Summary
Procédé de visualisation et de quantification de la structure tridimensionnelle de 3-veine porte hépatique de la souris ou du conduit biliaire intrahépatique est décrit. Cette technique coulée de résine peut également être appliquée à d'autres systèmes canalaires ou vasculaire et permet
Abstract
D'organes, l'architecture correcte des structures vasculaires et du carcinome canalaire est indispensable pour la fonction physiologique adéquate, et la formation et le maintien de ces structures est un processus hautement régulé. L'analyse de ces complexes, 3-dimensions des structures a fortement dépendu de chaque examen en 2 dimensions dans la section ou sur des études d'injection de colorant. Ces techniques, cependant, ne sont pas en mesure de fournir une représentation complète et quantifiable des structures canalaires ou vasculaire qu'ils sont destinés à élucider. Alternativement, la nature de la 3-dimensions des moulages en résine plastique génère un instantané permanente du système et est un roman et technique largement utile pour visualiser et quantifier les 3-dimensions des structures et des réseaux.
Un des principaux avantages du système de moulage en résine est la capacité de déterminer l'état intact et connecté, ou la communication, la structure d'un vaisseau sanguin ou un conduit. La structure du duc vasculaire ettal réseaux sont essentiels pour la fonction des organes, et cette technique a le potentiel d'aider étude des réseaux vasculaires et canalaires de plusieurs façons. Coulée de résine peut être utilisée pour analyser la morphologie normale et l'architecture fonctionnelle d'une structure luminale, d'identifier les changements morphogénétiques de développement, et de découvrir les différences morphologiques dans l'architecture des tissus entre l'état normal et la maladie. Des travaux antérieurs ont utilisé une résine de coulée pour étudier, par exemple, des défauts architecturaux et fonctionnels au sein du système biliaire souris intrahépatiques qui n'étaient pas reflétés dans les 2-dimensionnelle analyse de la structure de 1,2, les modifications dans le système vasculaire du cerveau d'un modèle de la maladie d'Alzheimer souris 3 , les anomalies de la veine porte en portail souris hypertendues et cirrhotiques 4, les étapes de développement de la maturation lymphatique rat entre les poumons immatures et adultes 5, immédiats des changements microvasculaires dans le foie de rat, du pancréas et du rein en réponse à une blessure chimique6.
Nous présentons ici une méthode pour générer une résine coulée 3-dimensionnelle d'un réseau vasculaire de la souris ou canalaire, en se concentrant spécifiquement sur la veine porte et voie biliaire intra-hépatique. Ces plâtres peuvent être visualisées par compensation ou macération du tissu et peuvent ensuite être analysées. Cette technique peut être appliquée à pratiquement n'importe quel système vasculaire ou canalaire et serait directement applicable à toute étude enquête sur le développement, la fonction, l'entretien, ou d'une blessure d'une structure en 3 dimensions canalaire ou vasculaire.
Protocol
1. Préparer canule
- Chauffer une section de 1 pouce de long tube de PE10 avec vos doigts et étirez sorte que le tube devient mince.
Remarque: la taille de la cuve ou conduit à une canule permettra de déterminer le degré d'étirement nécessaire. La canule doit être bien tendue pour les voies biliaires jette mais ne peut être exigé d'être modérément étirée pour s'adapter à l'intérieur de la veine grande porte. - Couper le tube étiré en diagonale pour générer un embout biseauté.
- Couper l'autre bord de la tubulure pour créer un segment de 5-6 cm.
- Insérer une jauge de 32, l'aiguille hypodermique ½ pouce dans le bord non biseautée du tube.
2. Préparer la seringue avec du PBS
- Remplissez une seringue de 3 ml avec du PBS.
- Vissez la seringue sur l'aiguille hypodermique avec joint tiré PE10 tube préalablement préparé.
- Seringue Flick et piston de la seringue poussée pour s'assurer que PBS a rempli l'aiguille et tubulure etil n'ya pas de bulles d'air dans la seringue.
- Placez la seringue préparée avec du PBS dans une seringue porte-forme de pâte à modeler. Ce support maintenir constante la seringue pendant que le tube est inséré dans le conduit.
3. Autre Set-up
- Peser 0,1 g de catalyseur dans un petit récipient, par exemple, un puits d'une plaque de 24 puits.
- Pull 1 ml de résine dans une seringue de 3 ml.
Note: les quantités relatives de catalyseur et de la résine peut être ajustée pour modifier le temps de durcissement. Diminuer la quantité de catalyseur peut, toutefois, augmenter les jeter retrait et conduire à une distribution moins souhaitable.
Remarque: lors de la manipulation de résine, prendre des précautions pour éviter tout contact avec de la résine ou l'inhalation des vapeurs de résine. Toujours porter des gants et suivez les étapes impliquant la résine dans un endroit bien aéré, comme une hotte - Coupez un morceau sur 5.0 suture de soie d'environ 5 pouces pour être utilisé comme une ligature.
4. Préparer souris
Remarque: cette étape peut également être performé avec du paraformaldéhyde 4% au lieu de PBS. L'utilisation de paraformaldéhyde à 4% peut augmenter l'intégrité vasculaire et entraîner une fonte plus précis, en particulier des plus petites structures vasculaires.
5. Cathétériser la veine porte extrahépatique ou voie biliaire principale
- Utiliser une pince courbe pour passer le fil de suture chirurgical sous ligature de la veine porte ou du canal biliaire, d'environ un quart de pouce à partir du foie.
- Attacher le fil de suture dans un noeud lâche commun. NE PAS serrer le nœud.
- Si vous travaillez avec un système ouvert, il peut être utile de lier et serrer une ligature à l'autre bout du système. Si vous avez ouvert la veine cardinale commune pour drainer le sang de la veine porte, attachez une ligature autour d'elle pour augmenter la pression dans la veine porte et empêcher la fuite de résine dans la veine hépatique central.
- Utilisez des ciseaux à ressort pour faire une petite incision dans la veine porte ou du canal biliaire, environ ¼ de pouce au-dessous du nœud de suture. Ce cut doit pénétrer pas plus de la moitié du diamètre de la veine porte ou biliaire.
- En utilisant une pince n ° 5, maintenez la veine porte ou canal cholédoque sur le site de la coupe et insérer l'extrémité biseautée du tube dans le canal cholédoque.
- Poussez la pointe du tube après la ligature pré-noué et vers le foie.
- Test de précision par injection de PBS canulation travers la canule et regarder pour voir si elle pénètre dans la veine porte ou des voies biliaires.
- Serrer la ligature pour maintenir la canule en place.
6. Résine de coulée de la veine porte ou voie biliaire intrahépatique
- Ajouter pré-mesurée de résine 1 ml de pré-mesurée 0,1 g de catalyseur et mélanger soigneusement. Éviter de générer des bulles d'air.
- Dessinez résine-catalyseur mélange dans la seringue de 3 ml. Retirer les bulles d'air par un léger effleurant la seringue et l'expulsion de bulles.
Remarque: pour la coulée de petites structures, il peut être utile d'utiliser une chambre à vide pour éliminer les bulles d'air de très petits èmee de résine et d'améliorer la qualité coulé. Pour permettre le temps d'effectuer cette étape, il sera nécessaire de diminuer le ratio catalyseur / résine de celle suggérée ci-dessus afin de ralentir durcissement de la résine. - Soigneusement remplacer PBS contenant seringue avec une seringue contenant une résine, en laissant l'aiguille de calibre 32 fixée à la canule.
- Poussez lentement et doucement la résine dans la veine porte ou de la voie biliaire jusqu'à ce que la résistance augmente et le foie est rempli.
- Utilisez un coton-tige humide pour masser doucement le foie et favoriser un même remplissage.
- Retirer la canule de la structure et rapidement re-serrer la ligature pour éviter les fuites de résine.
- Laissez la souris à plat à température ambiante pendant 20 minutes tout en la résine durcit, puis retirez le foie.
- Soit procéder à la compensation ou de la macération du foie.
7. Foie clair pour la visualisation in situ
- Fixer le foie dans du paraformaldéhyde 4% pendant une nuit à 4 ° C, à bascule.
- Laver le foiedans du PBS pendant au moins quatre heures, à bascule. À ce stade, vous pouvez séparer les lobes du foie si vous le souhaitez.
- Déshydrater dans du methanol à 50%, puis dans le méthanol à 100% pendant au moins quatre heures chacune, se balançant à la température ambiante.
- Effacer le foie dans une solution 1:2 de l'alcool benzylique et le benzoate de benzyle (BABB) pendant au moins 24 h, à bascule. Fois plus de temps de lavage peut être nécessaire. Si le foie ne disparaît pas complètement au bout de 2-3 jours, revenir à 100% de méthanol pendant 24 heures et répétez BABB compensation.
- Foie plonger dans BABB dans un plat en verre de Pétri pour l'imagerie in situ.
8. Faire macérer les tissus du foie
- Retirer le foie de la souris et placé dans un tube conique de 50 ml avec de l'eau. Attendre 1 heure pour le durcissement de résine complet. Lobes du foie séparés si désiré.
- Verser l'eau et se déplacer foie pour une bouteille en verre. Plonger dans 15% de KOH. Laissez sécher une nuit à température ambiante. Ne pas basculer.
- Versez délicatement hors de KOH et laver coulé dans de l'eau distillée. Remarque: le casting est very fragiles et doivent être manipulés avec précaution. Ne pas perturber la coulée lors de l'ajout ou le retrait de fluide à partir du tube.
- Lorsque moulé en résine est propre, poser délicatement sur une Kimwipe à sécher, puis transférer dans un conteneur pour être stocké.
9. Les résultats représentatifs
Une distribution réussie de la veine porte ou voie biliaire affiche un réseau continu de plus en plus petites branches s'étendant à partir de l'hile à la périphérie du foie.
La figure 1 montre une veine porte moulé comme visualisées in situ après BABB compensation. La figure 1A montre la distribution de la totalité lobe gauche du foie et de la forme et de la taille de la fonte. Figure 1B montre une vue rapprochée de la même coulée, ce qui démontre la pénétration de la résine dans les plus petites branches de la veine porte du foie périphérie.
La figure 2 montre une distribution veine porte qui a subi KOH mamilieu carcéral. Figure 2A montre le lobe hépatique gauche entier et la figure 2B est un gros plan sur les petites branches périphériques.
Cette technique a également été appliquée avec succès à la voie biliaire intrahépatique et publiés en utilisant à la fois la compensation BABB et les techniques de macération KOH 1,2,7.
Les problèmes courants incluent incomplète remplit, des bulles dans la résine, et déborder dans les systèmes environnants ou des tissus. Figure 3 montre comment reconnaître un remplissage incomplet (figure 3A), des bulles (figure 3A), et un trop-plein de résine de la veine porte à l' veine centrale (figure 3B).
Toutes les images sont prises en utilisant un Leica MZ 16 stéréoscope FA et QImaging Retiga 4000R caméra.
Figure 1. Coulée de résine BABB-débarrassée de gauche veine porte hépatique du lobe. Moulé en résine A. montre une structure hiérarchique de branchement s'étendant du hile à la périphérie du foie. Coulée de résine apparaît en jaune dans les lobes du foie bleutée. B. Une illustration montre que la résine de remplissage s'étend à de petites branches dans la périphérie du foie. La résine est blanchâtre à travers le foie effacé. Barre d'échelle = 1 mm.
Figure 2. Tissue-macérés résine coulée d'insuffisance hépatique veine porte gauche lobe. Résine A. jeté du lobe du foie entier montre de nombreuses branches de différentes tailles. B. Gros plan montre les petites branches en périphérie du foie. Adoucir l'aspect de petites branches représente résine de remplissage des espaces sinusoïdaux et peut ou peut ne pas être visible sur résine jette et augmenter la densité apparente branche si elle est présente. Résine est de couleur blanche. Barre d'échelle = 1 mm.
Figure 3. Problèmes courants avec des moulages en résine. A. Un remplissage incomplet de la veine porte lobe gauche est évident par tout ou partie des branches moulées à défaut d'étendre à la périphérie du foie. Cette fonte affiche également bulles, visible comme des ruptures dans la coulée continue (flèche). En raison de la proximité de la veine porte et la veine centrale de branches dans certains endroits B., la résine veine porte souvent entrer et remplir la veine centrale. Cela peut être reconnu quand il ya deux hilaires branches distinctes (flèches) et deux structures ramifiées qui ont des motifs différents et se chevauchent. Discrimination entre les erreurs techniques et les véritables altérations morphologiques qui peut être fait de deux manières. Tout d'abord, la structure de coulée doit être comparé à la structure attendue sur la base de 2-dimensionnelle d'analyse ou d'autres méthodes. Deuxièmement, il est important d'effectuer plusieurs répétitions, et, si possible, de quantifier la structureure et effectuer une analyse statistique pour déterminer la reproductibilité et s'il ya une altération significative morphologique entre et au sein des différents expérimentale et des bras de commande.
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Discussion
Nous avons décrit des exemples précis de la façon dont la veine porte et systèmes des voies biliaires intra-hépatiques du foie peut être lancé, mais cette technique peut être appliquée à n'importe quel autre système canalaire ou vasculaire avec de légères adaptations. Des travaux antérieurs ont démontré la faisabilité de cette technique dans de multiples espèces, y compris la souris 1,2,7-9, caneton, lapin 10,11 12,13, chien 14, 15, et le cochon et dans de nombreux organes, y compris glande nasale 14, coeur 16, la vessie 12,13, et le foie 1,2,7,8. Ces plâtres peuvent être utilisés pour comparer les systèmes multiples (par exemple, la veine porte et voie biliaire) dans le même tissu, la même structure dans les différents stades de développement 5, ou de l'effet sur une structure d'altérations génétiques ou environnementaux ou à des influences 1-4 , 6,7. L'application à grande échelle de cette technique à travers les espèces et les organes rend résine de coulée d'un outil très précieux pour studying la morphologie des structures vasculaires et canalaires et a le potentiel d'accroître considérablement nos connaissances sur le fonctionnement normal de ces structures ainsi que la façon dont ils sont affectés, ou comment ils affectent un organe, dans des modèles de maladies animales.
L'utilisation de résine de créer en 3 dimensions des moulages donne un aperçu permanent d'un système canalaire ou vasculaire et présente plusieurs avantages par rapport aux techniques similaires. Tout d'abord, la distribution peut être analysée comme une structure autonome après macération, offrant un avantage sur l'encre de Chine ou des injections d'encre similaires. Deuxièmement, la permanence de la structure augmente la facilité d'analyse. Enfin, la capacité de la résine MercOx II pour résister à la procédure de compensation BABB permet une capacité unique de visualiser une structure in situ au sein même des tissus de grandes ou dense.
Il existe plusieurs types de résine disponibles avec des caractéristiques différentes. MercOx II a été choisi pour cette technique pour ses nombreux advantages; MercOx II a une faible viscosité, ce qui lui permet de pénétrer petite veine porte et périphérique branches de la voie biliaire, il a durcissement rapide et complète à la température ambiante, indispensable pour l'analyse de la distribution autonome macération, il a un retrait minimal après durcissement, et résiste élimination de tissu BABB. Un autre type de résine, Microfil (Flowtech, Carver, MA), a été utilisée dans plusieurs études publiées 8,9,15. Comparativement, Microfil ne guérit pas complètement à température ambiante et est le meilleur visualisée par élimination de tissu. Microfil jette de la veine porte ont déjà été analysés à travers la fixation au formol à 10% et la compensation ultérieure avec du salicylate de ethanolmethyl 8.
Additifs de résine peuvent fournir des méthodes supplémentaires de visualisation coulé; addition de colorants colorés, des molécules fluorescentes ou de microsphères peut améliorer l'analyse. Une attention particulière doit être prise, cependant, veiller à ce que les molécules de colorant sont choisies suffisamment petites pour pénétrer l'intégrationnded structure vasculaire ou canalaire, qu'ils ne modifient pas sensiblement les propriétés de la résine, qui sont capables de résister à la compensation ou l'autre des tissus ou macération, et où elles sont compatibles avec le procédé de l'analyse souhaitée. Le choix des additifs de résine dépendra en grande partie de l'application spécifique: par exemple, des microsphères (Molecular Probes) sont trop grosses pour passer à travers les sinusoïdes hépatiques, les rendant impropres à l'étude de l'architecture sinusoïdale normale, mais un outil idéal pour étudier le développement de shunts porto-systémiques , qui sont suffisamment grands pour recevoir des microsphères, dans un modèle de souris génétiquement modifiées 8.
Enfin, l'analyse de coulée de résine peut être effectuée dans le plâtre soit compensées ou macération. BABB habilitation de moulages sont utiles pour mesurer la structure d'un système en ce qui concerne l'organe dans lequel il réside. KOH-macérés plâtres peuvent être analysées de plusieurs façons. Des études antérieures ont utilisé microscopie électronique à balayage (SEM) pour visualiser les réseaux microcirculation et la structure 12,13,17 navire. Plâtres peuvent également être quantifiés pour le numéro de succursale, le diamètre et le volume d'utilisation de microtomographie (microCT) 1,15,18, 19,20.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du National Institutes of Health (NIH) à SSH (R01-DK078640), du Howard Hughes Medical Institute (HHMI) à travers le Programme HHMI / Vanderbilt Certificat universitaire en médecine moléculaire à TJW (GRDOT56006779), le Vanderbilt recherche sur le diabète et Training Center (P30-DK020593) et la Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30-DK058404) la fourniture des services de base.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE10 polyethylene tubing | Fisher Scientific | 1417012P | |
| 5-0 surgical black braided silk | Roboz Surgical | SUT-15-1 | |
| Steriject 32 G x 13 mm needle | Air-tite | TSK3213 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Mercox II kit | Ladd Research | 21247 | |
| Benzyl alcohol | Fisher Scientific | 1816-04 | Only required for BABB-clearing |
| Benzyl benzoate | MP Biomedicals, LLC | 154839 | Only required for BABB-clearing |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Modeling clay | |||
| Scale | |||
| Laboratory scissors | |||
| 15 ml cap polypropylene tubes | |||
| 4% paraformaldahyde | |||
| 15% potassium hydroxide (KOH) | Only required for maceration | ||
| Razor blade | |||
| 100% methanol | |||
| 3 ml luer lock syringe |
References
- Sparks, E. E., Perrien, D. S., Huppert, K. A., Peterson, T. E., Huppert, S. S. Defects in hepatic Notch signaling result in disruption of the communicating intrahepatic bile duct network in mice. Dis. Model Mech. 4, 359-367 (2011).
- Vanderpool, C. Genetic interactions between hepatocyte nuclear factor-6 and notch signaling regulate mouse intrahepatic bile duct development in vivo. Hepatology. 55, 233-243 (2012).
- Meyer, E. P., Ulmann-Schuler, A., Staufenbiel, M., Krucker, T. Altered morphology and 3D architecture of brain vasculature in a mouse model for Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 3587-3592 (2008).
- Van Steenkiste, C. Vascular corrosion casting: analyzing wall shear stress in the portal vein and vascular abnormalities in portal hypertensive and cirrhotic rodents. Lab Invest. 90, 1558-1572 (2010).
- Dickie, R., Cormack, M., Semmler-Behnke, M., Kreyling, W. G., Tsuda, A. Deep pulmonary lymphatics in immature lungs. Journal of Applied Physiology. 107, 859-863 (2009).
- Kelly, D. M., McEntee, G. P., McGeenery, K. F., Fitzpatrick, J. M. Microvasculature of the pancreas, liver, and kidney in cerulein-induced pancreatitis. Archives of Surgery. 128, 293-295 (1993).
- Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).
- Carlson, T. R. Endothelial expression of constitutively active Notch4 elicits reversible arteriovenous malformations in adult mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9884-9889 (2005).
- Hemmeryckx, B., Emmerechts, J., Bovill, E. G., Hoylaerts, M. F., Lijnen, H. R. Effect of ageing on the murine venous circulation. Histochem. Cell Biol. , (2012).
- Hossler, F. E., Olson, K. R. Microvasculature of the nasal salt gland of the duckling, Anas platyrhynchos: quantitative responses to osmotic adaptation and deadaptation studied with vascular corrosion casting. J. Exp. Zool. 254, 237-247 (1990).
- Hossler, F. E., West, R. F. Venous valve anatomy and morphometry: studies on the duckling using vascular corrosion casting. Am. J. Anat. 181, 425-432 (1988).
- Hossler, F. E., Monson, F. C. Structure and blood supply of intrinsic lymph nodes in the wall of the rabbit urinary bladder--studies with light microscopy, electron microscopy, and vascular corrosion casting. Anat. Rec. 252, 477-484 (1998).
- Hossler, F. E., Monson, F. C. Evidence for a unique elastic sheath surrounding the vesicular arteries of the rabbit urinary bladder--studies of the microvasculature with microscopy and vascular corrosion casting. Anat. Rec. 252, 472-476 (1998).
- Hossler, F. E., Kao, R. L. Microvasculature of the urinary bladder of the dog: a study using vascular corrosion casting. Microsc. Microanal. 13, 220-227 (2007).
- Wischgoll, T., Choy, J. S., Kassab, G. S. Extraction of morphometry and branching angles of porcine coronary arterial tree from CT images. Am J Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1949-H1955 (2009).
- Hossler, F. E., Douglas, J. E., Douglas, L. E. Anatomy and morphometry of myocardial capillaries studied with vascular corrosion casting and scanning electron microscopy: a method for rat heart. Scan Electron Microsc. , 1469-1475 (1986).
- Hossler, F. E., Douglas, J. E. Vascular Corrosion Casting: Review of Advantages and Limitations in the Application of Some Simple Quantitative Methods. Microsc. Microanal. 7, 253-264 (2001).
- Mondy, W. L. Micro-CT of corrosion casts for use in the computer-aided design of microvasculature. Tissue Eng. Part C Methods. 15, 729-738 (2009).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Quantitative Assessment of the Rat Intrahepatic Biliary System by Three-Dimensional Reconstruction. The American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Hepatic Artery and Portal Vein Remodeling in Rat Liver: Vascular Response to Selective Cholangiocyte Proliferation. The American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).
