Summary
Un método para visualizar y cuantificar la estructura 3-dimensional de la vena portal hepática del ratón o del conducto biliar intrahepático se describe. Esta técnica de colada de resina también se puede aplicar a otros sistemas de conductos o vascular y permite
Abstract
En los órganos, la arquitectura correcta de las estructuras vasculares y ductal es indispensable para la función fisiológica adecuada, y la formación y el mantenimiento de estas estructuras es un proceso altamente regulado. El análisis de estos complejos, 3-dimensional estructuras ha dependido en gran medida en cualquiera de examen 2-dimensional en la sección o en estudios de inyección de tinte. Estas técnicas, sin embargo, no son capaces de proporcionar una representación completa y cuantificable de las estructuras ductales o vascular que están destinados a elucidar. Alternativamente, la naturaleza de la 3-dimensional moldes de resina de plástico genera una instantánea permanente del sistema y es una técnica novedosa y muy útil para visualizar y cuantificar 3-dimensional estructuras y redes.
Una ventaja fundamental del sistema de colada de resina es la capacidad de determinar la intactos y conectados, o comunicando, la estructura de un vaso sanguíneo o conducto. La estructura de vascular y ducredes ambientales son cruciales para la función del órgano, y esta técnica tiene el potencial de contribuir a al estudio de las redes vasculares y ductal de varias maneras. La resina de moldeo se puede utilizar para analizar la morfología normal y la arquitectura funcional de una estructura luminal, identificar cambios en el desarrollo morfogenéticas, y descubrir diferencias morfológicas en la arquitectura del tejido entre los estados normales y de enfermedad. El trabajo previo ha utilizado resina de colada para estudiar, por ejemplo, defectos arquitectónicos y funcionales en el sistema de ratón conducto biliar intrahepático que no se reflejaron en 2-dimensional análisis de la estructura 1,2, alteraciones en la vasculatura del cerebro de un modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer 3 , anomalías de la vena porta en el portal de ratones hipertensos y cirróticos 4, etapas de desarrollo en la maduración de los pulmones de ratas linfático entre inmaduros y adultos 5 e inmediatos cambios microvasculares en el hígado de la rata, el páncreas y el riñón en respuesta a una lesión en la química6.
Aquí presentamos un método para generar un molde de resina 3-dimensional de una red vascular o ductal ratón, se centra específicamente en la vena porta y el conducto biliar intrahepático. Estos moldes se pueden visualizar en la limpieza o la maceración del tejido y luego se puede analizar. Esta técnica se puede aplicar prácticamente a cualquier sistema vascular o ductal y sería directamente aplicable a cualquier estudio investigando el desarrollo, función, mantenimiento, o lesión de una estructura 3-dimensional ductal o vascular.
Protocol
1. Preparar Cánula
- Calentar una larga sección de 1 pulgada de tubería PE10 con los dedos y estirar de manera que la tubería se adelgaza.
Nota: el tamaño del vaso o conducto a ser canulado determinará el grado de estiramiento requerido. La cánula debe estar bien estirado por conducto biliar echa pero sólo puede ser requerido para ser moderadamente estirado para caber dentro de la vena portal mayor. - Cortar el tubo estirado en diagonal para generar una punta biselada.
- Cortar el otro borde de la tubería para crear un segmento de 5-6 cm.
- Inserte un calibre 32, una aguja hipodérmica ½ pulgada en el borde no biselado de la tubería.
2. Preparar Jeringuilla con PBS
- Llene una jeringa de 3 ml con PBS.
- Enrosque la jeringa en la aguja hipodérmica con adjunto sacó PE10 tubo previamente preparado.
- Flick jeringa y el émbolo de jeringa de empuje para asegurar que el PBS ha llenado la aguja y el tubo yque no haya burbujas de aire en la jeringa.
- Coloque la jeringa preparada con PBS en una jeringa titular en forma de plastilina. Este soporte se mantenga la jeringa firme mientras el tubo se inserta en el conducto.
3. Otro Set-up
- Pesar 0,1 g de catalizador en un recipiente pequeño, por ejemplo, un pocillo de una placa de 24 pocillos.
- Tire de 1 ml de resina en una jeringa de 3 ml.
Nota: las cantidades relativas de catalizador y la resina puede ajustarse para alterar el tiempo de curado. La disminución de la cantidad de catalizador puede, sin embargo, aumentar la contracción y emitir conducir a un reparto menos deseable.
Nota: al manipular resina, tome precauciones para evitar el contacto con la resina o la inhalación de los vapores de resina. Siempre use guantes y siga los pasos que involucran la resina en un lugar bien ventilado, como una campana química - Cortar una pieza de sutura de seda 5,0 de aproximadamente 5 pulgadas para ser utilizados como una ligadura.
4. Preparar Ratón
Nota: este paso también puede ser perforadarmó con 4% de paraformaldehído en lugar de PBS. El uso de paraformaldehído al 4% puede incrementar la integridad vascular y dar como resultado un reparto más preciso, específicamente de las pequeñas estructuras vasculares.
5. Canular la vena portal extrahepática o conducto biliar común
- Use pinzas curvas para pasar la ligadura de sutura quirúrgico debajo de la vena portal o conducto biliar, aproximadamente ¼ de pulgada desde el hígado.
- Ate la sutura en un nudo flojo común. NO apretar el nudo.
- Si está trabajando con un sistema abierto, puede ser útil para atar y apretar la ligadura en el otro extremo del sistema. Si ha abierto la vena cardinal común para drenar la sangre de la vena portal, atar una ligadura alrededor de ella para aumentar la presión dentro de la vena porta y prevenir fugas de resina en la vena hepática central.
- Con unas tijeras de primavera para hacer un pequeño corte en la vena porta o conducto biliar, aproximadamente ¼ de pulgada por debajo del nudo de sutura. Este cut debe penetrar en no más de la mitad del diámetro de la vena porta o conducto biliar.
- Utilizando # 5 fórceps, mantenga la vena porta o conducto biliar en el lugar del corte e insertar el extremo biselado de la tubería en el conducto biliar.
- Empuje la punta de la tubería más allá de la ligadura pre-atado y hacia el hígado.
- Prueba de exactitud para la canulación mediante la inyección de PBS a través de la cánula y observando para ver si entra en la vena portal o conducto biliar.
- Apretar la ligadura para sujetar la cánula en su lugar.
6. Resina: Echad la vena porta o conducto biliar intrahepática
- Añadir predosificado 1 ml de resina a medida previamente 0,1 g de catalizador y mezclar bien. Evitar la generación de burbujas de aire.
- Dibujar resina-catalizador mezcla de nuevo en la jeringa de 3 ml. Eliminar las burbujas de aire agitando suavemente la jeringa y la expulsión de burbujas.
Nota: para la fundición de estructuras pequeñas, puede ser útil usar una cámara de vacío para eliminar las burbujas de aire muy pequeñas de the resina y mejorar la calidad del elenco. Para permitir el tiempo para realizar este paso, será necesario disminuir la relación catalizador / resina de la que se sugiere más arriba con el fin de retardar el curado de resina. - Vuelva a colocar cuidadosamente PBS que contiene jeringa con resina que contiene la jeringa, dejando la aguja de calibre 32 unida a la cánula.
- Lentamente y suavemente empuje de resina en la vena portal o conducto biliar hasta que la resistencia aumenta y el hígado se llena.
- Utilice hisopo de algodón húmedo para masajear suavemente el hígado y promover un relleno uniforme.
- Retire la cánula de la estructura y rápidamente volver a apretar la abrazadera para evitar fugas de resina.
- Permitir ratón para poner completamente a temperatura ambiente durante 20 min mientras se cura la resina, a continuación, quitar el hígado.
- Proceder a la limpieza ya sea o macerar el hígado.
7. Hígado transparente para la visualización in situ
- Fijar el hígado en 4% de paraformaldehído durante la noche a 4 ° C, balanceo.
- Lavar el hígadoen PBS durante al menos cuatro horas, balanceo. En este punto, es posible separar los lóbulos hepáticos si se desea.
- Deshidratar en 50% de metanol y después en 100% de metanol durante al menos cuatro horas cada uno, balanceo a temperatura ambiente.
- Borrar el hígado en una solución 1:2 de alcohol bencílico y benzoato de bencilo (BABB) durante al menos 24 h, de balanceo. Tiempos de lavado más prolongado puede ser necesaria. Si el hígado no desaparece por completo después de 2-3 días, se mueven de nuevo al 100% de metanol durante 24 horas y repita BABB claro.
- Sumergir hígado en BABB en un plato de Petri de vidrio para formación de imágenes in situ.
8. Macerar tejido hepático
- Retire hígado de ratón y poner en un tubo cónico de 50 ml con agua. Espere 1 hora para el curado de resina completa. Lóbulos separados hígado si se desea.
- Vierta el agua y mover el hígado a una botella de vidrio. Sumerja en el 15% de KOH. Dejar toda la noche a temperatura ambiente. No balancee.
- Con cuidado, vierta KOH y lavar yeso en agua destilada. Nota: el elenco es very frágiles y deben manejarse con sumo cuidado. Evite interrumpir el elenco al añadir o eliminar líquido del tubo.
- Cuando resina fundida es limpio, suavemente yacía en un Kimwipe se seque, luego transferir a un contenedor para ser almacenado.
9. Los resultados representativos
Un molde de éxito de la vena portal o conducto biliar mostrará una red continua de ramas progresivamente más pequeños que se extienden desde el hilio a la periferia del hígado.
La figura 1 muestra una vena portal emitir tal como se visualiza en situ después de BABB claro. Figura 1A muestra el reparto del lóbulo hepático izquierdo entero y la forma y el tamaño del molde. Figura 1B muestra una vista en primer plano de la misma colada, lo que demuestra la la penetración de la resina dentro de las ramas más pequeñas vena porta en la periferia del hígado.
La Figura 2 muestra un molde de la vena porta que ha sido objeto de KOH maceration. Figura 2A muestra el lóbulo izquierdo del hígado y la Figura 2B es un primer plano de las ramas periféricas pequeñas.
Esta técnica también se ha aplicado con éxito para el conducto biliar intrahepático y publicado utilizando tanto la compensación BABB y técnicas de KOH maceración 1,2,7.
Los problemas comunes incluyen incompleta llena, las burbujas en la resina, y el desbordamiento en los sistemas circundantes o tejidos. Figura 3 se muestra cómo reconocer un llenado incompleto (Figura 3A), burbujas (Figura 3A), y un exceso de resina de la vena porta a la vena central (Figura 3B).
Todas las imágenes son tomadas con una Leica MZ 16 estereoscopio FA y QImaging Retiga cámara 4000R.
Figura 1. BABB con despacho de fundición de resina de lóbulo hepático izquierdo vena portal. Reparto A. Resina muestra una estructura jerárquica de ramificación se extiende desde el hilio a la periferia del hígado. Fundido Resina aparece en color amarillo en lóbulo hepático azulado. B. Un primer plano muestra que la resina de relleno se extiende a las ramas pequeñas en la periferia del hígado. La resina es blanquecino a través del hígado despejado. Barra de escala = 1 mm.
Figura 2. Tissue-macerada en resina de lóbulo hepático izquierdo vena portal. Resina A. echado de lóbulo hepático entero muestra muchas ramas de diferentes tamaños. B. Primer plano muestra las ramas pequeñas en la periferia del hígado. Fundido de aparición de pequeñas ramas representa llenado de resina de espacios sinusoidales y puede o no puede ser visible en resina arroja y aumentará la densidad aparente rama si está presente. La resina es de color blanco. Barra de escala = 1 mm.
Figura 3. Problemas comunes con los moldes de resina. A. Un llenado incompleto de la vena portal lóbulo izquierdo es evidente por algunas o todas las ramas del elenco no extender a la periferia del hígado. Este reparto también muestra burbujas, visibles como grietas en la colada continua (flecha). Debido a la proximidad de la vena porta y de la vena central de ramas en algunos lugares B., la resina de la vena porta a menudo entrar y llenar la vena central. Esto se puede reconocer cuando hay dos ramas distintas del hilio (flechas) y dos estructuras ramificadas que tienen patrones diferentes y superpuestas. Discriminar entre los errores técnicos y verdaderas alteraciones morfológicas se puede hacer de dos maneras. En primer lugar, la estructura de fundición debe ser comparado con la estructura esperada sobre la base de 2-dimensional análisis u otros métodos. En segundo lugar, es importante llevar a cabo varias repeticiones, y cuando sea posible, cuantificar la structUre y el análisis estadístico para determinar la reproducibilidad y si hay una alteración morfológica estadísticamente significativa entre y dentro experimental diferente y los brazos de control.
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Discussion
Hemos descrito ejemplos específicos de cómo la vena porta y sistemas de conductos intrahepáticos biliares del hígado se puede convertir, pero esta técnica se puede aplicar a prácticamente cualquier otro sistema ductal o vascular con ligeras adaptaciones. Trabajos anteriores han demostrado la viabilidad de esta técnica en varias especies, incluyendo ratón 1,2,7-9, Patito, conejo 10,11 12,13, 14 perro y el cerdo 15, y en muchos órganos, incluyendo la glándula nasal 14, corazón 16, 12,13 vejiga, hígado y 1,2,7,8. Estos moldes pueden ser utilizados para comparar múltiples sistemas (por ejemplo, la vena porta y el conducto biliar) dentro del mismo tejido, la misma estructura a través de diferentes etapas de desarrollo 5, o el efecto sobre una estructura de alteraciones genéticas o ambientales o influencias 1-4 , 6,7. La amplia aplicación de esta técnica a través de especies y órganos hace resina de colada en una herramienta muy valiosa para studying la morfología de las estructuras vasculares y ductal y tiene el potencial para aumentar enormemente nuestro conocimiento de la función normal de estas estructuras, así como la forma en que se ven afectados, o cómo afectan a un órgano, en modelos de enfermedades animales.
La utilización de resina para crear 3-dimensionales moldes proporciona una instantánea permanente de un sistema ductal o vascular y tiene varias ventajas sobre técnicas similares. En primer lugar, el molde se puede analizar como una estructura independiente después de maceración, que ofrece una ventaja sobre la tinta de la India o inyecciones similares de tinta. En segundo lugar, la permanencia de la estructura aumenta la facilidad de análisis. Por último, la capacidad de la resina Mercox II para soportar el procedimiento de compensación BABB permite una capacidad única para visualizar una estructura in situ, incluso dentro de los tejidos grandes o densos.
Hay varios tipos de resina disponibles con distintas características. Mercox II ha sido elegido para esta técnica por sus muchos advantages; Mercox II tiene una viscosidad baja, que le permite penetrar pequeña vena portal periférica y las ramas de los conductos biliares, que tiene de curado rápida y completa a temperatura ambiente, esencial para analizar el reparto independiente macerada, tiene una contracción mínima cuando se cura, y se resiste compensación BABB tejido. Otro tipo de resina, Microfil (Flowtech, Carver, MA), se ha utilizado en varios estudios publicados 8,9,15. Comparativamente, Microfil no cura completamente a temperatura ambiente y se visualiza mejor a través de limpieza de tejidos. Microfil moldes de la vena porta han sido previamente analizados a través de la fijación con formalina al 10% y de compensación posterior con salicilato ethanolmethyl 8.
Aditivos de resina puede proporcionar métodos adicionales de visualización colado; adición de tintes coloreados, moléculas fluorescentes, o microesferas puede mejorar el análisis. Se debe tener cuidado, sin embargo, para asegurar que las moléculas de colorante elegidos son suficientemente pequeñas para penetrar la intended estructura vascular o ductal, que no altera significativamente las propiedades de la resina, que son capaces de soportar cualquiera de compensación tejido o maceración, y que sean compatibles con el método de análisis deseado. Selección de aditivos de resina dependerá en gran medida de la aplicación específica: por ejemplo, las microesferas (Molecular Probes) son demasiado grandes para pasar a través de los sinusoides hepáticos, que los hace inadecuados para el estudio de la arquitectura sinusoidal normal, pero una herramienta perfecta para investigar el desarrollo de derivaciones portosistémicas , que son lo suficientemente grandes para acomodar microesferas, en un modelo de ratón alterado genéticamente 8.
Por último, el análisis de resina epoxi de colada se puede realizar en cualquiera de los dos moldes despejadas o macerado. BABB-aclaró moldes son útiles para medir la estructura de un sistema en que se refiere al órgano en el que reside. KOH-maceradas moldes se puede analizar de varias maneras. Estudios anteriores han utilizado microscopía electrónica de barrido (SEM) para visualizar las redes de la microcirculación y la estructura buque 12,13,17. Los yesos se puede cuantificar por el número de ramas, diámetro y volumen con el uso de tomografía microcomputarizada (microCT) 1,15,18, 19,20.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) a SSH (R01-DK078640), del Howard Hughes Medical Institute (HHMI) a través del Programa de Certificación HHMI / Vanderbilt University de Medicina Molecular para TJW (GRDOT56006779), el Vanderbilt Diabetes Centro de Investigación y Capacitación (P30-DK020593) y la Digestive Disease Research Vanderbilt Center (P30-DK058404) la prestación de servicios básicos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE10 polyethylene tubing | Fisher Scientific | 1417012P | |
| 5-0 surgical black braided silk | Roboz Surgical | SUT-15-1 | |
| Steriject 32 G x 13 mm needle | Air-tite | TSK3213 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Mercox II kit | Ladd Research | 21247 | |
| Benzyl alcohol | Fisher Scientific | 1816-04 | Only required for BABB-clearing |
| Benzyl benzoate | MP Biomedicals, LLC | 154839 | Only required for BABB-clearing |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Modeling clay | |||
| Scale | |||
| Laboratory scissors | |||
| 15 ml cap polypropylene tubes | |||
| 4% paraformaldahyde | |||
| 15% potassium hydroxide (KOH) | Only required for maceration | ||
| Razor blade | |||
| 100% methanol | |||
| 3 ml luer lock syringe |
References
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