Summary
Um método de visualização e quantificação da estrutura 3-dimensional do rato da veia porta hepática ou ducto biliar intra-hepático é descrito. Esta técnica de fundição em resina pode também ser aplicada a outros sistemas do tipo ductal ou vascular e permite
Abstract
De órgãos, a arquitetura correta de estruturas vasculares e ductal é indispensável para a função fisiológica adequada, e a formação e manutenção de tais estruturas é um processo altamente regulado. A análise destes complexos, três estruturas tridimensionais grandemente dependia tanto exame 2-dimensional da secção ou em estudos de injecção de corante. Estas técnicas, no entanto, não são capazes de fornecer uma representação completa e quantificáveis das estruturas ductais ou vascular que se destinam a elucidar. Em alternativa, a natureza do 3-dimensional moldes de resina plástica permanente gera um instantâneo do sistema e é um novo e técnica amplamente útil para visualizar e quantificar as três estruturas tridimensionais e redes.
Uma vantagem decisiva do sistema de fundição de resina é a capacidade de determinar o intacto e ligado, ou comunicar a estrutura, de um vaso sanguíneo ou adesiva. A estrutura do vascular e ducredes mentais são cruciais para o funcionamento do órgão, e esta técnica tem o potencial para ajudar estudo das redes vasculares, e ductal de várias maneiras. Moldagem de resina pode ser usada para analisar a morfologia normal e arquitectura funcional de uma estrutura de luminal, identificar mudanças morfogenéticas do desenvolvimento, e descobrir diferenças morfológicas na arquitectura de tecido entre os estados normais e de doença. Os trabalhos anteriores resina de moldagem utilizado para estudar, por exemplo, defeitos de arquitectura e funcionais do sistema biliar intra-hepático do rato duto que não foram reflectidas em 2-dimensional análise da estrutura 1,2, alterações na vasculatura cerebral de rato um modelo de doença de Alzheimer 3 , portal anormalidades veia no Portal ratos hipertensos e cirróticos 4, etapas de desenvolvimento em maturação linfática rato entre pulmões imaturos e adultos, 5 imediatas alterações microvasculares no fígado de rato, pâncreas e rim em resposta a ferimentos em química6.
Aqui apresentamos um método de gerar um elenco resina 3-dimensional de uma rede vascular do mouse ou ductal, com foco específico na veia porta e ducto biliar intra-hepática. Estes moldes podem ser visualizadas através de compensação ou maceração do tecido e pode então ser analisada. Esta técnica pode ser aplicado a praticamente qualquer sistema vascular ou ductal e seriam directamente aplicáveis a qualquer estudo investigar o desenvolvimento, a função, a manutenção, ou lesão de uma estrutura 3-dimensional ductal ou vascular.
Protocol
1. Prepare Cânula
- Aqueça uma seção de uma polegada de comprimento da tubulação PE10 com os dedos e estique-lo para que o tubo se torna fina.
Nota: o tamanho do vaso ou conduta a ser canulada irá determinar o grau de estiramento necessário. A cânula deve ser bem esticado para ducto biliar lança, mas só podem ser obrigados a ser moderadamente esticada para caber dentro da veia maior portal. - Cortar o tubo estirado numa diagonal para gerar uma ponta biselada.
- Cortar a outra borda do tubo para criar um segmento de 5-6 cm.
- Inserir um calibre 32, agulha hipodérmica ½ polegada na extremidade não chanfrada do tubo.
2. Preparar seringa com PBS
- Encher uma seringa de 3 ml com PBS.
- Parafuso da seringa na agulha hipodérmica com anexo puxado PE10 tubos previamente preparado.
- Seringa Flick e empurrar o êmbolo da seringa para garantir que o PBS foi preenchido a agulha e tubagem eque não existem bolhas de ar na seringa.
- Coloque a seringa preparada com PBS em uma seringa porta-moldada de massa de modelar. Isto irá manter o suporte de seringa estável, enquanto o tubo é introduzido na conduta.
3. Outros Set-up
- Pesar 0,1 g de catalisador para um recipiente pequeno, por exemplo, um poço de uma placa de 24 poços.
- Puxar um ml de resina para uma seringa de 3 ml.
Nota: as quantidades relativas de catalisador e resina pode ser ajustada para alterar o tempo de cura. Decrescente quantidade de catalisador pode, no entanto, aumentar o encolhimento lançar e conduzir a um molde de menos desejável.
Nota: ao manusear resina, tomar precauções para evitar contato com a resina ou a inalação dos vapores de resina. Use sempre luvas e executar as etapas que envolvem a resina em uma área bem ventilada, como um capuz químico fumos - Cortar um pedaço de fio de seda de 5,0 a cerca de 5 polegadas a ser usado como uma ligadura.
4. Prepare Rato
Nota: este passo pode também ser performed com paraformaldeído a 4%, em vez de PBS. Utilização de paraformaldeído a 4% pode aumentar a integridade vascular e resultar em uma conversão mais precisa, mais especificamente de menores estruturas vasculares.
5. Canular veia extra-hepático Portal ou ducto biliar comum
- Fórceps curvos para passar a ligadura de sutura cirúrgica sob a veia porta ou ducto biliar, cerca de ¼ de polegada a partir do fígado.
- Amarre a sutura em um nó frouxo comum. NÃO apertar o nó.
- Se estiver a trabalhar com um sistema aberto, pode ser útil para ligar e apertar uma ligadura na outra extremidade do sistema. Se você abriu a veia comum cardeal para drenar o sangue da veia porta, amarrar uma ligadura ao redor para aumentar a pressão dentro da veia porta e evitar vazamento de resina para a veia hepática central.
- Use uma tesoura de mola para fazer um pequeno corte na veia porta ou ducto biliar, cerca de ¼ de polegada abaixo do nó da sutura. Este cut deve penetrar mais do que metade do diâmetro da veia porta ou ducto biliar.
- Usando fórceps # 5, manter a veia porta ou ducto biliar no local do corte e inserir extremidade chanfrada do tubo no canal biliar.
- Empurrar a ponta do tubo após a ligadura pré-amarrado e para o fígado.
- Teste de precisão canulação injetando PBS através da cânula e assistindo para ver se ele entra na veia porta ou ducto biliar.
- Apertar a ligadura para manter a cânula no lugar.
6. Resina Lançai a veia porta ou vias biliares intra
- Adicionar pré-medidos ml de resina de 1 a pré-medidos catalisador 0,1 g e misture bem. Evitar a geração de bolhas de ar.
- Desenhar resina-catalisador mistura para dentro da seringa de 3 ml. Remova todas as bolhas de ar delicadamente sacudindo a seringa e expulsando bolhas.
Nota: para a fundição de estruturas pequenas, pode ser útil utilizar uma câmara de vácuo para remover as bolhas de ar muito pequenas, a partir de thresina e melhorar a qualidade e elenco. Para permitir o tempo para executar este passo, é necessário para diminuir a proporção de catalisador / resina da sugerida acima, a fim de reduzir a velocidade de cura da resina. - Recolocá PBS contendo uma seringa de resina contendo uma seringa, deixando a agulha de calibre 32 ligada à cânula.
- Lentamente e empurre resina para a veia porta ou ducto biliar até aumenta a resistência e fígado está cheio.
- Use cotonete molhado para massagear suavemente fígado e incentivar o mesmo preenchimento.
- Remover cânula a partir da estrutura e rapidamente voltar a apertar a ligadura para evitar fugas de resina.
- Permitir rato para colocar o plano à temperatura ambiente durante 20 min, enquanto as curas de resina, em seguida, remover o fígado.
- Continue com o de limpeza ou maceração de fígado.
7. Fígado clara para visualização in situ
- Fixar o fígado em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 ° C, de balanço.
- Lavar o fígadoem PBS durante pelo menos quatro horas, de balanço. Neste ponto, você pode separar os lobos do fígado, se desejar.
- Desidratar em metanol a 50% e depois em metanol a 100% durante pelo menos quatro horas cada, agitando à temperatura ambiente.
- Limpar o fígado em uma solução 1:2 de álcool benzílico e de benzoato de benzilo (BABB) durante pelo menos 24 horas, de balanço. Vezes mais tempo de lavagem pode ser necessária. Se o fígado não desaparecer completamente após 2-3 dias, voltar a 100% de metanol por 24 horas e repetir BABB clareira.
- Fígado submergir em BABB numa placa de Petri de vidro para imagiologia in situ.
8. Macerar tecido hepático
- Remover fígado de rato e colocados em um tubo cónico de 50 ml com água. Aguarde 1 hora para a cura da resina completa. Lobos do fígado separado se desejar.
- Deitar fora a água e mover-se fígado de uma garrafa de vidro. Submerge em KOH 15%. Deixar durante a noite à temperatura ambiente. Não balance.
- Com cuidado, despeje fora KOH e lavar elenco em água destilada. Nota: o elenco é very frágil e deve ser tratado com extremo cuidado. Evite interromper o elenco ao adicionar ou remover fluido do tubo.
- Quando elenco resina é limpo, deite cuidadosamente em uma Kimwipe para secar, em seguida, transferir para um recipiente para ser armazenado.
9. Resultados representativos
Uma conversão bem sucedida da veia porta ou ducto biliar irá mostrar uma rede contínua de ramos progressivamente menores que se estendem a partir do hilo à periferia do fígado.
A Figura 1 mostra uma veia porta moldado como visualizado in situ após BABB compensação. Figura 1A mostra a conversão de todo o lobo hepático esquerdo e a forma e tamanho do molde. A Figura 1B mostra uma vista de perto do mesmo molde, demonstrando a a penetração da resina no interior dos pequenos ramos da veia porta, localizada na periferia do fígado.
A Figura 2 mostra um molde da veia porta que tenha sido submetido KOH ma2A ceration. figura mostra o lobo hepático esquerdo inteiro e figura 2B é um close-up dos pequenos ramos periféricos.
Essa técnica também tem sido aplicado com sucesso para o ducto biliar intra-hepática e publicado utilizando tanto a compensação BABB e técnicas de maceração KOH 1,2,7.
Os problemas comuns incluem incompleta enche, bolhas na resina, e em sistemas de transbordamento ou tecidos circundantes. Figura 3 demonstra a forma de reconhecer um preenchimento incompleto (Figura 3A), bolhas (Figura 3A), e um excesso de resina a partir da veia porta para o veia central (Figura 3B).
Todas as imagens são tiradas com uma Leica MZ 16 estereoscópio FA e QImaging RETIGA câmera 4000R.
Figura 1. Elenco resina BABB-limpo de hepático esquerdo da veia porta lobo. A. fundido Resina mostra uma estrutura hierárquica de ramificação que se estende desde o hilo à periferia do fígado. Elenco resina aparece na cor amarela dentro azulada hepática. B. Um fim acima mostra que de preenchimento de resina estende a pequenos ramos na periferia de fígado. A resina é esbranquiçada através do fígado limpa. Barra de escala = 1 mm.
Figura 2. Tissue-macerado em resina de hepático esquerdo da veia porta lobo. A. Resina elenco de lobo hepático todo mostra muitos ramos de tamanhos variados. B. Close-up mostra pequenos ramos na periferia do fígado. Empenamento aparecimento de pequenos ramos representa resina de enchimento dos espaços sinusoidais e podem ou não ser visíveis na resina molda e vai aumentar a densidade aparente ramo, se presente. A resina é na cor branca. Barra de escala = 1 mm.
Figura 3. Problemas comuns com moldes de resina. A. Uma preenchimento incompleto da veia portal lóbulo é aparente por alguns ou todos os ramos fundido deixando de estender para a periferia do fígado. Este fundido também exibe bolhas, visível como quebras na fundição contínua (seta). B. Devido à proximidade da veia porta e ramos da veia central em alguns lugares, a resina da veia porta, muitas vezes, entrar e encher a veia central. Isto pode ser reconhecido quando existem dois distintos ramos hilares (setas) e duas estruturas ramificadas que possuem diferentes padrões e sobreposições. Discriminação entre erros técnicos e verdadeiras alterações morfológicas pode ser feito de duas maneiras. Em primeiro lugar, a estrutura de molde deveria ser comparada com a estrutura esperada com base na 2-dimensional ou de outros métodos de análise. Segundo, é importante realizar várias repetições, e quando possível, quantificar o structure e realizar a análise estatística para determinar a reprodutibilidade e, se houver uma alteração estatisticamente significativa morfológica entre e dentro experimental diferentes e braços de controlo.
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Discussion
Nós descrevemos exemplos específicos de como a veia portal e sistemas de vias biliares intra-hepáticos do fígado pode ser fundido, mas esta técnica pode ser aplicado a virtualmente qualquer outro sistema ductal ou vascular com pequenas adaptações. Os trabalhos anteriores demonstraram a viabilidade desta técnica, em várias espécies, incluindo o mouse 1,2,7-9, patinho 10,11, coelho 12,13, cão 14, e suíno de 15, e em muitos órgãos, inclusive da glândula nasal 14, coração 16, 12,13 bexiga, fígado e 1,2,7,8. Esses moldes podem ser usados para comparar vários sistemas (por exemplo, a veia portal e ducto biliar) dentro do mesmo tecido, a mesma estrutura em diferentes estágios de desenvolvimento 5, ou o efeito de uma estrutura de alterações genéticas ou ambientais ou influências 1-4 , 6,7. A ampla aplicação desta técnica entre espécies e órgãos faz resina lançando uma ferramenta de grande valor para studying a morfologia das estruturas vasculares e ductal e tem o potencial de aumentar muito o nosso conhecimento da função normal destas estruturas, bem como a forma como eles são afectados, ou como afectam um órgão, em modelos de doença em animais.
O uso de resina para criar 3-dimensional moldes fornece um instantâneo permanente de um sistema ductal ou vascular e tem várias vantagens sobre as técnicas similares. Primeiro, o elenco pode ser analisada como uma estrutura independente após maceração, oferecendo uma vantagem sobre nanquim ou injeções de tinta similares. Em segundo lugar, a permanência da estrutura aumenta a facilidade de análise. Por fim, a capacidade da resina Mercox II para suportar o processo de compensação BABB permite uma capacidade única para visualizar uma estrutura in situ no interior de tecidos, mesmo grandes ou densos.
Existem vários tipos de resina disponível com diferentes características. Mercox II foi escolhido para essa técnica para o seu adv muitosantages; Mercox II tem uma baixa viscosidade, o que permite a sua penetração pequena veia porta periférica e ramos ducto biliar, que tem de cura rápida e completa à temperatura ambiente, essencial para a análise do elenco stand-alone macerada, tem o encolhimento mínimo, quando curada, e resiste BABB compensação tecido. Um outro tipo de resina, Microfil (Flowtech, Carver, MA), tem sido utilizado em vários estudos publicados 8,9,15. Comparativamente, Microfil não cura completamente, à temperatura ambiente e é melhor visualizado através da limpeza de tecidos. Microfil lança da veia porta foram previamente analisados por meio de fixação de 10% de formalina e compensação posterior com salicilato ethanolmethyl 8.
Aditivos de resina podem fornecer métodos adicionais de visualização fundido; adição de corantes, moléculas fluorescentes ou as microesferas podem melhorar a análise. Consideração deve ser tomada, no entanto, para assegurar que as moléculas de corantes escolhidos são suficientemente pequenas para penetrar no inteestrutura vascular ou ductal nded, que não altera significativamente as propriedades da resina, que são capazes de suportar um ou outro tecido de compensação ou de maceração, e que sejam compatíveis com o método de análise desejada. Escolhendo aditivos de resina dependerá em grande parte da aplicação específico: por exemplo, as microesferas (Molecular Probes) são demasiado grandes para passar através dos sinusóides hepáticas, o que os torna inadequados para o estudo da arquitetura sinusoidal normal, mas uma ferramenta perfeita para investigar o desenvolvimento de shunts portossistêmicos , que são suficientemente grandes para acomodar microesferas, em um modelo de rato geneticamente alterado 8.
Finalmente, a análise de fundição em resina pode ser realizada em moldes ou compensados ou maceradas. BABB limpou-moldes são úteis para medir a estrutura de um sistema, uma vez que se relaciona com o órgão no qual ele reside. KOH-maceradas moldes podem ser analisadas de várias maneiras. Estudos anteriores usaram microscopia eletrônica de varredura (SEM) para visualizar redes microcirculação e estrutura vaso 12,13,17. Moldes também pode ser quantificada para número da agência, diâmetro e volume com o uso de tomografia microcomputed (microCT) 1,15,18, 19,20.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) para SSH (R01-DK078640), do Howard Hughes Medical Institute (HHMI), através do Programa de Certificação HHMI / Vanderbilt University em Medicina Molecular para TJW (GRDOT56006779), o Vanderbilt Diabetes Research e Centro de Treinamento (P30-DK020593) eo Digestivo Vanderbilt Disease Research Center (P30-DK058404) fornecendo serviços principais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE10 polyethylene tubing | Fisher Scientific | 1417012P | |
| 5-0 surgical black braided silk | Roboz Surgical | SUT-15-1 | |
| Steriject 32 G x 13 mm needle | Air-tite | TSK3213 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Mercox II kit | Ladd Research | 21247 | |
| Benzyl alcohol | Fisher Scientific | 1816-04 | Only required for BABB-clearing |
| Benzyl benzoate | MP Biomedicals, LLC | 154839 | Only required for BABB-clearing |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Modeling clay | |||
| Scale | |||
| Laboratory scissors | |||
| 15 ml cap polypropylene tubes | |||
| 4% paraformaldahyde | |||
| 15% potassium hydroxide (KOH) | Only required for maceration | ||
| Razor blade | |||
| 100% methanol | |||
| 3 ml luer lock syringe |
References
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