Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

السلف المستمدة من نظام الثقافة دبقية قليلة التغصن من دماغ الجنين البشري

Published: December 20, 2012 doi: 10.3791/4274
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Neurophysiology, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

الأولية، والإنسان الجنين الدماغ المستمدة، تتكاثر الخلايا الاصلية multipotential

Abstract

التفريق بين الأسلاف العصبية الإنسان في أنواع الخلايا العصبية والدبقية تقدم نموذجا للدراسة والمقارنة بينها تنظيم الخلية العصبية الجزيئية للتنمية النسب. في توسيع المختبر من الأسلاف العصبية من الأنسجة الجنينية CNS اتسمت أيضا. على الرغم من تحديد وعزل الأسلاف الدبقية من الكبار المسألة الفرعية القشرية الإنسان الأبيض وتطور الأوضاع المختلفة لثقافة التمييز المباشر من الأسلاف العصبية الجنينية في إنتاج oligodendrocytes قد المايلين، والحصول على oligodendrocytes قد البشرية الكافية لفي المختبر التجريب لا يزال صعبا. التفريق بين غالاكتوسيريبروزيد + (GalC) وO4 + تم الإبلاغ عن السلائف دبقية قليلة التغصن أو الخلايا الاصلية (OPC) من الخلايا العصبية باستخدام السلائف 2 الثلث الدماغ الجنين. ومع ذلك، فإن هذه الخلايا لا تتكاثر في غياب الخلايا النجمية بما في ذلك دعم والخلايا العصبية، وسرعان ما فقدت مع مرور الوقت في الثقافة. لا تزال الحاجة لنظام الثقافة لإنتاج خلايا دبقية قليلة التغصن من سلالة مناسبة لفي التجريب المختبر.

يمكن أن ثقافة الإنسان oligodendrocytes قد الابتدائي، على سبيل المثال، تكون نموذجا مفيدا لدراسة العوامل المعدية التسبب في الموجهات العصبية مثل الفيروسة التورامية الإنسان، JCV، في الجسم الحي أن يصيب تلك الخلايا. يمكن لهذه الخلايا المستزرعة توفر أيضا نماذج من الأمراض الأخرى المزيل من الجهاز العصبي المركزي (CNS). الأولية، والجنين البشري الدماغ المستمدة، multipotential تتكاثر الخلايا الاصلية العصبية في المختبر مع الحفاظ على القدرة على التمايز إلى خلايا عصبية (عصبونات السلف المستمدة، PDN) والخلايا النجمية (المشتقة من الخلايا النجمية السلف، PDA) تظهر هذه الدراسة أن يمكن أن يتسبب الأسلاف العصبية للتميز من خلال العديد من مراحل التنمية النسب oligodendrocytic (السلف المستمدة من oligodendrocytes قد، PDO). نحن الخلايا العصبية الثقافة السلف في وسائل الإعلام المصل خالية DMEM-F12 سوبplemented مع عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF)، الصفائح الدموية المستمدة عامل النمو (PDGF-AA)، القنفذ الصوتي (SHH)، وعامل التغذية العصبية 3 (NT-3)، N-2 و triiodothyronine (T3). وpassaged في الخلايا المستزرعة في خلايا 2.5e6 في قوارير 75CM تقريبا كل سبعة أيام. باستخدام هذه الشروط، فإن غالبية الخلايا في الثقافة حفاظ على مورفولوجيا تتميز بعض العمليات وعلامات صريحة من قبل خلايا دبقية قليلة التغصن، مثل A2B5 وO-4. عندما كنا إزالة عوامل النمو الأربعة (GF) (bFGF، PDGF-AA، SHH، NT-3) وإضافة وسائط مكيفة من PDN، تبدأ الخلايا للحصول على مزيد من العمليات وعلامات صريحة محددة من التمايز دبقية قليلة التغصن، مثل GalC والمايلين الأساسية البروتين (MBP). أجرينا توصيف المظهري باستخدام متعدد الألوان التدفق الخلوي لتحديد علامات فريدة من دبقية قليلة التغصن.

Protocol

ملاحظة: للحصول على زراعة الروتيني للسلف العصبية والخلايا النسب oligodendrocytic، ويتم حضانة في 37 ° C في مرطب الجو 2 5٪ CO. كل يوم 2، يتم استبدال المتوسطة باستخدام 50 إلى 100٪ من متوسط ​​جديدة اذا الثقافة هي متموجة 40-70٪. في وقت confluency القريب، وpassaged الثقافات في قارورة 2-2.5e6/T75 عادة على الجدول الأسبوعي.

1. إعداد قارورة المغلفة

  1. لإعداد قوارير المغلفة تمييع 5 ملغ من بولي-D-يسين (PDL) في 100 مل من الماء منزوع الأيونات (DI-الماء)، ثم معطف T75 القوارير مع 50 ميكروغرام / مل من PDL في درجة حرارة الغرفة (RT) في الظلام. بعد ساعة ½ 1، نضح في PDL وشطف القوارير مرة واحدة مع DI-الماء. السماح للقوارير جافة قبل البذر الخلايا (الجدول 1).

2. بدء تمايز الخلايا العصبية في السلف السلف oligodendrocytes قد المشتقة (PDO)

بروتوكول لهوolate الإنسان الخلايا الاصلية CNS الموضح في نشرة سابقة وأنها ليست جزءا من هذا البروتوكول 1. تم عزل الخلايا الاولية CNS الإنسان من الدماغ الانتهائي من الدماغ الحمل لمدة 8 أسابيع الجنين، تم الحصول عليها في المعاهد الوطنية للصحة فقا للمبادئ التوجيهية.

  1. ينمو السكان multipotential من الخلايا الاصلية العصبية على قوارير مغلفة في PDL المتوسطة neurobasal تستكمل مع 25 نانوغرام / مل من bFGF و 20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF) (الشكل 1A). لا تستخدم إذا كان لهم أعلى من مرور 11 (P11).
  2. تبدأ في التفريق بين الخلايا العصبية عند السلف ثقافة ما يقرب من 70٪ متموجة.
  3. جعل كاملة التمايز المتوسطة باستخدام المصل دبقية قليلة التغصن خالية DMEM / HAMS المتوسطة 1:01 F12 تستكمل مع مصل الألبومين البقري، الجلوتامين L-، جنتاميسين، مكونات N2، T3، SHH، NT-3، bFGF، وPDGF-AA (الجدول 1) . وسيتم تحديد هذه الوسيلة كوسط بنسبة ضئيلة مع عوامل النمو (بنسبة ضئيلة المتوسطة + GF).
  4. إزالة PROGENوسائل الإعلام itor من قوارير، وشطف الخلايا مرة واحدة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ثم يضاف بنسبة ضئيلة المتوسطة + GF (التفاصيل الواردة في 2.3) لبدء التمايز دبقية قليلة التغصن. والخلايا فقط ملتزمة نسب النمو oligodendrocytic (1B الشكل). ثقافة الخلايا في هذه الوسيلة لمدة 3 أسابيع.
  5. كل أسبوع، عندما الخلايا في مرور 90-95٪، التقاء لهم باستخدام التربسين (0.05٪)-EDTA (0.1٪) (4 مل لقارورة T75). نقل متوسطة بالكامل من الخلايا المراد passaged في أنبوب 50 مل المخروطية، وسيتم استخدام هذه الوسيلة مكيفة لارواء التربسين. تأكد من عدم تجفيف الخلايا. ثم يضاف التربسين.
  6. احتضان الخلايا في التربسين لمدة 5 دقائق في RT، والتنصت بلطف القارورة عدة مرات للمساعدة في مفرزة الخلية.
  7. إخماد التربسين بإضافة مل 4-5 من متوسطة إلى تكييف القارورة مع خلايا منفصلة.
  8. نقل متوسطة وخلايا في أنبوب 50 مل المخروطية نفسها. أجهزة الطرد المركزي على المديين المتوسط ​​وخلايا في 1200 دورة في الدقيقة (~300 XG) لمدة 5 دقائق في RT.
  9. نضح طاف، وإعادة تعليق بيليه الخلية، بلطف ترجيح الأنبوب، ثم قم بإضافة جديدة بنسبة ضئيلة المتوسطة + GF. بلطف ماصة المتوسطة وخلايا صعودا ونزولا لجعل التعليق خلية موحدة.
  10. عد الخلايا، ونقل 2.5e6 في كل قارورة T75 الجديدة PDL المغلفة.

3. الخطوة النهائية في التفريق بين oligodendrocytes قد

  1. بعد 3 أسابيع من الثقافة في المتوسط ​​بنسبة ضئيلة + GF، عندما الخلايا في التقاء 70-80٪، وبدء عملية التمايز النهائي (الشكل 1C).
  2. إعداد المتوسطة بنفس الطريقة باعتبارها وسيلة بنسبة ضئيلة + GF ولكن دون إضافة GF الأربعة: SHH، NT-3، وbFGF PDGF AA-. وسيتم تحديد هذه الوسيلة دون GF الأربعة المتوسطة بنسبة ضئيلة - GF.
  3. نضح المتوسطة بنسبة ضئيلة + GF من القارورة، وشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ثم قم بإضافة وحدة تخزين ما مجموعه 16 مل من المتوسط، والتي ¾ (12 مل) بنسبة ضئيلة هي المتوسطة - GF و¼ (4 مل) هو PDN المتوسطة مكيفة، ل 6-10 يوما). استخدام تكييف الهواء والمتوسطة من PDN ليست حرجة لعملية التمايز أو لبقاء الخلايا. ونحن في الحقيقة لاحظت أن الاتصال المباشر الوحيد من شركة تنمية نفط عمان مع خلايا PDN في المشاركة في التجارب ثقافة كان لها تأثير على طول بقاء شركة تنمية نفط عمان. ويمكن تمديد GF إلى أسبوعين أو ثلاثة أسابيع إذا هي الخلايا شركة تنمية نفط عمان شارك في تربيتها مع خلايا PDN - الوقت البقاء على قيد الحياة في المتوسط ​​بنسبة ضئيلة. يوصف بروتوكول للتمييز خلايا العصبية في PDN السلف في منشور السابقة وأنها ليست جزءا من هذا البروتوكول 1. انسحاب النمو عامل من نتائج ثقافة المتوسط ​​في الثقافة متباينة من الخلايا تدريجيا مع عمليات متعددة (1D الشكل).

4. تدفق الخلوي الفحص

الفحص التدفق الخلوي يقارن اقتناء علامات دبقية قليلة التغصن أثناء عملية التمايز في العلاقة مع تلك من سكانها الوالدين.

  1. استخدام برو العصبيةgenitors والسيطرة. شركة تنمية نفط عمان في خلايا البذور 2.5x10 6 خلايا في اثنين من قوارير T75 المغلفة مع البولي يسين GF-D في المتوسط ​​بنسبة ضئيلة +.
  2. وبعد أسبوع، مع استبدال المتوسطة المتوسطة بنسبة ضئيلة الطازجة + GF في قوارير وثقافة الرقابة لبقاء الخلية، في حين كان بنسبة ضئيلة قوارير أخرى متوسطة - GF.
  3. لفصل الخلايا في كل من شركة تنمية نفط عمان وسائل الإعلام استخدام 20 U / مل من التربسين وغراء لا. وذلك لأن لديها غراء ألطف تأثير على الخلايا خلال التفكك الحفاظ على التشكل الخلوية.
  4. إضافة 5 مل من محلول الملح المتوازن للايرل (EBSS) إلى قارورة غراء. ضع قارورة في C ° 37 لمدة 10 دقيقة أو حتى يذوب تماما غراء والحل يبدو واضحا. هذا هو الحل غراء يستخدم لفصل الخلايا.
  5. إضافة 0.5 مل من EBSS إلى قارورة ديوكسي ريبونيوكلياز (الدناز) I (الجدول 1). المزيج بلطف. إضافة 0.25 مل من هذا المحلول إلى قارورة من غراء المنحل. هذا المستحضر يحتوي على تركيز النهائي من غراء حوالي U / 20 مل و 00.005٪ الدناز.
  6. مكان غراء الحل (كما هو موضح أعلاه) على الخلايا واحتضان في C ° 37 ل15-30 دقيقة؛ رصد مفرزة من الخلايا باستخدام المجهر. وقف رد الفعل مع 5 مل من المتوسط ​​مع أو بدون GF وأجهزة الطرد المركزي في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق.
  7. نقل الكريات خلية من كل من القوارير إلى قسمين أنابيب البولي بروبلين مختلفة 5 مل وغسلها مع المتوسطة الفسيولوجية الطبيعية (NPM: 145 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 1.8 ملي CaCl 2، ملي Hepes 10 و 10 ملي الجلوكوز) تستكمل مع 1 ملغ / مل الأبقار مصل الزلال (NPM + BSA).
  8. أداء سطح المناعية عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة باستخدام الأجسام المضادة الأولية المحددة ومعاير مناسب لO4، A2B5، GalC (الجدول 2).
  9. غسل الخلايا مع NPM + C BSA في ° 4 لمدة 5 دقائق واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية لهم محددة في C ° 4 لمدة 20 دقيقة (الجدول 2).
  10. وصمة عار لمستضدات الخلايا بما في ذلك nestin، ييفي الحمضية الدبقية بروتين (GFAP)، ويكون من الدرجة الثالثةتا؛-تويولين، والبروتين المايلين الأساسية (MBP) (الجدول 2)، وإصلاح الخلايا في بارافورمالدهيد 2٪ (PFA) لمدة 20 دقيقة في RT وpermeabilize من البرد الإيثانول 70٪ لمدة 15 دقيقة في -20 ° C.
  11. غسل الخلايا مع 1X PBS واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية محددة (الجدول 2).
  12. على التمييز بين الخلايا السليمة والحطام التحت خلوية خلال تحليل التدفق الخلوي، وصمة عار مع خلايا 4،6-diamidino-phenyllindole-2، هيدروكلوريد (دابي) (لايف تكنولوجيز، وغراند ايلاند، نيويورك).
  13. في تحقيق الاستفادة المثلى من بروتوكول أعلاه، أجرينا كل التجارب المراقبة المناسبة لتأكيد خصوصية كل immunoreagent. لفترة وجيزة، عن الأجسام المضادة المسماة مباشرة، كان عنصر التحكم المناسب سلبية على الضد مترافق مباشرة للطبقة المناعي نمط إسوي نفس (أو فئة فرعية) والمكورات ملون تألقي والأجسام المضادة الأولية (أي سيطرة نمط إسوي). لالمناعية غير المباشرة من الأجسام المضادة الأولية، والتحكم المناسبة السلبية ثكما الأجسام المضادة الثانوية مترافق إلى ملون تألقي الفائدة التي تستهدف على وجه التحديد الطبقة الغلوبولين المناعي (أو فئة فرعية) من المضيف الذي تم إنشاء الأجسام المضادة الأولية. كنا عندما استخدمت الأجسام المضادة الأولية من المضيفين متعددة (الماوس، الأرنب، الدجاج) معا، والأجسام المضادة الثانوية استهداف الأجسام المضادة الأولية من كل مضيف والأجسام المضادة الثانوية تستخدم كل وعادة عبر كثف المناعية ضد من المضيفين الآخرين لتقليل عبر استضافة تفاعلية مناعية. تضمنت الضوابط الإيجابية المناعية مباشرة أو غير مباشرة من الخلية يعرف الاستعدادات للتعبير عن مستضدات ذات الاهتمام باستخدام إما مباشرة أو غير مباشرة immunoreactions مع الأجسام المضادة الأولية المحددة لهذه المستضدات. نفذت أساليب التحسين المذكورة أعلاه مرة واحدة لكل نوع من التجارب المناعية. كشفت immunoreactions التحكم لم كبيرة عبر حاتمة تفاعلية مناعية بين الأجسام المضادة الأولية والثانوية. تم إجراء التدفق الخلوي بشكل موحد علىعلقت الخلايا fluorescently المسمى باستخدام خلية SE FACVantage فارز (BD العلوم البيولوجية، سان خوسيه، كاليفورنيا) مجهزة مع ثلاثة أشعة الليزر، والتي توفر موجات الإثارة ضبطها إلى 488 نانومتر، 647 نانومتر، والأشعة فوق البنفسجية واسعة (351-364 نانومتر) (الشكل 2) .

5. الفحص المناعي

ملاحظة: للحصول على التجارب المناعي، ومطلي شركة تنمية نفط عمان في GF بنسبة ضئيلة أو متوسطة + المتوسطة بنسبة ضئيلة - GF في 2.5e5 في 6 لوحات مغلفة جيدا PDL. يتم إصلاح الخلايا في PFA 2٪ عند نقاط زمنية مختلفة بعد الانسحاب من عوامل النمو. يتم تنفيذ الأجسام المضادة وصمة عار على لوحات بلاستيكية 6 جيدا بدلا من coverslips الزجاج.

  1. إزالة وسائل الاعلام وإضافة PFA 2٪. احتضان لمدة 10 دقيقة في RT. تجاهل PFA. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 3 مرات، 5 دقائق في كل مرة. يجب الحرص على عدم تجفيف الخلايا.
  2. Permeabilize الخلايا داخل الخلايا باستخدام علامات ل0.25٪ تريتون في حل PBS لمدة 10 دقيقة في RT.
  3. لمنع غير محددة وملزمة الخلايا كتلة، وأو 10 دقيقة مع HHG (1 عازلة HEPES ملم، 2٪ من مصل الحصان، و 10٪ مصل الماعز في حل هانكس "الملح متوازن). تخفيف الأجسام المضادة الأولية محددة (الجدول 2) إلى تركيز محدد مسبقا في HHG. وضع الأجسام المضادة المخفف على الخلايا. 1 ساعة احتضان RT في على شاكر أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
  4. غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، لمدة 5 دقائق في كل مرة. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية المناسبة (الجدول 2) إلى جانب وجود ملون تألقي إلى تركيز محدد مسبقا في HHG. ضع مزيج من الأجسام المضادة الثانوية المخفف على الخلايا. 1 ساعة احتضان RT في على شاكر في الظلام.
  5. غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، لمدة 5 دقائق في كل مرة.
  6. لتجنب photobleaching إضافة 10 ميكرولتر من إطالة الذهب مع دابي إلى الخلايا ووضع ساترة الزجاج على رأسها. تصور الخلايا المسماة باستخدام المجهر مضان Axiovert 200M (زايس، Thornwood، NY) (الشكل 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

من المهم جدا لبدء عملية التمايز من -80٪ 70٪ متموجة العصبية السلف زراعة الخلايا (الشكل 1A). سوف تنقرض العديد من الخلايا بعد تغيير ثقافة المتوسط ​​من السلف والمتوسطة بنسبة ضئيلة نظرا لأنه يتضمن عوامل نمو محددة. هذا يدل على أن لن نمو الخلايا العصبية السلف لم يرتكب إلى النمط الظاهري oligodendrocytic تكون معتمدة من قبل هذه الوسيلة الجديدة (1B الشكل). أدى الحضانة في المتوسط ​​بنسبة ضئيلة + GF لمدة أسبوع في الثقافة وسيطة واظهار الضيق التشكل الثنائي القطب، (1B الشكل). يتم الاحتفاظ الخلايا في المتوسط ​​بنسبة ضئيلة + GF لمدة 3-4 أسابيع (الشكل 1C). أدى النمو الانسحاب من عامل ثقافة المتوسط ​​في الثقافة متباينة من الخلايا تدريجيا مع عمليات متعددة (1D الشكل). يتم استخدام التدفق الخلوي لتمثيل كمية من البيانات.

أرقام 2A، 2وB 2C تثبت أن غالبية الأسلاف العصبية أعرب عن الخلايا الجذعية عصبية ظهارية nestin علامة، في حين أعرب مجموعات سكانية فرعية صغيرة فقط النسب تقييدا ​​للعلامات مثل علامة نجمية GFAP (الشكل 2A)، الطبقة العصبية علامة III-β تويولين (الشكل 2B) ، أو علامة دبقية قليلة التغصن O4 (الشكل 2C). انخفضت عندما تم استبدال ثقافة المتوسط ​​بنسبة ضئيلة مع GF + المتوسطة ومثقف والخلايا لمدة 1 أسبوع، nestin التعبير ويمكن ملاحظة زيادة A2B5 التعبير (الشكل 2D). A2B5 هو علامة السلائف دبقية. في المقارنة، 2 أسابيع بعد استبدال المتوسطة، انخفض nestin التعبير إلى أبعد من ذلك وA2B5 التعبير وحدها زيادة (2E الشكل)، وكذلك التعبير عن علامة أخرى دبقية قليلة التغصن، O4 (الشكل 2F). انسحاب آخر يومين عامل النمو، وزيادة O4 التعبير وكذلك التعبير عن GalC، وهودبقية قليلة التغصن علامة الراحل (الشكل 2G). ستة أيام الانسحاب النمو آخر عامل، وزيادة المشاركين في التعبير عن O4 وGalC (الشكل 2H) وقابل للمقارنة إلى التعبير المشترك للGalC وMBP (الشكل 2I). والمناعية متعددة حاتمة يكشف عن أن أكثر من نصف الخلايا في الثقافة يعبرون عن MBP (الشكل 2J). وقد تميزت دليل آخر على التمايز شركة تنمية نفط عمان، وذلك باستخدام الفحص المناعي، من خلال الزيادة الزمنية التعبير MBP في هذه الخلايا بعد الانسحاب عامل النمو (الشكل 3A-C). وباختصار، الإنسان الجنين الخلايا الاصلية العصبية قادرة على التكاثر في المختبر مع الحفاظ على القدرة على التفريق إلى 3 أنواع رئيسية خلايا الدماغ (الشكل 4).

الشكل 1
الشكل 1. المرحلة النقيض س المجهرو (A) الخلايا الاصلية العصبية مثقف في وسط السلف، (B) الخلايا الاصلية العصبية نمت في المتوسط ​​بنسبة ضئيلة + GF لمدة أسبوع تظهر خاصية تغيير الضيقة التشكل الثنائي القطب،، (C) متباينة السلف المستمدة من oligodendrocytes قد نمت لمدة 3 أيام في المتوسط ​​بنسبة ضئيلة بعد انسحاب عامل نمو التشكل المعرض دبقية قليلة التغصن تتميز عمليات متعددة. 20X التكبير.

الشكل 2
الشكل 2 تحليل التدفق الخلوي للخلايا العصبية السلف المشترك معربا عن السلائف الخلية Nestin علامة (جميع محاور العمودي) مع: (A) للعلامة GFAP نجمي، (B) للعلامة β الخلايا العصبية تويولين III، و (C) وoligodendrocytic علامة O4، (D) نمت الخلايا الاصلية العصبية لمدة أسبوع في وسائل الإعلام بنسبة ضئيلة + GF شارك في التعبير عن nestin وA2B5، (E) nestin وA2B5 شارك في التعبير بعد أسبوعين من النمو الأسلاف العصبية في المتوسط ​​بنسبة ضئيلة + GF (F) A2B5 وO4 شارك في التعبير بعد أسبوعين من النمو الأسلاف العصبية في GF بنسبة ضئيلة + المتوسطة، واثنتان (G) بعد أيام من الانسحاب عامل النمو، يتم التعبير عن علامات دبقية قليلة التغصن متميزة من التمايز، وGalC O4. بعد ستة أيام من انسحاب عامل النمو (H) نسبة متزايدة من الخلايا انقر نقرا مزدوجا إيجابية لO4 وGalC؛ (I) انقر نقرا مزدوجا إيجابية لGalC وMPB، و (J) انقر نقرا مزدوجا إيجابية لO4 وMBP. AJ تمثل أربعة تجارب مستقلة. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 3
الشكل 3. immunofluor غير المباشرةتلطيخ escence من السلف المستمدة من oligodendrocytes قد لأيام MBP 2 (A)، (B) 5 أيام، و (C، D) 9 أيام بعد الانسحاب عامل النمو. (D) يمثل صورة المرحلة من الثقافة أيام 9 في المتوسط ​​بنسبة ضئيلة - GF و (E) هو توسيع مربع أبيض من نفس الصورة (A، B) 20X التكبير، (C، D) التكبير 32X.

الشكل 4
الشكل 4. تمثيل تخطيطي لدينا ثقافة نموذج الخلية. الأولية، والجنين البشري الدماغ المستمدة، multipotential تتكاثر الخلايا الاصلية العصبية في المختبر مع الحفاظ على المرونة. باستخدام ظروف ثقافة مختلفة، يمكن أن الخلايا الاصلية العصبية تفرق في الخلايا العصبية (PDN)، النجمية (PDA) ودبقية قليلة التغصن (PDO)، كما هو موضح من قبل محددة differentiatأيون علامات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا البروتوكول يصف كيفية اشتقاق oligodendrocytes قد الجنين من المرحلة الابتدائية خلايا العصبية السلف وتميز النمط الظاهري وذلك باستخدام كل من التدفق الخلوي المناعي وتلطيخ. وقد تم توسيع ونمو الأسلاف العصبية من الجهاز العصبي المركزي الجنين بشكل جيد للغاية ووصف 1-4. ومع ذلك، الحصول على oligodendrocytes قد البشرية الكافية لإجراء التجارب في المختبر لا يزال من الصعب، على الرغم من أنه من الممكن لتحديد وعزل السلائف الدبقية من مادة بيضاء الكبار الإنسان 5-13. كانت هناك محاولات مختلفة في تطور الأوضاع المختلفة لثقافة التمييز المباشر من الأسلاف العصبية الجنينية في إنتاج المايلين oligodendrocytes قد 14-21. يصف هذا البروتوكول مزيد من nestin إيجابية الخلايا الاصلية العصبية معربا عن علامة O4 (الشكل 2) عندما نمت لمدة 3 أسابيع في المتوسط ​​المصل خالية من عوامل النمو تستكمل مع اختيار (PDGF-AA، bFGF، SHH، وNT-3)، رقبعة ضرورية لبقاء وانتشار السلائف دبقية قليلة التغصن 22-24. أدى إزالة هذه العوامل النمو في الخلايا + O4 في التمايز والتعبير مزيد من مكونات المايلين (غالاكتوسيريبروزيد وMB). وبالإضافة إلى ذلك، والتعبير عن علامات التمايز دبقية قليلة التغصن يتزامن مع تغيرات شكلية من الخلايا التي ظهرت للمرة الأولى في ضيق وثنائي القطب (1B الشكل) إلى الخلايا التي تصبح متعدد الأقطاب مع متطورة العمليات (الشكل 1C). واستند إزالة عوامل النمو للسماح مزيد من الخطوات النهائية من تمايز على دراسات أجريت في كل من الماوس ول15،25 الإنسان. وجود ثلاثي يودوثيرونين (T3) مهم لبقاء والتفريق بين 26 حين oligodendrocytes قد لاحظنا أن إزالة عوامل النمو الاربعة كان من الضروري التعبير عن علامات التمايز النهائي. تمت مقارنة هذا مع الخلايا في الاحتفاظ بنسبة ضئيلة المتوسطة + GF علىSA السيطرة.

نحن لسنا أول من وصف التفريق بين الخلايا متعددة القدرات السلف العصبية إلى خلايا دبقية قليلة التغصن استجابة لإشارات مثل SHH وbFGF 24. وأظهرت تقارير سابقة أن oligodendrogenesis القشرية يبدأ من سن 10 أسابيع الحمل لدى البشر 24 مع قدرة الإنسان على الجنين oligodendrocytes قد myelinate زيادة متناسب مع عمر الحمل 22. التفريق بين غالاكتوسيريبروزيد + + وO4 تم الإبلاغ عن خلايا دبقية قليلة التغصن من السلائف الخلايا الاصلية العصبية باستخدام الدماغ 2 الثلث الجنين 21،27. ومع ذلك، فإن هذه الخلايا لا تتكاثر في غياب الخلايا النجمية بما في ذلك دعم والخلايا العصبية، وسرعان ما فقدت مع مرور الوقت في الثقافة 21. نظامنا يدعم تشكيل GalC + + وMBP الخلايا من الجنين ثقافة الإنسان من سن 8 أسابيع الحمل. وعلاوة على ذلك وصف لنا أن احيمكن تربيتها في المختبر oligodendrocytes قد ntiated من دون الحاجة إلى دعم الخلايا النجمية والخلايا العصبية أو، على الرغم من أن المشاركة في زراعة الخلايا العصبية يمكن أن يطيل مع بقاء oligodendrocytes قد متباينة. فائدة أخرى من هذا البروتوكول هو إمكانية لزراعة عدد كبير من الخلايا معربا عن علامة + O4 التي يمكن زراعتها في الثقافة وpassaged لأسابيع مع الحفاظ على النمط الظاهري الخاصة بهم. يمكن في تلك اللحظة أن تلك الخلايا دفعت + O4 أخرى في الخطوة الأخيرة من التمايز عندما تتم إزالة عوامل النمو من المتوسط. بروتوكول المبينة في هذه الورقة يتناول الحاجة لالأنساب دبقية قليلة التغصن مناسبة للفي التجريب المختبر. وعلاوة على ذلك، نعتقد أن تحديد العوامل المحددة التي تحفز على تمايز سلسلة الأسلاف العصبية المشتقة من السلف نحو دبقية قليلة التغصن المهم لفهم الآليات الخلوية والجزيئية لالتنمويةالتحولات. قد تكون أيضا بمثابة أداة هامة لدراسة اضطرابات المزيل والتفاعلات الخلية المضيفة الفيروسات تتعلق التسبب في فيروسات الموجهات العصبية البشرية مثل JCV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث من قبل برنامج بحوث ضمن الجدران في المعاهد الوطنية للصحة، NINDS. فإن الكتاب أود أن أشكر جميع أعضاء مختبر الطب الجزيئي وعلم الأعصاب، ريك درايفوس لمساعدة مع المجهري وباميلا النخل C. لمساعدة مع التحرير.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DME/HAMS F12 1:1 Omega Scientist DM-251 1X
Bovine Albumin Sigma A9418 1%
Gentamicin Quality Biologicals 120-098-031 50 μg/ml
L-Glutamine Quality Biologicals 118-084-061 2 mM
T3 Sigma T2877 3 nM
N2 Components Gibco BRL 17502 1:100
NT-3 PeproTech Inc 450-03 2 ng/ml
Shh R&D System 1314-SH/CF 2 ng/ml
bFGF PeproTech Inc 100-18B 20 ng/ml
PDGF-AA PeproTech Inc 100-13A 10 ng/ml
PDL Sigma P6407 50 μg/m
PFA Electron Microscopy Sciences 15712 2%
Trypsin Quality Biologicals 118-087-721
Papain Worthington LK003178 20 U/ml
DNase vials Worthington LK003172 0.005%
EBSS Worthington LK003188
ProLong Gold
with DAPI		 Invitrogen P36931

Table 1. Reagents.
Primary Abs(all at 1 μg/ml) Species Isotype Source Secondary Abs
Flow Cytometry
A2B5-Biotin Mouse IgM Gift J. Nielson Streptavidin PETR, Invitrogen, CA
O4FITC Mouse IgM Gift from J. Nielson
A2B5 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
O4 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
GalC Mouse IgG3 Millipore, MA gαm IgG3-PE, Southern Biotech, AL
MBP Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA
Nestin Mouse IgG1 Messam et al. 200028 gαm IgG1-PECy5, Invitrogen, CA
GFAP Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA
βIII tubulin Mouse IgG2 Covance, CA gαm IgG2a-PETR, Invitrogen, CA
Immunocytochemistry
βIII tubulin
(1:1,500) 		Mouse IgG2a Covance, CA gαm IgG2a-FITC, Invitrogen, CA
(1:1,000)
GFAP
(1:1,000) 		Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA
(1:500)
MBP
(1:50)		 Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA
(1:100)
O4
(1:100) 		Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA
(1:100)
GalC
(1:10) 		Rabbit IgG Millipore, MA gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA
(1:100)

Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phyc–rythrin; PETR, phyc–rythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility. Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).
  2. Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
  3. Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
  4. McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276, 66-71 (1997).
  5. Belachew, S., et al. Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons. J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).
  6. Almazan, G., McKay, R. An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve. Brain Res. 579, 234-245 (1992).
  7. Filipovic, R., Zecevic, N. Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia. Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).
  8. Goldman, S. A., Natesan, S. A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus. Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).
  9. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nat. Med. 9, 439-447 (2003).
  10. Lyssiotis, C. A., et al. Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).
  11. Sim, F. J., Goldman, S. A. White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche. Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).
  12. Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium. Nature. 303, 390-396 (1983).
  13. Windrem, M. S., et al. Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain. J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).
  14. Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  15. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
  16. Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136, 1443-1452 (2009).
  17. Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).
  18. Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).
  19. Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
  20. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).
  21. Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. Tracing human oligodendroglial development in vitro. J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).
  22. Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).
  23. Chong, S. Y., Chan, J. R. Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted. J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).
  24. Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front Neuroanat. 3, 5 (2009).
  25. Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures. Stem Cells. 27, 116-125 (2009).
  26. D'Intino, G., et al. Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism. J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).
  27. Cui, Q. L., et al. Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate. Stem Cells Dev. , (2012).
  28. Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody. Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).

Tags

علم الأعصاب، العدد 70، البيولوجيا التطورية، الطب، بيولوجيا الخلايا الجذعية والبيولوجيا الجزيئية والخلوية علم الأحياء، علم وظائف الأعضاء، وتوصيف النسب، الأسلاف العصبية، والتمايز، ثقافة نموذج الخلية
السلف المستمدة من نظام الثقافة دبقية قليلة التغصن من دماغ الجنين البشري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monaco, M. C. G., Maric, D.,… More

Monaco, M. C. G., Maric, D., Bandeian, A., Leibovitch, E., Yang, W., Major, E. O. Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain. J. Vis. Exp. (70), e4274, doi:10.3791/4274 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter