Summary
Visualizing और माउस यकृत पोर्टल शिरा या intrahepatic पित्त नली के 3 आयामी संरचना बढ़ाता के एक विधि का वर्णन है. इस डाली राल तकनीक भी अन्य ductal या संवहनी प्रणालियों के लिए लागू किया जा सकता है और के लिए अनुमति देता है
Protocol
1. प्रवेशनी तैयार करें
- अपनी उंगलियों के साथ एक एक इंच PE10 टयूबिंग लंबे खंड गर्म और यह इतना खिंचाव कि टयूबिंग पतली हो जाता है.
नोट: पोत या वाहिनी cannulated आकार टूटती की आवश्यकता की डिग्री का निर्धारण करेगा. प्रवेशनी पित्त नली डाले के लिए किया जाना चाहिए अच्छी तरह से फैला, लेकिन केवल मामूली बड़ा पोर्टल शिरा के भीतर फिट करने के लिए बढ़ाया जा आवश्यकता हो सकती है. - एक विकर्ण बढ़ाकर टयूबिंग में कटौती के लिए एक beveled टिप उत्पन्न.
- एक 5-6 इंच खंड बनाने के लिए टयूबिंग के दूसरे किनारे कट.
- एक 32 गेज डालें, गैर beveled टयूबिंग की बढ़त में आधा इंच चमड़े के नीचे सुई.
2. पीबीएस के साथ सिरिंज तैयार
- पीबीएस के साथ एक 3 मिलीलीटर सिरिंज भरें.
- चमड़े के नीचे सुई के साथ संलग्न पर सिरिंज भाड़ में खींच लिया PE10 टयूबिंग पहले से तैयार है.
- झाड़ सिरिंज और धक्का सिरिंज सवार है कि पीबीएस सुनिश्चित सुई और टयूबिंग और भरी हैवहाँ सिरिंज में कोई हवाई बुलबुले हैं.
- पीबीएस के साथ एक सिरिंज क्ले मॉडलिंग के बाहर आकार का धारक में तैयार सिरिंज रखें. यह धारक सिरिंज स्थिर रखने के लिए, जबकि ट्यूबिंग नलिका में डाला जाता है.
3. दूसरे सेट अप
- एक छोटे कंटेनर, उदाहरण के लिए, एक 24-अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से एक में उत्प्रेरक की 0.1 ग्राम वजन.
- एक 3 मिलीलीटर सिरिंज में 1 मिलीग्राम राल खींचो.
नोट: उत्प्रेरक और राल के रिश्तेदार मात्रा इलाज समय में परिवर्तन करने के लिए समायोजित किया जा सकता है. उत्प्रेरक हो सकता है की राशि को घटाना, तथापि, संकोचन डाली और कम वांछनीय डाली नेतृत्व में वृद्धि हुई है.
नोट: जब राल हैंडलिंग, सावधानी बरतने के लिए राल या राल धुएं के साँस के साथ संपर्क से बचने के. हमेशा दस्ताने पहनना और रासायनिक धूआं हुड के रूप में इस तरह के कदम, एक अच्छी तरह हवादार क्षेत्र में राल शामिल प्रदर्शन - 5.0 लगभग 5 एक संयुक्ताक्षर के रूप में इस्तेमाल किया जा इंच के रेशम सीवन के एक टुकड़ा काट.
4. माउस तैयार करें
नोट: इस कदम भी perfo हो सकता हैपीबीएस के बजाय 4% paraformaldehyde साथ rmed. 4% paraformaldehyde का प्रयोग एक और अधिक सटीक साँचे में संवहनी अखंडता और परिणाम को बढ़ाने के लिए, छोटे संवहनी संरचनाओं के विशेष रूप से हो सकता है.
5. Extrahepatic पोर्टल नस या आम पित्त नली Cannulate
- घुमावदार संदंश प्रयोग पोर्टल शिरा या पित्त नली के नीचे सर्जिकल सिवनी संयुक्ताक्षर पास, लगभग ¼ इंच जिगर से.
- एक ढीला आम गाँठ में सीवन बाँधो. गाँठ नहीं कस.
- यदि आप एक ओपन एंडेड प्रणाली के साथ काम कर रहे हैं, यह टाई और प्रणाली के दूसरे छोर पर एक संयुक्ताक्षर कसने के लिए मददगार हो सकता है. अगर आप आम कार्डिनल नस खोला पोर्टल नस से खून नाली, यह चारों ओर एक संयुक्ताक्षर टाई पोर्टल शिरा के भीतर दबाव बढ़ाने के लिए और केंद्रीय हेपटिक नस में राल रिसाव को रोकने के.
- वसंत कैंची का उपयोग करने के लिए पोर्टल शिरा या पित्त नली में एक छोटे से लगभग ¼ सीवन गाँठ के नीचे इंच, कट. इस घनआधी पोर्टल शिरा या पित्त नली का व्यास के माध्यम से अधिक नहीं घुसना चाहिए.
- # 5 संदंश का प्रयोग, कटौती की साइट पर पोर्टल शिरा या पित्त नली पकड़ और पित्त नली में टयूबिंग की beveled अंत डालने.
- संयुक्ताक्षर पूर्व बंधे अतीत और जिगर की ओर पुश टयूबिंग की नोक.
- पीबीएस को प्रवेशनी के माध्यम से इंजेक्शन और देख देखने के लिए अगर यह पोर्टल शिरा या पित्त नली में प्रवेश करती है केन्युलेशन सटीकता के लिए टेस्ट.
- संयुक्ताक्षर कसो जगह में प्रवेशनी पकड़.
6. राल पोर्टल शिरा या intrahepatic पित्त नली कास्ट
- पूर्व मापा 0.1 छ उत्प्रेरक पूर्व मापा 1 मिलीग्राम राल जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से. हवाई बुलबुले पैदा करने से बचें.
- 3 मिलीलीटर सिरिंज में राल उत्प्रेरक मिश्रण वापस ड्रा. धीरे सिरिंज flicking और बुलबुले expelling द्वारा किसी भी हवाई बुलबुले निकालें.
नोट: छोटे संरचनाओं कास्टिंग के लिए, यह मददगार होगा एक निर्वात चैम्बर का उपयोग करने के लिए वें से बहुत छोटे हवाई बुलबुले को दूर कर सकते हैंई राल और कलाकारों गुणवत्ता बढ़ाने के. इस कदम प्रदर्शन करने के लिए समय के लिए अनुमति देने के लिए, यह के अनुपात / उत्प्रेरक राल कि ऊपर से सुझाव दिया क्रम में राल क्यूरिंग धीमी कमी के लिए आवश्यक हो जाएगा. - ध्यान से राल युक्त सिरिंज के साथ पीबीएस युक्त सिरिंज की जगह, 32 गेज प्रवेशनी की जुड़ी सुई जा.
- धीरे धीरे और धीरे पोर्टल शिरा या पित्त नली में राल धक्का प्रतिरोध बढ़ जाती है और जिगर तक भर जाता है.
- गीला कपास झाड़ू का प्रयोग धीरे जिगर की मालिश करने के लिए और एक भी भरण प्रोत्साहित करते हैं.
- संरचना से प्रवेशनी निकालें और जल्दी राल रिसाव को रोकने के संयुक्ताक्षर फिर से कस.
- माउस कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए फ्लैट करना जबकि राल इलाज, फिर जिगर को हटाने की अनुमति दें.
- या तो समाशोधन या macerating जिगर के साथ आगे बढ़ें.
7. स्वस्थानी में दृश्य के लिए स्पष्ट जिगर
- 4% रातोंरात paraformaldehyde में 4 डिग्री सेल्सियस, कमाल जिगर को ठीक करें.
- जिगर धोकम से कम चार घंटा, कमाल के लिए पीबीएस में. इस बिंदु पर, आप अगर वांछित जिगर lobes अलग हो सकता है.
- प्रत्येक के लिए कम से कम चार घंटे तो 50% मेथनॉल में और 100% मेथनॉल में निर्जलीकरण, कमरे के तापमान पर कमाल.
- Benzyl शराब और बेंजाइल बेंजोएट (Babb) के एक 1:2 समाधान में कम से कम 24 घंटा, कमाल के लिए जिगर को साफ़ करें. लंबा धोने बार की जरूरत हो सकती है. यदि जिगर 2-3 दिनों के बाद पूरी तरह से स्पष्ट नहीं है, 24 घंटे के लिए 100% मेथनॉल वापस ले जाने के लिए और दोहराएं Babb समाशोधन.
- Babb में स्वस्थानी में इमेजिंग के लिए एक गिलास पेट्री डिश में डूब जिगर.
8. जिगर ऊतक तर करने के लिए
- माउस से जिगर निकालें और एक 50 मिलीलीटर पानी के साथ शंक्वाकार ट्यूब में डाल दिया. पूरा राल इलाज के लिए 1 घंटा रुको. अगर अलग जिगर lobes वांछित.
- बंद पानी डालो और एक कांच की बोतल के लिए जिगर चाल. 15% KOH में डूब. कमरे के तापमान पर रात भर छोड़ दें. रॉक मत करो.
- सावधानी से बंद KOH डालना डाली और आसुत जल में धो लो. नोट: डाली देखें हैy नाजुक और चरम देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए. डाली खलल न डालें जब जोड़ने या हटाने के ट्यूब से तरल पदार्थ से बचें.
- जब डाली राल साफ है, धीरे के लिए सूखी Kimwipe पर रखना है, तो एक संग्रहीत करने के लिए कंटेनर को हस्तांतरण.
9. प्रतिनिधि परिणाम
पोर्टल शिरा या पित्त नली का एक सफल कलाकारों उत्तरोत्तर छोटे नाभिका से जिगर परिधि बढ़ाने शाखाओं की एक सतत नेटवर्क दिखा देंगे.
चित्रा 1 से पता चलता है एक पोर्टल शिरा में सीटू कल्पना के रूप में डाली के बाद Babb समाशोधन चित्रा. 1A पूरे छोड़ दिया जिगर पालि के कलाकारों और कलाकारों के आकार से पता चलता है चित्रा 1B ही कलाकारों के एक दृश्य के क्लोज - अप से पता चलता है, प्रदर्शन राल छोटी जिगर की परिधि में पोर्टल शिरा शाखाओं में प्रवेश.
चित्रा 2 एक पोर्टल शिरा डाली KOH मा आया है कि पता चलता हैceration 2A चित्रा. पता चलता है कि पूरे छोड़ दिया जिगर पालि और चित्रा 2B छोटे परिधीय शाखाओं के एक करीबी है.
इस तकनीक को भी सफलतापूर्वक किया गया है intrahepatic पित्त नली को लागू और दोनों Babb समाशोधन और KOH आर्द्रीकरण 1,2,7 तकनीक का उपयोग कर प्रकाशित.
आम समस्याओं भरता अधूरा, राल, और आसपास के सिस्टम या ऊतकों में अतिप्रवाह में चित्रा 3 बुलबुले दर्शाता है कि कैसे पोर्टल शिरा से पहचान करने के लिए एक अधूरी भरण (चित्रा 3A), बुलबुले (चित्रा 3 ए), और राल का एक अतिप्रवाह केंद्रीय नस (3B चित्रा).
सभी छवियों एक Leica MZ 16 एफए त्रिविमदर्शी का उपयोग और 4000R कैमरा Retiga QImaging लिया जाता है.
चित्रा 1Babb को मंजूरी दे दी. यकृत की डाली राल पालि पोर्टल शिरा छोड़ दिया है. ए डाली राल एक पदानुक्रमित शाखाओं में बंटी नाभिका से जिगर परिधि बढ़ाने संरचना से पता चलता है. डाली राल नीले रंग चढ़ाया हुआ जिगर पालि के भीतर पीले रंग में दिखाई देता है. बी एक करीबी से पता चलता है कि राल भरण जिगर परिधि में छोटी शाखाओं तक फैली हुई है. राल को मंजूरी दे दी जिगर के माध्यम से श्वेताभ है. पैमाने बार = 1 मिमी.
चित्रा 2 ऊतक macerated यकृत की डाली राल. पालि पोर्टल शिरा छोड़ दिया है. पूरे जिगर पालि के डाली राल अलग आकार की कई शाखाओं से पता चलता है. बी बंद हुआ जिगर की परिधि में छोटी शाखाओं से पता चलता है. छोटी शाखाओं की उपस्थिति तीर के सिरेपर sinusoidal रिक्त स्थान के भरने राल का प्रतिनिधित्व करता है और या दिखाई राल पर नहीं हो सकता है डाले और स्पष्ट शाखा घनत्व में वृद्धि करने के लिए मौजूद होगा अगर. राल सफेद रंग में है. पैमाने बार = 1 मिमी.
चित्रा 3 राल डाले साथ आम समस्याओं. ए बाईं पालि पोर्टल शिरा के एक अधूरा भरने के कुछ या सभी कलाकारों जिगर परिधि का विस्तार करने में नाकाम रहने की शाखाओं द्वारा स्पष्ट है. यह कलाकार भी बुलबुले को प्रदर्शित करता है, लगातार डाली (तीर) में टूट के रूप में दिखाई दे रहे हैं. पोर्टल और कुछ स्थानों में नस केंद्रीय नस शाखाओं की निकटता के कारण बी, पोर्टल शिरा राल बार और केंद्रीय नस को भरने जाएगा. यह तब होता है जब वहाँ दो अलग hilar (तीर) शाखाओं और दो शाखाओं में बंटी संरचनाओं कि विभिन्न पैटर्न और ओवरलैप पहचाना जा सकता है. तकनीकी त्रुटियों और सच morphological परिवर्तन के बीच भेदभाव दो तरीके से किया जा सकता है. सबसे पहले, कलाकारों संरचना 2 आयामी विश्लेषण या अन्य तरीकों के आधार पर की उम्मीद संरचना की तुलना में किया जाना चाहिए. दूसरा, यह प्रदर्शन कई replicates महत्वपूर्ण है, और जब संभव हो, struct मात्रा ठहरानाure और सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए reproducibility निर्धारित और अगर वहाँ के बीच और विभिन्न प्रयोगात्मक और हथियार नियंत्रण के भीतर एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण morphological परिवर्तन है.
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Discussion
हम विशिष्ट उदाहरण के लिए कैसे पोर्टल शिरा और जिगर की intrahepatic पित्त नली प्रणाली डाली जा सकती है वर्णित है, लेकिन इस तकनीक मामूली रूपांतरों के साथ लगभग किसी भी अन्य ductal या नाड़ी तंत्र के लिए लागू किया जा सकता है. पिछले काम 1,2,7-9 माउस सहित कई प्रजातियों, 10,11 बत्तख़ का बच्चा, 12,13 खरगोश, कुत्ता 14, और 15 सुअर, और नाक 14 ग्रंथि सहित कई अंगों में इस तकनीक की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है, 16 दिल, मूत्राशय, 12,13 और 1,2,7,8 जिगर. इन डाले ही ऊतक, विभिन्न विकासात्मक 5 चरणों भर में एक ही संरचना, या आनुवंशिक या पर्यावरणीय परिवर्तन या 1-4 प्रभावों की एक संरचना पर प्रभाव के भीतर कई सिस्टम (उदाहरण के लिए, पोर्टल शिरा और पित्त नली) की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 6,7. प्रजातियों और अंगों भर में इस तकनीक का व्यापक आवेदन के लिए एक अत्यधिक महत्वपूर्ण उपकरण कास्टिंग राल बनाता हैसंवहनी और ductal संरचनाओं के morphology tudying और बहुत पशु रोग मॉडल में इन संरचनाओं के सामान्य कार्य के हमारे ज्ञान के साथ ही वे कैसे प्रभावित कर रहे हैं, या कैसे वे प्रभावित अंग को बढ़ाने की क्षमता है.
3 आयामी डाले बनाने राल के उपयोग ductal या नाड़ी तंत्र की एक स्थायी स्नैपशॉट प्रदान करता है और इसी तरह की तकनीक पर कई फायदे हैं. सबसे पहले, कलाकारों स्टैंड - अलोन आर्द्रीकरण के बाद एक संरचना के रूप में विश्लेषण किया जा सकता है, भारत स्याही या इसी तरह की स्याही इंजेक्शन से अधिक लाभ की पेशकश की. दूसरा, संरचना के स्थायित्व के विश्लेषण के आसानी बढ़ जाती है. अंतिम, Mercox द्वितीय राल Babb समाशोधन प्रक्रिया का सामना करने की क्षमता एक अद्वितीय भी बड़े या घने ऊतकों के भीतर स्वस्थानी में एक संरचना की कल्पना करने की क्षमता के लिए अनुमति देता है.
वहाँ अलग विशेषताओं के साथ उपलब्ध राल के कई प्रकार हैं. Mercox द्वितीय इसके कई adv के लिए किया गया है इस तकनीक के लिए चुनाantages, Mercox द्वितीय कम दलदलापन है, यह छोटे परिधीय पोर्टल शिरा और पित्त नली शाखाओं घुसना करने के लिए अनुमति देता है, यह कमरे के तापमान पर त्वरित और पूरा क्यूरिंग है, खड़े अकेले macerated कलाकारों का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है, यह कम से कम संकोचन है जब ठीक है, और यह Babb ऊतक समाशोधन withstands. राल, MICROFIL (Flowtech, Carver, एमए) की एक अन्य प्रकार के कई प्रकाशित 8,9,15 अध्ययन में किया गया है. तुलनात्मक रूप से, MICROFIL पूरी तरह से कमरे के तापमान पर इलाज नहीं होता है, और सबसे अच्छा ऊतक समाशोधन के माध्यम से कल्पना है. MICROFIL पोर्टल शिरा के डाले पहले 10% formalin और ethanolmethyl 8 सैलिसिलेट के साथ बाद में समाशोधन निर्धारण के माध्यम से विश्लेषण किया गया है.
राल additives कच्चा दृश्य के अतिरिक्त तरीकों प्रदान कर सकते हैं, रंग रंजक, फ्लोरोसेंट अणु, या microspheres के अलावा विश्लेषण में वृद्धि कर सकते हैं. विचार, ले लिया जाना चाहिए लेकिन, यह सुनिश्चित करने के लिए कि डाई करने के लिए चुना अणु काफी छोटा करने के inte घुसनाnded संवहनी या ductal संरचना, कि वे काफी राल के गुणों को नहीं बदल नहीं कि वे ऊतक समाशोधन या आर्द्रीकरण, वे विश्लेषण के वांछित विधि के साथ संगत कर रहे हैं कि और झेलने में सक्षम हैं. राल additives चुनना बहुत विशिष्ट अनुप्रयोग पर निर्भर करेगा: उदाहरण के लिए, microspheres (आण्विक जांच) यकृत sinusoids के माध्यम से पारित करने के लिए भी बड़ा कर रहे हैं, उन्हें सामान्य sinusoidal वास्तुकला का अध्ययन लेकिन portosystemic shunts के विकास की जांच करने के लिए एक आदर्श उपकरण के लिए अनुपयुक्त बना , जो एक आनुवंशिक रूप से परिवर्तित माउस 8 मॉडल में काफी बड़े के लिए microspheres को समायोजित कर रहे हैं.
अंत में, डाली राल विश्लेषण या तो मंजूरी दे दी है या macerated डाले में किया जा सकता है. Babb को मंजूरी दे दी डाले करने के लिए एक प्रणाली की संरचना को मापने के रूप में यह अंग है जिसके भीतर यह रहता है संबंधित के लिए उपयोगी होते हैं. KOH macerated डाले कई मायनों में विश्लेषण किया जा सकता है. पिछले अध्ययनों से पता स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया है (SEM) microcirculation नेटवर्क और पोत 12,13,17 संरचना कल्पना करने के लिए. डाले भी शाखा संख्या, व्यास, और microcomputed टोमोग्राफी (microCT) 1,15,18, 19,20 के उपयोग के साथ मात्रा के लिए मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के स्वास्थ्य (NIH) के राष्ट्रीय संस्थानों से SSH के लिए अनुदान (R01 DK078640) / HHMI Vanderbilt विश्वविद्यालय सर्टिफिकेट प्रोग्राम के माध्यम से हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल (HHMI) TJW आण्विक चिकित्सा संस्थान (GRDOT56006779), से, द्वारा समर्थित किया गया Vanderbilt मधुमेह अनुसंधान और प्रशिक्षण केन्द्र (P30 DK020593) और Vanderbilt पाचन रोग अनुसंधान केंद्र (P30-DK058404) कोर सेवाओं प्रदान करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE10 polyethylene tubing | Fisher Scientific | 1417012P | |
| 5-0 surgical black braided silk | Roboz Surgical | SUT-15-1 | |
| Steriject 32 G x 13 mm needle | Air-tite | TSK3213 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Mercox II kit | Ladd Research | 21247 | |
| Benzyl alcohol | Fisher Scientific | 1816-04 | Only required for BABB-clearing |
| Benzyl benzoate | MP Biomedicals, LLC | 154839 | Only required for BABB-clearing |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Modeling clay | |||
| Scale | |||
| Laboratory scissors | |||
| 15 ml cap polypropylene tubes | |||
| 4% paraformaldahyde | |||
| 15% potassium hydroxide (KOH) | Only required for maceration | ||
| Razor blade | |||
| 100% methanol | |||
| 3 ml luer lock syringe |
References
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