Summary
小鼠肝门静脉或肝内胆管的3维结构的可视化和量化的方法进行说明。该树脂铸造技术也可以被应用到其他的导管或血管系统，并允许
Abstract
在器官的血管和导管结构，正确的架构是适当的生理功能不可缺少的，这些结构的形成和维持是一个高度管制的过程。这些复杂的，3维结构的分析，极大地依赖于任一的2 - 维的检查部或对染料注入研究。然而，这些技术无法提供一个完整的，可量化的表示他们的目的是阐明导管或血管结构。或者，3 - 维的塑料树脂石膏的性质产生一个永久的系统快照是一种新颖的和有用的技术，广泛的3维结构和网络的可视化和量化。
树脂浇注系统的一个关键优势的能力，以确定完整的连接，沟通，血管或胆管结构。血管的结构和公爵河谷网络是至关重要的器官功能，该技术具有的潜力，以帮助在几个方面研究血管和导管网络。分析正常形态和功能结构的腔结构，确定发育的形态发生变化，并发现正常和疾病状态的形态在组织体系结构之间的差异，也可以使用树脂浇铸。以前的工作利用了树脂浇铸研究，例如，在小鼠肝内胆管系统的架构和功能上的缺陷，并没有反映在二维分析的结构1,2，改变脑血管的一个阿尔茨海默氏症小鼠模型3 ，门静脉异常，门脉高压症和肝硬化小鼠4，在大鼠淋巴成熟不成熟和成人之间的肺的发育步骤5，即时反应，化学性损伤大鼠肝脏，胰腺和肾脏微血管的变化6。
在这里，我们提出一种方法，产生一个3维树脂浇铸体的小鼠血管或导管的网络中，特别注重门静脉和肝内胆管。这些强制转换可以通过清零或浸软组织可视化，然后进行分析。这种技术可以应用于几乎任何血管或导管的系统，将直接适用询问到一个3 - 维的导管或血管结构的发展，功能，维护，或损伤的任何研究。
Protocol
1。准备插管
- 随着你的指尖温暖了1英寸长的路段，PE10管材和伸展，使管变细。
注：该船只或导管，以将插管的大小将决定所需的拉伸程度。套管必须得到很好的拉伸为胆管蒙上，但可能只需要适度拉伸以适应较大的门静脉内。 - 对角线拉伸管生成一个斜面的顶端。
- 切油管创建的5-6寸段的另一边缘。
- 插入32计，½英寸皮下注射针入非斜面边缘的油管。
2。注射用PBS做准备
- 填写3毫升的注射器，用PBS。
- 用螺丝将附加的注射器针头注射器上拉，PE10管材事先准备好的。
- 弗里克注射器推注射器的活塞，以确保PBS充满了针管和有没有在注射器中的气泡。
- 与PBS将准备好的注射器，注射器持有人的橡皮泥塑造出。此保持器将注射器保持稳定，而管被插入到所述导管。
3。其他设置
- 称取0.1克催化剂到一个小的容器， 例如 ，一个24孔板中。
- 1毫升树脂拉成一个3毫升的注射器。
注：催化剂和树脂的相对量可以调整，以改变固化时间。催化剂可降低量，然而，增加投收缩和导致一个不太理想的铸造。
注：处理树脂时，采取预防措施，避免接触树脂或树脂烟雾吸入的。一定要戴上手套和执行步骤，涉及树脂在通风良好的地方，如化学通风柜 - 切下一块10.0丝线缝合约5英寸用作结扎。
4。准备好鼠标
注：此步骤也可以射孔rmed代替PBS中，用4％多聚甲醛。 4％多聚甲醛的使用可能会增加血管的完整性和结果在一个更精确的铸铁，特别是较小的血管结构。
5。导管插入肝外门静脉或胆总管
- 用弯钳通过下面的手术缝合线结扎，约¼英寸的肝门静脉或胆管。
- 扎缝合成一个松散的普通结。不要拧紧结。
- 如果您使用的是一个开放式系统，它可能是有帮助的另一端系统，以配合并拧紧结扎。如果你已经打开了常见的大是大非的门静脉血液从静脉漏，领带结扎，周围增加门静脉内压力，防止树脂泄漏到中央肝静脉。
- 使用春风似剪刀门静脉或胆管，约¼英寸以下的缝合打结，使一小截。这立方米t应该渗透不超过通过门静脉或胆管的直径的一半。
- 使用＃5镊子，将门静脉或胆管的部位切和插入的管子坡口端进入胆管。
- 前端油管推过去预先打结的绑带和对肝脏。
- 注射PBS通过套管和观看，看它是否进入门静脉或胆管插管精度试验。
- 拧紧结扎，插管的地方举行。
6。树脂浇铸体的门静脉或肝内胆管
- 加入预测1毫升的树脂预测得的0.1 g催化剂，调匀。避免产生气泡。
- 绘制树脂催化剂混合物放回3毫升注射器。删除任何气泡，轻轻弹注射器和排出气泡。
注意：用于铸造小的结构，它可能是有帮助的使用的真空室，除去很小的气泡，从第Ë树脂和增强铸就品质。为了允许的时间来执行此步骤，这将是必要的，以减少从上述建议，以便减缓树脂的固化的催化剂/树脂比。 - 小心地更换PBS含含树脂的注射器，注射器与留下的32号针头连接到所述套管。
- 慢慢地，轻轻一推树脂进入门静脉或胆管，直到阻力增加，肝脏充满。
- 用湿棉签轻轻按摩肝，鼓励甚至填补。
- 删除套管的结构和迅速重新拧紧结扎，防止树脂泄漏。
- 允许，鼠标平放20分钟，在室温下树脂固化，然后取出肝脏。
- 继续清除或浸取的肝脏。
7。清晰的可视化原位肝
- 修复肝脏在4％多聚甲醛固定过夜，在4℃下，摆动。
- 洗肝在PBS中，在至少四个小时，摆动。在这一点上，如果需要的话，你可以分开的肝叶。
- 至少四个小时每个脱水，在50％甲醇，然后在100％甲醇，在室温下摇动。
- 肝脏清除在1:2的苄醇，苯甲酸苄酯（巴布）溶液中至少24小时，摆动。可能需要较长的洗涤时间。如果肝脏没有完全明确后2-3天，回迁到100％甲醇24小时，和重复巴布结算。
- 淹没在巴布肝脏原位成像的玻璃培养皿。
8。浸软肝组织
- 删除从小鼠肝脏，并放入50毫升锥形管与水。等待1个小时，完全固化。单独肝叶如果需要。
- 倒掉水，移动肝脏玻璃瓶。淹没在15％KOH。发布于室温下过夜。不要晃动。
- 小心倒掉KOH和，蒸馏水洗铸造的。注：中投版Ÿ脆弱，应特别小心。避免扰乱投当添加或删除从管中的流体。
- 当树脂浇铸体是干净的，轻轻地躺在一个的Kimwipe以干燥，然后转移到一个容器存储。
9。代表性的成果
门静脉或胆管一个成功的演员，将显示一个连续的网络，逐步从肺门延伸到肝脏周围的小树枝。
图1示出了门静脉投作为可视化后在原位巴布结算。 图1A示出了铸造的整个左肝叶的形状和尺寸的铸造， 图1B示出了同样的铸造的特写视图，展示了渗透到最小的门静脉分支在肝脏周围的树脂。
图2示出了已经经历的KOH毫安的门静脉投细齿， 图2A示出了整个左肝叶和图2B是小周分支以特写的方式。
这种技术也被成功地应用于肝内胆管和发布使用巴布结算及KOH浸渍技术1,2,7。
常见的问题，包括不完整的填充，在树脂中，溢出到邻近的系统或组织的气泡。 图3演示如何认识到来自门静脉的一个不完整的填充（ 图3A），气泡（ 图3A），和一个溢出的树脂中央静脉（ 图3B）。
所有图像都使用Leica MZ 16 FA立体镜和QImaging RETIGA 4000R摄像头。
图1巴布清除树脂浇铸体肝左叶肝门静脉。 A.树脂施放示出了从肺门到肝脏周延伸的分层分支结构。树脂浇铸体出现在黄色蓝色调的肝叶内。 B.密切了树脂填充延伸到在肝脏周围的小树枝。通过清除肝树脂是白色的。比例尺= 1毫米。
图2。组织浸渍树脂浇铸体肝左叶肝门静脉。 A.树脂浇铸体的整个肝叶显示，许多大小不等的分支。 B.关闭的小树枝在周围的肝。羽化外观上的小树枝树脂充填的正弦空间，可能会或可能不会显示在树脂蒙上，如果存在明显的分支密度将增加。树脂是白色的。比例尺= 1毫米。
图3。通用与树脂类型转换的问题。 A.一个不完整的填充左叶门静脉部分或全部投没有延伸到肝脏边缘分支是明显的。这个演员还显示气泡，可见在连续铸钢（箭头）休息。 B.由于邻近的门静脉和中央静脉分支在一些地方，的门静脉树脂，经常进入并填写中央静脉。有两种截然不同的肺门分支（箭头）和两个分支的结构，有不同的图案和重叠时，这可以被识别。可以通过两种方式区分技术错误和真正的形态学改变。首先，将铸造结构应该比预期的结构的基础上的2维分析或其他方法。其次，重要的是执行多个复制，并且在可能的情况下，量化的结构尤尔并进行统计分析，以确定的重现性和不同的实验和控制臂之间和之内，如果有一个统计上显着的形态学改变。
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Discussion
我们已经介绍了如何可以转换的肝门静脉肝内胆管系统的具体例子，但这种技术可以应用到几乎任何其他的导管或血管系统有轻微的修改。先前的研究已经证明了这种技术的可行性，在多个物种，包括鼠标的2,7 ~~ 9，小鸭10,11，兔，狗14，12,13和猪15，并在许多器官，包括鼻粘膜腺体14，心脏，膀胱12,13，16和肝脏1,2,7,8。这些石膏可用于比较多个系统（例如，门静脉和胆管）相同的组织，跨不同的发育阶段5相同的结构，或产生的效果的结构的遗传或环境改变或影响1-4内[6,7]。跨物种器官这种技术的广泛应用，使树脂浇铸一个非常有价值的工具为studying的血管和导管结构和形态的可能大大增加我们的知识，以及他们如何受到影响，它们是如何影响器官的正常功能，这些结构，在动物疾病模型。
树脂以创建3维的转换使用的导管或血管系统，并提供了一个永久的快照，超过了类似的技术有几个优点。首先，投可以作为一个独立的结构后浸渍分析，提供了一个优势，印度墨水或类似的墨水注射。第二，持久的结构增加了便于分析。最后，Mercox II树脂承受的巴布结算程序的能力，允许一个独特的能力，可视化，即使在大的或致密的组织结构原位 。
有几种类型的树脂可具有不同特性。这种技术已被选定为它的许多高级Mercox IIantages; Mercox II具有粘度低，允许它穿透小周门静脉和胆管分支，它具有快速和完全固化，在室温下，用于分析单机浸渍的铸造的至关重要，它具有最小的收缩固化时，它经受住，巴布组织清算。树脂，Microfil（FLOWTECH，卡弗，MA）中，另一种类型的已被用于在多个发表的研究8,9,15。相比之下，Microfil不完全固化，在室温下，通过组织清算是最好的可视化。 Microfil蒙上先前已分析门静脉至10％福尔马林固定和随后的结算与ethanolmethyl水杨酸盐8。
树脂添加剂，可以提供额外的铸铁可视化的方法;有色染料，荧光分子，或微球体的添加可以提高分析。然而，代价，必须注意，以确保所选择的染料分子是小到足以穿透英特nded血管或导管的结构，它们不显著改变性能的树脂，使它们能够承受任一组织结算或浸渍，并与所需的分析的方法，它们是兼容的。选择树脂添加剂将在很大程度上取决于特定的应用程序，例如：微球（分子探针）是通过肝窦过大，使得它们不适合的研究正常的正弦架构，但一个完美的工具，调查门体分流术的发展，这是大到足以容纳性微球，在基因改变的小鼠模型8。
最后，树脂浇铸体进行分析可以在清除或浸渍的强制类型转换。巴布清零的石膏是很有用的测量系统的结构，因为它涉及到它所驻留的器官内。 KOH-浸渍的转换可以以多种方式进行分析。以前的研究已经使用扫描电子显微镜（SEM）观察微循环网络和血管的结构12,13,17。强制转换也可以被量化为分支数，直径和体积与使用microcomputed断层扫描（微型电脑）1,15,18，19,20。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院（NIH）的资助SSH（R01-DK078640），霍华德·休斯医学研究所（HHMI）通过在分子医学TJW HHMI /范德比尔特大学的证书课程（GRDOT56006779），范德比尔特糖尿病研究和培训中心（P30-DK020593）和范德比尔特消化疾病研究中心（P30-DK058404）提供的核心服务。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE10 polyethylene tubing | Fisher Scientific | 1417012P | |
| 5-0 surgical black braided silk | Roboz Surgical | SUT-15-1 | |
| Steriject 32 G x 13 mm needle | Air-tite | TSK3213 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Mercox II kit | Ladd Research | 21247 | |
| Benzyl alcohol | Fisher Scientific | 1816-04 | Only required for BABB-clearing |
| Benzyl benzoate | MP Biomedicals, LLC | 154839 | Only required for BABB-clearing |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Modeling clay | |||
| Scale | |||
| Laboratory scissors | |||
| 15 ml cap polypropylene tubes | |||
| 4% paraformaldahyde | |||
| 15% potassium hydroxide (KOH) | Only required for maceration | ||
| Razor blade | |||
| 100% methanol | |||
| 3 ml luer lock syringe |
References
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