Summary
小学，人类胎儿脑源性，多能祖细胞增殖
Abstract
人类神经祖细胞分化成神经元和神经胶质细胞类型进行研究和比较分子调控神经细胞谱系的发展提供了一种模式。从胎儿中枢神经系统组织的神经前体细胞在体外扩增得到很好的特点。尽管成人皮层下白质和发展各种文化条件成髓磷脂生产的少突胶质细胞，少突胶质细胞在体外实验获得足够的人力胎儿神经祖细胞的定向分化的神经胶质祖细胞的识别和分离仍然存在困难。分化的半乳糖脑苷脂+（GALC）和O4 +少突胶质前体细胞或祖细胞神经前体细胞（OPC）从已报道使用第二孕期胎儿的大脑。然而，这些细胞不支持包括星形胶质细胞和神经元的细胞增殖的情况下，都将丢失迅速随着时间的推移在培养。仍需要文化系统的少突胶质细胞谱系适合在体外实验中产生。
文化的初级人少突胶质细胞，例如，可以是一种有用的模型来研究发病机制中的嗜神经感染剂，如人多瘤病毒，JC病毒，即在体 内感染这些细胞。这些培养细胞中也可以提供其他脱髓鞘疾病的中枢神经系统（CNS）的模型。小学，人类胎儿脑源性，多能神经祖细胞在体外增殖的能力，同时保持分化成神经元祖细胞源性神经元，（PDN）和星形胶质细胞（祖衍生的星形胶质细胞，PDA）的研究表明，神经祖细胞可诱导少突胶质谱系发展的阶段，许多（祖衍生的少突胶质细胞，PDO）区分。我们的文化神经祖细胞在DMEM-F12无血清培养基支持中执行与碱性成纤维细胞生长因子碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），血小板衍生生长因子（PDGF-AA），刺猬（嘘），神经营养因子3（NT-3），N-2和三碘甲状腺原氨酸（T3）。 2.5e6细胞每75厘米瓶中大约每7天传代培养的细胞。使用这些条件，在培养的细胞的大部分保持形态，其特征在于由几道工序和明文预少突胶质细胞的标记物，如A2B5和O-4。当我们删除的四个生长因子（GF），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，PDGF-AA，嘘，NT-3）和空调媒体PDN，细胞开始获得更多的流程和快速的特定标志物，如GALC和髓鞘少突胶质细胞分化碱性蛋白（MBP）。我们进行了表型特征，使用多色流式细胞仪识别少突胶质细胞的特有标志。
Protocol
注：对于常规的培养的神经祖细胞和少突胶质谱系细胞，孵化完成，在37℃下，在湿润的5％CO 2气氛中。每2天，将培养基更换使用50〜100％的新鲜培养基，如果文化是40-70％汇合。在附近汇合的时间，培养传代在2-2.5e6/T75烧瓶通常在每周计划。
1。准备涂层瓶
- 为了制备涂覆的烧瓶在100毫升去离子水（DI水），然后涂层的T75烧瓶中稀释5毫克的聚-D-赖氨酸（PDL）50微克/毫升的PDL在黑暗中在室温（RT）。 1个半小时后，吸出PDL一次，去离子水冲洗锥形瓶。让烧瓶干播种前的细胞（ 表1）。
2。开始分化的神经祖细胞源性祖细胞，少突胶质细胞（PDO）
该协议是酚盐人类中枢神经系统祖细胞在以前的出版物，它不属于本协议。人类中枢神经系统祖细胞中分离到前脑的一个为期8周的妊娠胎儿的大脑，按照与美国国立卫生研究院的指导方针。
- 成长PDL涂层烧瓶中neurobasal培养基补充有25 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子和20 ng / ml的表皮生长因子（EGF）（ 图1A）上的神经祖细胞的多能人口。不要使用他们，如果高于通路（11）（P11）。
- 文化是约70％汇合时，开始分化的神经祖细胞。
- 车型完整分化少突胶质细胞的介质，使用无血清的DMEM / HAMS F12 1:1培养基与牛血清白蛋白，L-谷氨酰胺，庆大霉素，N2成分，T3中，Shh，NT-3，碱性成纤维细胞生长因子，和PDGF-AA（ 表1） 。这种介质将被定义为与生长因子（低聚培养基+ GF）的寡核苷酸介质。
- 删除PROGEN从烧瓶中的itor媒体，漂洗细胞一次磷酸盐缓冲盐水（PBS），然后添加低聚介质+ GF（2.3）中描述的开始少突胶质细胞的分化的详情。只有承诺的少突胶质谱系的细胞生长（ 图1B）。 3周在该培养基中培养细胞。
- 每星期，当细胞是在90-95％汇合时，通过用胰蛋白酶（0.05％）-EDTA（0.1％）（4毫升的T75烧瓶中）。传送整个介质从入50毫升的锥形管中的细胞进行传代，该条件培养基将用于淬灭的胰蛋白酶。确保干出细胞。然后添加胰蛋白酶。
- 培养细胞中的胰蛋白酶在室温下5分钟，轻轻拍打烧瓶数次，以帮助细胞脱落。
- 淬灭的胰蛋白酶，通过与分离的细胞的条件培养基的烧瓶中加入4-5毫升。
- 介质和细胞转移到相同的50毫升锥形管。的离心的培养基和细胞在1,200 rpm（〜300 xg离心）在RT下的5分钟。
- 弃上清，重悬细胞沉淀，轻轻倾斜管，然后加入新鲜的寡核苷酸介质+ GF。轻轻地吸移管培养基和细胞向上和向下，使均匀的细胞悬浮液。
- 计数到每一个新的PDL涂层的T75烧瓶中的细胞，并转移2.5e6。
3。在少突胶质细胞分化的最后一步
- 培养3周在低聚培养基+ GF，当细胞在70％至80％汇合后，启动的最终分化过程中（ 图1C）。
- 准备培养基中以同样的方式作为寡核苷酸的培养基+ GF，但不添加四GF：Shh的，NT-3，碱性成纤维细胞生长因子，血小板衍生生长因子-AA。这四个GF未经将被定义为寡介质 - GF。
- 吸液寡核苷酸的培养基+ GF从烧瓶中，一次，用PBS冲洗，然后添加介质的总体积为16毫升，¾（12毫升）的寡核苷酸的培养基 - GF和¼（4毫升）是PDN的条件培养基，为6日-10日）。从PDN是条件培养基的使用不是关键的分化过程中或细胞的生存。事实上，我们观察到PDO的唯一的直接接触与PDN细胞在共培养实验产生了影响对PDO生存的长度。生存时间寡媒介 - GF可以延长到两，三个星期，，如果PDO细胞共培养PDN细胞。区分人类神经祖细胞PDN以前的出版物中描述的协议，它不属于本协议。从培养基中的查询结果与多个进程（ 图1D）的细胞培养在逐步分化的生长因子撤出。
4。流式细胞仪检测
流式细胞仪检测比较少突胶质细胞在分化过程中的关系与他们的父母人口标记收购。
- 使用神经亲捐血者之血袋控制。种子PDO的涂有聚-D-赖氨酸在低聚培养基+ GF两个T75烧瓶中的2.5×10 6个细胞的细胞。
- 一个星期后，更换介质，新鲜的寡核苷酸介质+ GF在烧瓶中控制细胞活力的文化，而其他瓶中寡媒介 - GF。
- 在媒体使用PDO细胞中分离20 U /毫升，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶。这是因为，木瓜蛋白酶具有平缓的过程中对细胞的影响保持细胞形态的解离。
- 加入5毫升的Earle氏平衡盐溶液（EBSS）木瓜蛋白酶小瓶。将小瓶在37℃下10分钟或直到木瓜蛋白酶完全溶解，溶液出现清晰。这是一个用于解离细胞的木瓜蛋白酶溶液。
- 添加0.5毫升EBSS一个脱氧核糖核酸（DNA酶）的小瓶（ 表1）。轻轻混匀。添加0.25毫升此溶液溶解的木瓜蛋白酶的小瓶。该制剂包含的最终浓度为约20 U / ml的木瓜蛋白酶和00.005％DNA酶。
- 地点的木瓜蛋白酶溶液（如上面所述）上的细胞，并在37℃下孵育15-30分钟;监测使用显微镜的细胞脱离。用5毫升的介质带或不带GF和7分钟，在1,200 rpm的转速下离心，使反应停止。
- 从两个烧瓶细胞沉淀转移到两个不同的5毫升的聚丙烯管中，并用它们与正常的生理介质（NPM：145毫摩尔NaCl，5 mM KCl中，1.8毫的CaCl 2，10mM的Hepes和10mM葡萄糖），补充有1毫克/毫升牛血清白蛋白（NPM + BSA）。
- 执行表面免疫组化，在4℃下20分钟，使用具体和适当滴定的初级抗体A2B5，O4，GALC（ 表2）。
- 与NPM + BSA洗涤细胞5分钟，并在4℃下，它们与特定的二级抗体，在4℃下孵育20分钟（ 表2）。
- 染色细胞内的抗原，包括巢蛋白，胶质纤维酸性蛋白（GFAP），Ⅲ类た-微管蛋白，髓鞘碱性蛋白（MBP）（ 表2），固定细胞在2％多聚甲醛（PFA）的20分钟，在RT中，于-20℃下的15分钟用70％冷乙醇通透
- 用1×PBS洗涤细胞，和（ 表2）与特定的二级抗体孵育。
- 区分的完整细胞和亚细胞碎片在流式细胞术分析，染色细胞与4,6 - 二脒基-2 - phenyllindole，二氢氯化物（DAPI）（Life Technologies公司，纽约州Grand Island）。
- 在优化上述协议，我们进行了适当的控制实验，以确认各免疫试剂的特异性。简单地说，对于直接标记的抗体，适当的阴性对照相同的免疫球蛋白同种型类（或子类）和荧光染料共轭作为初级抗体（ 即 ，同种型对照）是一个直接的共轭的抗体。对于间接免疫的主要抗体，负相应的控制w作为二次抗体结合的荧光染料，专门针对的免疫球蛋白的类（或子类）的主机中，对一次抗体生成感兴趣的。当从多个主机的第一抗体（小鼠，兔，鸡）一起使用时，我们使用了针对每个主机和每个所用的第二抗体的一次抗体的二次抗体，典型的交叉吸附对其他主机的免疫球蛋白从尽量减少交叉主办免疫反应。阳性对照包括已知表达感兴趣的抗原，可以使用直接或间接的与主针对这些抗原的抗体的免疫反应的细胞制剂的直接或间接的免疫染色。上述的优化方法进行一次，为每种类型的免疫染色实验。控制免疫反应，没有发现显着的跨间小学和中学抗体的抗原决定簇的免疫反应。流式细胞仪进行均匀暂停荧光标记的细胞使用一个FACVantage SE细胞分选仪（BD Biosciences公司，圣何塞，加利福尼亚州）配备了3个激光器，它提供了激发波长调整到488纳米，647纳米，和广阔的紫外线（351-364纳米）（ 图2） 。
5。免疫荧光法
注：对于免疫实验中，PDO镀寡中等+ GF或寡媒介- GF 2.5e5在6孔板涂有PDL。在停药后的生长因子的各时间点，将细胞固定在2％的PFA。抗体染色塑料6孔板，而不是盖玻片上进行。
- 取出介质，添加2％PFA。在室温下孵育10分钟。丢弃PFA。 ，每次5 min，用PBS洗涤细胞3次。要小心，不要干出细胞。
- 细胞内的标记，用在PBS中的0.25％的仓鼠溶液中10分钟，在RT 3.Permeabilize细胞。
- 为了防止非特异性结合，阻止细胞fHHG（1mM的HEPES缓冲液，2％马血清和10％山羊血清在Hanks'平衡盐溶液）或10分钟。特定的初级抗体（ 表2）稀释到一个预先确定的浓度在HHG。将摊薄到细胞抗体。摇床或在4℃下过夜，在室温下孵育1小时。
- 洗涤细胞3次，每次5分钟，用PBS。稀释适当的二级抗体与荧光染料到一个预先确定的浓度在HHG（ 表2），耦合。将稀释的第二抗体的混合物到细胞上。在室温孵育1小时在振荡器上在黑暗中。
- 洗涤细胞3次，每次5分钟，用PBS。
- 为了避免漂白加入10μl延长黄金DAPI染色的细胞，在它们上面放置盖玻片。可视化用Axiovert 200M的荧光显微镜（Zeiss，索恩伍德，NY），（ 图3）的标记的细胞。
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Representative Results
这是非常重要的，从70％-80％汇合的神经前体细胞培养物（ 图1A）启动的分化过程。许多细胞就会死亡后改变培养基从祖寡介质的，因为它包含了特殊的生长因子。这表明，没有承诺的少突胶质型神经祖细胞的增长将不支持新媒体（ 图1B）。孵育在一个星期的培养基+ GF低聚导致在中间文化表现出窄的，双极的形态（ 图1B）。将细胞保持在低聚培养基+ GF为3-4周（ 图1C）。从培养基中的生长因子撤出导致逐步分化的细胞培养中，与多个过程（ 图1D）。流式细胞术用于定量的数据表示形式。
图2A，图2B和2C表明，大多数神经祖细胞表达神经上皮干细胞标记物巢，而只有小亚群表达谱系限制性的标记，如星形胶质细胞标志物GFAP（ 图2A），神经元标记III类β-微管蛋白（ 图2B）或的少突胶质细胞的标记物O4（ 图2C）。当培养基代替与寡核苷酸培养基+ GF和细胞培养1周，减少nestin表达和增加A2B5表达式可以观察到（ 图2D）。 A2B5是一种神经胶质细胞的前体标记。相比之下，2周后，更换培养基，nestin表达率进一步减小和A2B5表达单独增加（ 图2E）以及作为另一个少突胶质细胞的标记物，O4（ 图2F）的表达。两天后提取生长因子，O4表达增加以及的表达GALC，一个后期少突胶质细胞的标记（ 图2G）。六天后生长因子撤出，的共表达的O4和GALC增加（ 图2H）和共表达GALC和MBP（ 图2I）媲美。多表位的免疫染色表明，在培养的细胞中的一半以上的表达MBP（ 图2J）。进一步的证据PDO的分化，其特征在于，使用免疫荧光法，在这些细胞中的时间增加MBP表达生长因子后撤回（ 图3A-C）。综上所述，人类胎儿神经祖细胞能够在体外增殖，同时保持能力，以分化成3个主要的脑细胞类型（ 图4）。
图1。相差显微镜ØF（A）神经祖细胞的祖介质（B）神经祖细胞生长在培养基+ GF寡一周表现出改变的狭窄，双极性形态;（C）有区别的祖源少突胶质细胞生长寡中等3天生长因子撤出后表现出少突胶质细胞的形态特征由多个进程。 20倍的放大倍率。
图2。流式细胞仪分析神经祖细胞共同表达的前体细胞标记巢（垂直轴）：（A）星形胶质细胞标记物GFAP（B）神经元的标志物βIII微管蛋白;和（C）的少突胶质标记O4（D）神经祖细胞生长的一个星期，寡媒体+ GF共表达NESTIŇ和A2B5;（E）巢和A2B5共同表达后的神经祖细胞的增长寡中等+ GF（F）A2B5和O4合作，表达的神经祖细胞的增长寡中等+ GF两周后两周;（G）2天生长因子撤出后，明显的少突胶质细胞的分化标志物，O4和GALC的，都表达出来。六天后，生长因子撤出（H）的细胞比例增加双阳性为O4和GALC;（I）双阳性的GALC和MPB;（J）O4和MBP双阳性。 AJ是代表四个独立的试验。 点击此处查看大图 。
图3。间接immunofluorMBP（A）2日，（B），（C，D）9天生长因子撤出后与祖衍生的少突胶质细胞escence染色。 （D）表示相位图像9天的文化在寡媒介- GF（E）是一个扩大的白框相同的图像。（A，B）放大20倍;（C，D）32倍的放大倍率。
图4。我们的细胞培养模型的示意图。伯，人类胎儿脑源性，多能的神经祖细胞在体外增殖，同时保持其可塑性。使用不同的培养条件下，神经祖细胞可以分化成神经元（PDN），星形胶质细胞（PDA）和少突胶质细胞（PDO），所示的特定的分异离子标记。
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Discussion
本协议描述了如何推导出胎儿主要的人类神经祖细胞和少突胶质细胞的表型的特征，同时使用流式细胞仪和免疫荧光染色。从胎儿中枢神经系统的神经祖细胞的扩张和增长已经非常好1-4。然而，获得足够的人力的少突胶质细胞， 在体外实验仍然很困难的，即使它是可能的识别和分离胶质前体从成人脑白质5-13。已经有不同的尝试各种文化条件下的发展产生少突胶质细胞14-21胎儿成髓鞘的神经祖细胞定向分化的。该协议还描述巢蛋白阳性神经祖细胞表达O4标记（ 图2），在与选定的生长因子（PDGF-AA，碱性成纤维细胞生长因子中，Shh，和NT-3）中，t的无血清的培养基中生长3周时帽子是必不可少的少突胶质前体细胞系细胞的增殖和存活22-24。除去这些生长因子在O4 +细胞导致在进一步的分化和髓鞘组件（半乳糖脑苷和MB）中的表达。此外，少突胶质细胞的分化标记物的表达，与从细胞中，在第一次出现狭窄，双极性（ 图1B）成为多极化具有发达的进程（ 图1C）的细胞的形态学变化一致。去除生长因子的基础上进一步允许的最后步骤，分化的研究在小鼠和人类的15,25。三碘甲腺原氨酸（T3）的存在下，少突胶质细胞的存活和分化26是很重要的，而我们观察到该去除的四个生长因子的最终分化标志物的表达是必要的。这是与细胞保持在低聚培养基+ GF一个SA控制。
我们是不是第一次来形容多向分化的神经祖细胞，少突胶质细胞的信号，如Shh和碱性成纤维细胞生长因子24。以往的报道显示，大约10周的胎龄与人类胎儿的少突胶质细胞髓鞘的能力，增加比例随胎龄22人24的皮质oligodendrogenesis开始。半乳糖脑苷脂分化的+和O4 +少突胶质前体细胞的神经祖细胞已使用孕中期胎儿的大脑21,27。然而，这些细胞不支持包括星形胶质细胞和神经元的细胞增殖的情况下，并随着时间的推移在培养21迅速丢失。我们的系统支持，形成GALC +和MBP +细胞从人胎文化从8周的胎龄。此外，我们所描述的differe可以培养在体外 ntiated少突胶质细胞，需要支持细胞，星形胶质细胞或神经元的情况下，虽然可以延长与神经元的共同培养的分化的少突胶质细胞的生存。本协议的一个好处是培养大量的细胞表达O4 +标记可以生长，传代培养的几个星期，同时保持其表型的可能性。在那一刻，那些O4 +细胞分化的最后一步时，从培养基中除去生长因子可以进一步推入。本文中列出的协议，解决了少突胶质细胞谱系，适合在体外实验的需要。此外，我们相信，识别特定的级联神经祖细胞诱导分化的因素对源性祖细胞，少突胶质细胞发育的细胞和分子机制是非常重要的转换。它也可以作为一个重要的工具，脱髓鞘疾病，病毒与宿主细胞的相互作用研究，如人类嗜神经病毒JCV的发病机制。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项研究是在美国国立卫生研究院，NINDS的院内研究计划。与显微镜的帮助和Pamela C.筛分帮助编辑，作者要感谢所有成员的实验室，分子医学，神经科学，里克·德赖弗斯。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DME/HAMS F12 1:1 | Omega Scientist | DM-251 | 1X | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine Albumin | Sigma | A9418 | 1% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Gentamicin | Quality Biologicals | 120-098-031 | 50 μg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-Glutamine | Quality Biologicals | 118-084-061 | 2 mM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| T3 | Sigma | T2877 | 3 nM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| N2 Components | Gibco BRL | 17502 | 1:100 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Shh | R&D System | 1314-SH/CF | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| bFGF | PeproTech Inc | 100-18B | 20 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 10 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDL | Sigma | P6407 | 50 μg/m | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | 2% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin | Quality Biologicals | 118-087-721 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Papain | Worthington | LK003178 | 20 U/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DNase vials | Worthington | LK003172 | 0.005% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EBSS | Worthington | LK003188 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ProLong Gold with DAPI |
Invitrogen | P36931 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. Reagents. |
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Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phyc–rythrin; PETR, phyc–rythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken. |
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