Microvasculature of the urinary bladder of the dog: a study using vascular corrosion casting. Microsc. Microanal. 13, 220-227 (2007).
- Wischgoll, T., Choy, J. S., Kassab, G. S. Extraction of morphometry and branching angles of porcine coronary arterial tree from CT images. Am J Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1949-H1955 (2009).
- Hossler, F. E., Douglas, J. E., Douglas, L. E. Anatomy and morphometry of myocardial capillaries studied with vascular corrosion casting and scanning electron microscopy: a method for rat heart. Scan Electron Microsc. , 1469-1475 (1986).
- Hossler, F. E., Douglas, J. E. Vascular Corrosion Casting: Review of Advantages and Limitations in the Application of Some Simple Quantitative Methods. Microsc. Microanal. 7, 253-264 (2001).
- Mondy, W. L. Micro-CT of corrosion casts for use in the computer-aided design of microvasculature. Tissue Eng. Part C Methods. 15, 729-738 (2009).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Quantitative Assessment of the Rat Intrahepatic Biliary System by Three-Dimensional Reconstruction. The American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Hepatic Artery and Portal Vein Remodeling in Rat Liver: Vascular Response to Selective Cholangiocyte Proliferation. The American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).
