Summary
En metod för visualisering och kvantifiering av 3-dimensionella strukturen av mus hepatisk portvenen eller intrahepatisk gallgången beskrivs. Detta harts gjutna teknik kan också tillämpas på andra duktala eller vaskulära system och medger
Abstract
Med organ, är den korrekta arkitekturen av vaskulära och duktal strukturer oumbärlig för korrekt fysiologisk funktion, och bildandet och upprätthållandet av dessa strukturer är en mycket reglerad process. Analysen av dessa komplexa, 3-dimensionella strukturer har i hög grad beroende av antingen 2-dimensionell undersökning i avsnitt eller färgämne injektion studier. Dessa tekniker är dock inte kan ge en fullständig och kvantifierbar representation av duktal eller vaskulära strukturer som de är avsedda att belysa. Alternativt genererar arten av 3-dimensionella plastharts kastar en permanent ögonblicksbild av systemet och är ett nytt och brett användbar teknik för att visualisera och kvantifiera 3-dimensionella strukturer och nätverk.
En avgörande fördel med hartset gjutsystemet är förmågan att bestämma den intakta och anslutna, eller kommunicerar, strukturen hos ett blodkärl eller kanal. Strukturen av vaskulär och ductal nätverk är avgörande för organfunktion, och denna teknik har potential att underlätta studier av vaskulära och duktal nätverk på flera sätt. Harts gjutning kan användas för att analysera normala morfologi och funktionella arkitektur av en luminal struktur, identifiera utvecklingsmässiga morfogenetiska förändringar och avslöja morfologiska skillnader i vävnad arkitektur mellan normala och sjukdomstillstånd. Tidigare arbete har utnyttjat harts gjutning studera till exempel arkitektoniska och funktionella defekter i musen intrahepatiska gallgången system som inte återspeglas i 2-dimensionell analys av strukturen 1,2, förändringar i hjärnans kärlsystem av Alzheimers sjukdom musmodell 3 , portvenen avvikelser i portalen hypertensiva och cirrotiska möss 4, utvecklande steg i råtta lymfatiska mognad mellan omogna och vuxna lungor 5, omedelbara mikrovaskulära förändringar i råtta lever, bukspottkörtel och njure som svar på kemisk skada6.
Här presenterar vi en metod för att generera en 3-dimensionell harts avgjutning av en mus vaskulär eller duktal nätverk, med särskild inriktning på portalen ven och intrahepatisk gallgången. Dessa kastar kan visualiseras genom att rensa eller urlakning av vävnaden och kan sedan analyseras. Denna teknik kan tillämpas på praktiskt taget alla kärl eller duktal systemet och skulle vara direkt tillämpliga på någon undersökning frågat om utveckling, funktion, underhåll eller skada av en 3-dimensionell duktal eller vaskulär struktur.
Protocol
1. Förbered kanyl
- Värm en 1-tums lång sektion av PE10 rör med fingertopparna och sträcka den så att slangen blir tunn.
Anmärkning: fartygets storlek eller kanal som ska kanylerad kommer att avgöra graden av sträckning som krävs. Kanylen måste väl sträckt för gallgången kastar men får endast krävas att måttligt sträcks för att passa in i den större portvenen. - Skär sträckta slangen vid en diagonal för att generera en avfasad spets.
- Skär den andra kanten av slangen för att skapa en 5-6 tum segment.
- Sätt en 32 gauge, ½ tum injektionsnål in i den icke-avfasade kanten av röret.
2. Förbered Spruta med PBS
- Fyll en 3 ml spruta med PBS.
- Skruva fast sprutan på injektionsnålen med vidhängande drog PE10 rör tidigare framställts.
- Flick sprutan och tryck sprutkolven att PBS har fyllt nålen och slangen ochdet finns inga luftbubblor i sprutan.
- Placera den förberedda sprutan med PBS i en spruta-hållare formad ur modellera. Denna hållare håller sprutan stadigt medan slangen är införd i kanalen.
3. Andra Set-up
- Väg 0,1 g katalysator i en liten behållare, t.ex. en brunn i en 24-brunnsplatta.
- Dra 1 ml harts i en 3 ml spruta.
Obs: de relativa mängderna av katalysator och harts kan justeras för att ändra härdningstiden. Minskande mängd katalysator kan emellertid öka kasta krympning och leda till en mindre önskvärd rösterna.
Observera: när du hanterar harts, vidta försiktighetsåtgärder för att undvika kontakt med harts eller inandning av harts rök. Använd alltid handskar och utför steg som berör harts i en väl ventilerad plats, till exempel en dragskåp - Klipp en bit av 5,0 silkesutur av ungefär 5 inches som skall användas som en ligatur.
4. Förbered Mus
Obs: detta steg kan också vara performed med 4% paraformaldehyd istället PBS. Användning av 4% paraformaldehyd kan öka vaskulär integritet och resultera i en mer exakt gjuten, särskilt av mindre vaskulära strukturer.
5. Kannulera ven Extrahepatisk Portal eller gallgången
- Använd böjda pincett att passera den kirurgiska suturen ligaturen under portvenen eller gallgången, ca ¼ tum från levern.
- Knyt suturen i en lös gemensam knut. Dra inte åt knuten.
- Om du arbetar med en öppen systemet kan det vara bra att binda och dra en ligatur vid den andra änden av systemet. Om du har öppnat den gemensamma kardinal ven att tömma blodet från portvenen, knyt en ligatur runt den för att öka trycket i portalen ven och förhindra harts läckage till centrala nedsatt ven.
- Använd vår sax för att göra ett litet snitt i portalen ven eller gallgången, ca ¼ tum under sutur knuten. Detta cut borde tränga mer än halvvägs genom diametern av portalen ven eller gallgången.
- Använda # 5 pincett, håll portvenen eller gallgången vid stället för snittet och sätt avfasade änden av slangen i gallgången.
- Tryck spets rör förbi före-bundna ligatur och mot levern.
- Test för kanylering noggrannhet genom att injicera PBS genom kanylen och tittar för att se om det kommer in i portalen ven eller gallgången.
- Dra ligaturen för att hålla kanylen på plats.
6. Harts Kasta portvenen eller Intrahepatisk Bile Duct
- Lägg förväg uppmätta 1 ml harts i förväg uppmätta 0,1 g katalysator och blanda väl. Undvika att skapa luftbubblor.
- Rita harts-katalysatorblandningen tillbaka till 3 ml-sprutan. Ta bort eventuella luftbubblor genom att försiktigt vicka sprutan och utvisning bubblor.
Anmärkning: för gjutning små strukturer, kan det vara till hjälp att använda en vakuumkammare för att avlägsna mycket små luftbubblor från the harts och förbättra gjutna kvalitet. För att möjliggöra tid för att utföra detta steg kommer det att bli nödvändigt att minska katalysator / kåda förhållande från det föreslås ovan för att bromsa harts härdning. - Försiktigt ersätta PBS-innehållande spruta med hartsinnehållande spruta, lämnar 32 nål fäst till kanylen.
- Långsamt och försiktigt skjuta harts i portvenen eller gallgången tills motståndet ökar och lever är fylld.
- Använd våt bomullstuss att försiktigt massera lever och uppmuntra en jämn fyllning.
- Ta kanyl från strukturen och snabbt dra åt ligaturen för att förhindra harts läckage.
- Tillåt musen att ligga platt vid rumstemperatur under 20 min medan hartset härdar, sedan bort levern.
- Fortsätt med antingen rensa eller urlakning av levern.
7. Klar Lever för visualisering in situ
- Fäst levern i 4% paraformaldehyd över natten vid 4 ° C, gunga.
- Tvätta leverni PBS under minst fyra timmar, gunga. Vid det här laget kan du separera levern lober om så önskas.
- Torka i 50% metanol och därefter i 100% metanol i minst fyra timmar vardera, gunga vid rumstemperatur.
- Rensa levern i ett 1:2 lösning av bensylalkohol och bensylbensoat (BABB) i minst 24 timmar, gunga. Längre tider tvätta kan behövas. Om levern inte klart helt efter 2-3 dagar, gå tillbaka till 100% metanol under 24 timmar och upprepa BABB clearing.
- Sänk lever i Babb i ett glas petriskål för avbildning på plats.
8. Blöta levervävnad
- Avlägsna lever från mus och placerades i en 50 ml koniskt rör med vatten. Vänta 1 timme för fullständig harts härdning. Separata lever lober, om så önskas.
- Häll av vatten och flytta levern till en glasflaska. Sänk i 15% KOH. Låt stå över natten vid rumstemperatur. Vicka inte.
- Häll försiktigt av KOH och tvätta gjutna i destillerat vatten. Anmärkning: gjutna är very bräcklig och bör hanteras med stor försiktighet. Inte störa den gjutna när du lägger till eller tar bort vätska från röret.
- När harts rösterna är ren, försiktigt lägga på en Kimwipe att torka, sedan överföra till en behållare som skall lagras.
9. Representativa resultat
En framgångsrik avgjutning av portalen ven eller gallgången visar ett kontinuerligt nätverk av progressivt mindre grenar som sträcker sig från hilum till levern periferi.
Figur 1 visar en portal ven rösterna som visualiseras på plats efter BABB clearing. Figur 1A visar gjutna av hela vänstra levern lob och formen och storleken av rösterna. Figur 1B visar en närbild av samma gjutna, vilket visar penetrering av hartset i de minsta portvenen grenar vid levern periferi.
Figur 2 visar ett portvenen gjuten som har genomgått Koh Maceration. Figur 2A visar hela vänstra levern lob och Figur 2B är en närbild av de små perifera grenar.
Denna teknik har också med framgång tillämpas på intrahepatiska gallgången och publicerade med både BABB clearing och Koh tekniker maceration 1,2,7.
Vanliga problem är ofullständig fyller visar bubblor i plasten, och bräddavlopp i omgivande system eller vävnader. Figur 3 hur man känner igen en ofullständig fyllning (Figur 3A), bubblor (figur 3A) och ett överflöd av kåda från portalen ven till central ven (figur 3B).
Alla bilder är tagna med en Leica MZ 16 FA stereoskop och QImaging RETIGA 4000R kamera.
Figur 1. BABB-rensat harts avgjutning av nedsatt vänster ven lob portalen. A. Harts gjutna visar en hierarkisk grenstruktur sträcker sig från hilum till levern periferi. Harts gjutna visas i gul färg i blå-tonade lever lob. B. En nära dyker upp att harts fyllningen sträcker sig till små filialer i levern periferin. Harts är vitaktig genom rensas levern. Skalstock = 1 mm.
Figur 2. Tissue-uppblötta harts avgjutning av nedsatt vänster ven lob portalen. A. Harts kasta av hela levern lob visar många grenar av varierande storlek. B. Närbild visar små filialer i periferi levern. Suddiga små grenar representerar harts fyllning av sinusformade utrymmen och kan eller inte kan vara synliga på harts kastar och kommer att öka den skenbara grenen tätheten i förekommande fall. Harts är vit till färgen. Skalstock = 1 mm.
Figur 3. Vanliga problem med harts kast. A. En ofullständig fyllning av vänster lob portvenen framgår av några eller alla gjutna grenar underlåter att sträcka sig till levern periferi. Denna gjutna visar också bubblor, synliga som avbrott i den kontinuerliga rösterna (pil). B. På grund av närheten av portalen ven och centrala kontor ven på vissa ställen, kommer portalen ven harts in ofta och fyller central ven. Detta kan redovisas när det finns två distinkta hilar grenar (pilar) och två förgreningar strukturer som har olika mönster och överlappning. Diskriminering mellan tekniska fel och sanna morfologiska förändringar kan göras på två sätt. Först, bör den gjutna strukturen kan jämföras med den struktur förväntas baserat på 2-dimensionell analys eller andra metoder. För det andra är det viktigt att utföra flera replikat, och om möjligt, kvantifiera structure och utföra statistisk analys för att bestämma reproducerbarheten och om det finns ett statistiskt signifikant morfologisk förändring mellan och inom olika experimentella och vapenkontroll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit specifika exempel för hur portvenen och intrahepatiska galla system kanal i levern kan gjutas, men denna teknik kan tillämpas på nästan alla andra duktal eller kärlsystemet med smärre anpassningar. Tidigare arbete har visat att möjligheten att denna teknik i flera arter, inklusive mus 1,2,7-9, ankungar 10,11, 12,13 kanin, hund 14, och gris 15, och i många organ, inklusive nasal körtel 14, hjärta 16, 12,13 blåsa, och lever 1,2,7,8. Dessa kastar kan användas för att jämföra flera system (till exempel portalen ven och gallgången) inom samma vävnad, samma struktur i olika utvecklingsstadier 5 eller effekten på en struktur av genetiska eller miljömässiga förändringar eller influenser 1-4 , 6,7. Den omfattande användningen av denna teknik mellan arter och organ gör harts gjutning ett mycket värdefullt verktyg för studying morfologi vaskulära och duktal strukturer och har potential att kraftigt öka vår kunskap om den normala funktionen av dessa strukturer samt hur de påverkas eller hur de påverkar ett organ, i modeller djursjukdomar.
Användningen av hartset för att skapa 3-dimensionella kastar ger en permanent ögonblicksbild av en duktal eller kärlsystemet och har flera fördelar jämfört med liknande tekniker. Först kan den gjutna analyseras som en fristående struktur efter maceration, som erbjuder en fördel gentemot tusch eller liknande injektioner bläck. Det andra ökar beständighet strukturen hur lätt analysen. Senaste tillåter förmåga MercOx II harts för att motstå BABB clearing förfarandet för en unik förmåga att visualisera en struktur på plats även inom stora eller täta vävnader.
Det finns flera typer av harts finns med olika egenskaper. MercOx II har valts för denna teknik för sina många advantages, MercOx II har låg viskositet, vilket gör att den kan penetrera små perifera portvenen och galla grenar kanal, den har snabb och fullständig härdning vid rumstemperatur, viktigt för att analysera fristående uppblötta rösterna, har minimal krympning vid härdning, och det klarar BABB vävnad clearing. En annan typ av harts, Microfil (Flowtech, Carver, MA), har använts i flera publicerade studier 8,9,15. Jämförelsevis, botar Microfil inte helt vid rumstemperatur och är bäst visualiseras genom vävnad clearing. Microfil kastar av portalen ven har tidigare analyserats genom 10% formalin fixering och efterföljande clearing med ethanolmethyl salicylat 8.
Resin tillsatser kan ge ytterligare metoder för gjutna visualisering, tillägg av färgade färgämnen, fluorescerande molekyler eller mikrosfärer kan förbättra analysen. Hänsyn måste tas dock att se att färgen valts molekylerna är tillräckligt små för att penetrera det integreradended vaskulär eller duktal struktur, att de inte signifikant förändrar egenskaperna för hartset, att de kan motstå antingen vävnad clearing eller maceration, och att de är förenliga med den önskade metoden för analys. Välja Resin Tillsatser beror i hög grad på den specifika ansökan: till exempel mikrosfärer (Molecular Probes) är för stora för att passera genom levern sinusoider, vilket gör dem olämpliga för studier av normala sinusformad arkitektur utan ett perfekt verktyg för att undersöka utvecklingen av portosystemic shuntar , som är stora nog att rymma mikrosfärer, i en genetiskt förändrad musmodell 8.
Slutligen kan harts gjuten analys utföras antingen rensas eller urlakade kast. BABB-rensas avgjutningar är användbara för att mäta strukturen hos ett system som avser organet inom vilken den befinner sig. KOH-upplöst kastar kan analyseras på flera sätt. Tidigare studier har använt svepelektronmikroskopi (SEM) för att visualisera mikrocirkulation nätverk och fartyg struktur 12,13,17. Kastar kan också kvantifieras för gren nummer, diameter och volym med användning av microcomputed tomografi (microCT) 1,15,18, 19,20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (NIH) till SSH (R01-DK078640), från Howard Hughes Medical Institute (HHMI) genom HHMI / Vanderbilt University Certificate Program i molekylär medicin till TJW (GRDOT56006779), den Vanderbilt Diabetes Research and Training Center (P30-DK020593) och Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30-DK058404) som ger Core Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE10 polyethylene tubing | Fisher Scientific | 1417012P | |
| 5-0 surgical black braided silk | Roboz Surgical | SUT-15-1 | |
| Steriject 32 G x 13 mm needle | Air-tite | TSK3213 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Number 5 forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Mercox II kit | Ladd Research | 21247 | |
| Benzyl alcohol | Fisher Scientific | 1816-04 | Only required for BABB-clearing |
| Benzyl benzoate | MP Biomedicals, LLC | 154839 | Only required for BABB-clearing |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Modeling clay | |||
| Scale | |||
| Laboratory scissors | |||
| 15 ml cap polypropylene tubes | |||
| 4% paraformaldahyde | |||
| 15% potassium hydroxide (KOH) | Only required for maceration | ||
| Razor blade | |||
| 100% methanol | |||
| 3 ml luer lock syringe |
References
- Sparks, E. E., Perrien, D. S., Huppert, K. A., Peterson, T. E., Huppert, S. S. Defects in hepatic Notch signaling result in disruption of the communicating intrahepatic bile duct network in mice. Dis. Model Mech. 4, 359-367 (2011).
- Vanderpool, C. Genetic interactions between hepatocyte nuclear factor-6 and notch signaling regulate mouse intrahepatic bile duct development in vivo. Hepatology. 55, 233-243 (2012).
- Meyer, E. P., Ulmann-Schuler, A., Staufenbiel, M., Krucker, T. Altered morphology and 3D architecture of brain vasculature in a mouse model for Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 3587-3592 (2008).
- Van Steenkiste, C. Vascular corrosion casting: analyzing wall shear stress in the portal vein and vascular abnormalities in portal hypertensive and cirrhotic rodents. Lab Invest. 90, 1558-1572 (2010).
- Dickie, R., Cormack, M., Semmler-Behnke, M., Kreyling, W. G., Tsuda, A. Deep pulmonary lymphatics in immature lungs. Journal of Applied Physiology. 107, 859-863 (2009).
- Kelly, D. M., McEntee, G. P., McGeenery, K. F., Fitzpatrick, J. M. Microvasculature of the pancreas, liver, and kidney in cerulein-induced pancreatitis. Archives of Surgery. 128, 293-295 (1993).
- Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice. Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).
- Carlson, T. R. Endothelial expression of constitutively active Notch4 elicits reversible arteriovenous malformations in adult mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9884-9889 (2005).
- Hemmeryckx, B., Emmerechts, J., Bovill, E. G., Hoylaerts, M. F., Lijnen, H. R. Effect of ageing on the murine venous circulation. Histochem. Cell Biol. , (2012).
- Hossler, F. E., Olson, K. R. Microvasculature of the nasal salt gland of the duckling, Anas platyrhynchos: quantitative responses to osmotic adaptation and deadaptation studied with vascular corrosion casting. J. Exp. Zool. 254, 237-247 (1990).
- Hossler, F. E., West, R. F. Venous valve anatomy and morphometry: studies on the duckling using vascular corrosion casting. Am. J. Anat. 181, 425-432 (1988).
- Hossler, F. E., Monson, F. C. Structure and blood supply of intrinsic lymph nodes in the wall of the rabbit urinary bladder--studies with light microscopy, electron microscopy, and vascular corrosion casting. Anat. Rec. 252, 477-484 (1998).
- Hossler, F. E., Monson, F. C. Evidence for a unique elastic sheath surrounding the vesicular arteries of the rabbit urinary bladder--studies of the microvasculature with microscopy and vascular corrosion casting. Anat. Rec. 252, 472-476 (1998).
- Hossler, F. E., Kao, R. L. Microvasculature of the urinary bladder of the dog: a study using vascular corrosion casting. Microsc. Microanal. 13, 220-227 (2007).
- Wischgoll, T., Choy, J. S., Kassab, G. S. Extraction of morphometry and branching angles of porcine coronary arterial tree from CT images. Am J Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1949-H1955 (2009).
- Hossler, F. E., Douglas, J. E., Douglas, L. E. Anatomy and morphometry of myocardial capillaries studied with vascular corrosion casting and scanning electron microscopy: a method for rat heart. Scan Electron Microsc. , 1469-1475 (1986).
- Hossler, F. E., Douglas, J. E. Vascular Corrosion Casting: Review of Advantages and Limitations in the Application of Some Simple Quantitative Methods. Microsc. Microanal. 7, 253-264 (2001).
- Mondy, W. L. Micro-CT of corrosion casts for use in the computer-aided design of microvasculature. Tissue Eng. Part C Methods. 15, 729-738 (2009).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Quantitative Assessment of the Rat Intrahepatic Biliary System by Three-Dimensional Reconstruction. The American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).
- Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. Hepatic Artery and Portal Vein Remodeling in Rat Liver: Vascular Response to Selective Cholangiocyte Proliferation. The American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).
