Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Stamfader-afledt oligodendrocyt Culture System fra human føtal hjerne

Published: December 20, 2012 doi: 10.3791/4274
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Neurophysiology, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

Primær, humane føtale hjerne-afledte, multipotentielle progenitorceller formere sig

Abstract

Differentiering af humane neurale progenitorer til neuronale og gliale celletyper en model for at undersøge og sammenligne molekylære regulering af neural cellelinie udvikling. In vitro ekspansion af neurale progenitorer fra føtalt CNS-væv er blevet godt karakteriseret. Trods identifikation og isolering af gliale progenitorer fra voksent menneske subcorticale hvide substans og udvikling af forskellige dyrkningsbetingelser til direkte differentiering af føtale neurale stamceller i myelin producerende oligodendrocytter, erhverve tilstrækkelige menneskelige oligodendrocytter til in vitro eksperimenter stadig vanskelig. Differentiering af galactocerebrosid + (GalC) og O4 + oligodendrocyt precursor eller progenitorceller (OPC) fra neurale precursorceller er blevet rapporteret ved hjælp af andet trimester føtal hjerne. Men disse celler ikke proliferere i fraværet af bæreceller herunder astrocytter og neuroner, og går tabt hurtigt over tid i kultur. Der er stadig behov for et dyrkningssystem til fremstilling af celler af oligodendrocyt-afstamning egnet til in vitro forsøg.

Kultur af primære humane oligodendrocytter kan for eksempel være en nyttig model til at studere patogenesen af neurotrofiske infektiøse agenser såsom det menneskelige polyomavirus, JCV, at in vivo inficerer disse celler. Disse dyrkede celler kan også modeller for andre demyelinerende sygdomme i centralnervesystemet (CNS). Primær, human føtal hjerne-afledt, multipotentielle neurale stamceller formere sig in vitro og samtidig bevare evnen til at differentiere til neuroner (stamfader-afledte neuroner, PDN) og astrocytter (stamfader-afledte astrocytter, PDA) Denne undersøgelse viser, at neurale stamceller kan induceres at differentiere gennem mange af de faser af oligodendrocytic afstamning udvikling (stamfader-afledte oligodendrocytter, BOB). Vi kultur neurale progenitorceller i DMEM-F12 serumfrie medier supsuppleret med basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF), blodpladeafledt vækstfaktor (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), neurotrofisk faktor 3 (NT-3), N-2 og triiodothyronin (T3). De dyrkede celler er passage ved 2.5e6 celler pr 75cm kolber hver ca syv dage. Under anvendelse af disse betingelser, opretholde hovedparten af ​​celler i kultur en morfologi karakteriseret ved nogle processer og udtrykker markører for præ-oligodendrocytceller såsom A2B5 og O-4. Når vi fjerne de fire vækstfaktorer (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3), og der tilsættes konditionerede medier fra PDN, cellerne begynder at erhverve flere processer og udtrykker markører specifikke for oligodendrocyt-differentiering, såsom GalC og myelin basisk protein (MBP). Vi udførte fænotypisk karakterisering ved hjælp af flerfarvet flowcytometri til at identificere entydige markører for oligodendrocyt.

Protocol

Bemærk: Til rutinemæssig dyrkning af neurale stamceller og oligodendrocytic afstamningsceller, er inkubation udføres ved 37 ° C i en befugtet 5% CO2-atmosfære. Hver 2 dage, udskiftes mediet med 50 til 100% frisk medium, hvis kultur er 40-70% sammenflydende. På tidspunktet for nær sammenløb, er kulturerne passeres på 2-2.5e6/T75 kolbe som regel på et ugeskema.

1. Fremstilling af de overtrukne Flask

  1. Til fremstilling af overtrukne kolber fortyndes 5 mg poly-D-lysin (PDL) i 100 ml deioniseret vand (DI-vand), påfør derefter T75-kolber med 50 ug / ml PDL ved stuetemperatur (RT) i mørke. Efter 1 ½ time, opsug PDL og skyl kolberne en gang med DI-vand. Lad kolberne tørre før podning af cellerne (tabel 1).

2. Start Differentiering af neurale stamceller til progenitor-afledte Oligodendrocytter (BOB)

Protokollen til, erolat humane CNS-progenitorceller er beskrevet i en tidligere publikation, og det er ikke en del af denne protokol 1. Humane CNS-progenitorceller blev isoleret fra telencephalon af en 8 ugers gestation føtal hjerne, opnået i overensstemmelse med NIH retningslinier.

  1. Grow multipotente population af neurale progenitorceller til PDL overtrukne kolber i Neurobasal medium suppleret med 25 ng / ml bFGF og 20 ng / ml epidermal vækstfaktor (EGF) (figur 1A). Må ikke bruge dem, hvis højere end passage 11 (P11).
  2. Begynde at differentiere de neurale progenitorceller, når kulturen er 70% sammenflydende.
  3. Foretage fuldstændig differentiering oligodendrocyt-medium ved anvendelse af serumfrit DMEM / Hams F12 01:01 medium suppleret med bovint serumalbumin, L-glutamin, gentamicin, N2 komponenter, T3, Shh, NT-3, bFGF og PDGF-AA (tabel 1) . Dette medium vil blive defineret som oligo medium med vækstfaktorer (oligo medium + GF).
  4. Fjern progenMonitor medium fra kolberne, skylles cellerne én gang med phosphatbufret saltvand (PBS), hvorefter der tilsættes oligo medium + GF (detaljer er beskrevet i 2.3) at starte oligodendrocyt differentiering. Kun celler engageret i oligodendrocytic slægt vil vokse (figur 1B). Dyrke cellerne i dette medium i tre uger.
  5. Hver uge, når cellerne er ved 90-95% konfluens, passage dem ved hjælp af trypsin (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml til en T75-kolbe). Overfør hele mediet fra cellerne, der skal passeret i en 50 ml konisk rør, og dette konditionerede medium vil blive anvendt til at slukke trypsin. Sørg for ikke at tørre ud cellerne. Derpå tilsættes trypsin.
  6. Cellerne inkuberes i trypsin i 5 minutter ved stuetemperatur, forsigtigt at banke på kolben flere gange for at hjælpe celle adskillelse.
  7. Slukke trypsin ved tilsætning af 4-5 ml konditioneret medium til kolben med de løsnede celler.
  8. Overfør medium, og cellerne til samme 50 ml konisk rør. Centrifuger mediet og cellerne ved 1.200 rpm (~300 x g) i 5 minutter ved stuetemperatur.
  9. Aspirer supernatanten, resuspender cellepelleten, forsigtigt deponering røret, og derefter tilsættes frisk oligo medium + GF. Forsigtigt pipette medium, og cellerne op og ned for at fremstille en ensartet cellesuspension.
  10. Tæl celler og overføre 2.5e6 til hver ny PDL-belagt T75 kolbe.

3. Sidste trin i differentieringen af ​​Oligodendrocytter

  1. Efter 3 ugers dyrkning i oligo medium + GF, når cellerne er ved 70-80% konfluens, begynder den endelige proces differentiering (figur 1C).
  2. Fremstille mediet på samme måde som oligo medium + GF, men uden tilsætning af de fire GF: Shh, NT-3, bFGF og PDGF-AA. Dette medium uden de fire GF vil blive defineret som oligo medium - GF.
  3. Aspirer oligo medium + GF fra kolben, skylles en gang med PBS og derefter tilføje et samlet volumen på 16 ml medium, som ¾ (12 ml) er oligo medium - GF og ¼ (4 ml) er PDN konditioneret medium, for 6-10 Dage). Anvendelsen af ​​konditioneret medium fra PDN er ikke kritisk for differentieringsprocessen eller overlevelsen af ​​cellerne. Vi faktisk observeret, at kun direkte kontakt med BOB med PdN celler i co-kultur eksperimenter havde en virkning på længden af ​​BOB overlevelse. Den overlevelsestid i oligo medium - GF kunne forlænges til to eller tre uger, hvis BOB-celler dyrkes sammen med PdN celler. Protokollen at differentiere humane neurale stamceller til PDN er beskrevet i en tidligere publikation, og det er ikke en del af denne protokol 1. Vækstfaktor tilbagetrækning fra dyrkningsmediet resulterer i progressivt differentieret kultur af celler med multiple processer (figur 1D).

4. Flowcytometri-analyse

Den flowcytometri analysen sammenligner erhvervelse af oligodendrocyt markører under differentieringen proces i forhold til de af deres forældres befolkning.

  1. Brug neurale progenitors som kontrol. Seed BOB celler ved 2.5x10 6 celler i to T75 kolber belagt med poly-D-lysin i oligo medium + GF.
  2. En uge senere, erstatte medium med frisk oligo medium + GF i kolber som en kontrol kultur for cellelevedygtighed, mens andre kolber havde oligo medium - GF.
  3. At dissociere BOB celler i begge medier bruger 20 U / ml papain og ikke trypsin. Dette skyldes, papain har en blidere virkning på cellerne under dissociation bevare den cellulære morfologi.
  4. Der tilsættes 5 ml Earles Balanced Salt Solution (EBSS) til en papain hætteglas. Placer hætteglasset ved 37 ° C i 10 minutter eller indtil papain fuldstændigt opløst, og opløsningen synes klart. Dette er den papain opløsning, der anvendes til at dissociere cellerne.
  5. Tilsæt 0,5 ml EBSS til en deoxyribonuklease I (DNase) hætteglas (tabel 1). Bland forsigtigt. Tilføj 0,25 ml af denne opløsning i hætteglasset med opløst papain. Dette præparat indeholder en slutkoncentration på cirka 20 U / ml papain og 00,005% DNase.
  6. Sted papain opløsning (som beskrevet ovenfor) på cellerne og inkuberes ved 37 ° C i 15-30 min; overvåge frigørelse af cellerne under anvendelse af et mikroskop. Reaktionen standses med 5 ml medium med eller uden GF og der centrifugeres ved 1200 rpm i 7 min.
  7. Overfør cellepellets fra begge kolber i to forskellige 5 ml polypropylenrør og vaske dem med normal fysiologisk medium (NPM: 145 mM NaCI, 5 mM KCI, 1,8 mM CaCl2, 10 mM Hepes og 10 mM glucose) suppleret med 1 mg / ml bovint serumalbumin (NPM + BSA).
  8. Udfør overflade immunfarvning ved 4 ° C i 20 min ved hjælp af specifikke og passende titreres primære antistoffer for A2B5, O4, GalC (Tabel 2).
  9. Vask cellerne med NPM + BSA ved 4 ° C i 5 minutter og inkubere dem med specifikke sekundære antistoffer ved 4 ° C i 20 minutter (tabel 2).
  10. Til farvning af intracellulære antigener, herunder nestin, fibrillært surt gliaprotein (GFAP), klasse III og væreta,-tubulin, og myelin basisk protein (MBP) (tabel 2), løse celler i 2% paraformaldehyd (PFA) i 20 minutter ved RT og permeabilisere med kold 70% ethanol i 15 minutter ved -20 ° C.
  11. Vask cellerne med 1 x PBS og inkuberes med specifikke sekundære antistoffer (tabel 2).
  12. At skelne mellem intakte celler og subcellulære rester i flowcytometrianalyse, farves cellerne med 4,6-diamidino-2-phenyllindole, dihydrochlorid (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY).
  13. Ved at optimere den ovennævnte protokol, udførte vi alle nødvendige kontrolforsøg for at bekræfte specificiteten af ​​hver immunoreagent. Kort beskrevet for direkte mærkede antistoffer, var en passende negativ kontrol et direkte konjugeret antistof af samme immunoglobulinisotype klasse (eller underklasse) og fluorochrom konjugat som det primære antistof (dvs. isotypekontrol). Til indirekte immunfarvning af primære antistoffer, den passende negative kontrol wsom det sekundære antistof konjugeret til fluorochromet af interesse, som specifikt er målrettet immunglobulin-klasse (eller underklasse) af værten, hvor det primære antistof blev genereret. Når primære antistoffer fra flere værter (mus, kanin, kylling) blev anvendt sammen, anvendte vi det sekundære antistof rettet mod det primære antistof for hver vært anvendes, og hvert sekundært antistof blev typisk tværs adsorberet mod immunoglobulinerne fra de andre værter for at minimere cross- vært immunoreaktivitet. De positive kontroller omfattede direkte eller indirekte immunfarvning af cellepræparater vides at udtrykke antigener af interesse ved anvendelse af enten direkte eller indirekte immunreaktioner med de primære antistoffer specifikke for disse antigener. De ovennævnte optimeringsmetoder blev udført en gang for hver type immunfarvning eksperimenter. Kontrol immunreaktioner viste ingen signifikant cross-epitop immunoreaktivitet blandt primære og sekundære antistoffer. Flowcytometri blev udført på en ensartetsuspenderede fluorescensmærkede celler under anvendelse af en FACVantage SE cellesorterer (BD Biosciences, San Jose, CA) udstyret med tre lasere, der giver excitationsbølgelængder tunet til 488 nm, 647 nm, og en bred UV (351-364 nm) (figur 2) .

5. Immunofluorescens Assay

Bemærk: For immunofluorescens eksperimenter, er BOB udplades i oligo medium + GF eller oligo medium - GF ved 2.5e5 i 6 brøndplader belagt med PDL. Cellerne fikseres i 2% PFA på forskellige tidspunkter efter tilbagetrækning af vækstfaktorer. Antistoffet stain udføres på plast plader med 6 brønde i stedet for dækglas.

  1. Fjern mediet, og tilsæt 2% PFA. Inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur. Kassér PFA. Vask cellerne 3 gange med PBS, 5 min hver gang. Vær omhyggelig med ikke at tørre ud cellerne.
  2. Permeabilisere celler til intracellulære markører ved hjælp af 0,25% triton-opløsning i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
  3. For at forhindre uspecifik binding, blok celler feller 10 min med HHG (1 mM HEPES-buffer, 2% hesteserum og 10% gedeserum i Hanks 'balancerede saltopløsning). Fortynd specifikke primære antistoffer (tabel 2) til en forudbestemt koncentration i HHG. Anbring fortyndede antistoffer på celler. Inkuber 1 time ved stuetemperatur på rysteapparatet eller ved 4 ° C natten over.
  4. Vask cellerne 3 gange med PBS, i 5 minutter hver gang. Fortynd passende sekundære antistoffer (tabel 2) sammen med et fluorokrom til en forudbestemt koncentration i HHG. Anbring blandingen af ​​fortyndet sekundære antistoffer på celler. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur på et rysteapparat i mørke.
  5. Vask cellerne 3 gange med PBS, i 5 minutter hver gang.
  6. For at undgå fotoblegning tilsættes 10 pi Forlæng Gold med DAPI til cellerne og anbringe et dækglas på toppen af ​​dem. Visualisere mærkede celler under anvendelse af et Axiovert 200M fluorescensmikroskop (Zeiss, Thornwood, NY) (figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det er meget vigtigt at starte differentieringsprocessen fra en 70% -80% konfluente neural progenitorcelle kultur (figur 1A). Mange celler vil dø ud efter erstatning af dyrkningsmediet fra progenitoren til oligo medium eftersom den omfatter specifikke vækstfaktorer. Dette indikerer, at væksten af neurale progenitorceller ikke er disponeret for en oligodendrocytic fænotype ikke vil blive støttet af det nye medie (figur 1B). Inkubering i oligo medium + GF i en uge resulterede i en mellemliggende kultur udviser en smal, bipolar morfologi (figur 1B). Cellerne holdes i oligo medium + GF i 3-4 uger (figur 1C). Vækstfaktor tilbagetrækning fra dyrkningsmediet resulterede i gradvist differentieret kultur af celler med flere processer (figur 1D). Flowcytometri anvendes til kvantitativ repræsentation af dataene.

Figur 2A, 2B og 2C viser, at de fleste neurale progenitorer udtrykte neuroepitelceller stamceller markør nestin, og kun små subpopulationer udtrykte slægt-restriktive markører, såsom det astrocyt markør GFAP (figur 2A), den neuronale markør III β-tubulin (figur 2B) , eller det oligodendrocyt-markør O4 (figur 2C). Når dyrkningsmedium blev erstattet med oligo medium + GF, og celler blev dyrket i 1 uge, faldt nestin ekspression og forøget A2B5 ekspression kan observeres (figur 2D). A2B5 er en neuroglial precursor markør. Til sammenligning, 2 uger efter medium udskiftning blev nestin ekspression yderligere ned og A2B5 ekspression alene øgede (figur 2E) såvel som ekspressionen af et andet oligodendrocyt-markør, O4 (figur 2F). To dage efter vækstfaktor tilbagetrækning, O4 ekspression steg samt ekspressionen af ​​GalC, etsen oligodendrocyt-markør (fig. 2G). Seks dage efter vækstfaktor tilbagetrækning, co-ekspression af O4 og GalC steget (figur 2H) og kan sammenlignes med den co-ekspression af GalC og MBP (figur 2I). The multi-epitop immunofarvning viser, at mere end halvdelen af cellerne i kultur udtrykker MBP (figur 2J). Yderligere tegn på BOB differentiering blev karakteriseret under anvendelse af et immunfluorescens-assay, af det tidsmæssige stigning af MBP-ekspression i disse celler efter vækstfaktor tilbagetrækning (figur 3A-C). Sammenfattende er humane føtale neurale progenitorceller kunne proliferere in vitro under opretholdelse af evnen til at differentiere til 3 større hjerne celletyper (figur 4).

Figur 1
Figur 1. Fasekontrastmikroskopi of (A) neurale progenitorceller dyrket i stamcelle medium, (B) neurale progenitorceller dyrket i oligo medium + GF i en uge udviser en ændret smal, bipolar morfologi, (C) differentierede progenitor-afledte oligodendrocytter dyrket i 3 dage i oligo medium efter vækstfaktor tilbagetrækning udviser oligodendrocyt morfologi karakteriseret ved flere processer. 20x forstørrelse.

Figur 2
Figur 2 Flowcytometrianalyse af neurale progenitorceller coekspression precursoren-cellemarkør Nestin (alle vertikale akser) med:. (A) den astrocytisk markør GFAP, (B) den neuronale markør β III tubulin og (C) den oligodendrocytic markør O4, (D) neurale progenitorceller dyrket i en uge i oligo medier + GF co-udtrykker Nestin og A2B5, (E) nestin og A2B5 co-ekspression efter to ugers neurale progenitorer vækst i oligo medium + GF (F) A2B5 og O4 co-ekspression efter to ugers neurale progenitorer vækst i oligo medium + GF, (G) to dage efter vækstfaktor tilbagetrækning, der adskilte oligodendrocyt markører for differentiering, O4 og GalC udtrykt. Seks dage efter vækstfaktor tilbagetrækning (H) en øget andel af celler er dobbelt positive for O4 og GalC, (I) dobbelt-positive for GalC og MPB og (J) dobbelt-positive for O4 og MBP. AJ er repræsentative for fire uafhængige forsøg. Klik her for at se større figur .

Figur 3
Figur 3. Indirekte immunofluorescence farvning af progenitor-afledte oligodendrocytter for MBP (A) 2 dage, (b) 5 dage, og (C, D) 9 dage efter vækstfaktor tilbagetrækning. (D) Repræsenterer fase billedet af de 9 dage kultur i oligo medium - GF og (E) er en udvidelse af den hvide kasse med det samme billede (A, B) 20x forstørrelse, (C, D) 32x forstørrelse..

Figur 4
Fig. 4. Skematisk fremstilling af vores cellekultur-model. Primære, human føtal hjerne-afledt, multipotentielle neurale progenitorceller formere in vitro og bevarelse af deres plasticitet. Brug af forskellige dyrkningsbetingelser, kan neurale progenitorceller differentiere til neuroner (PDN), astrocytter (PDA) og oligodendrocyt (BOB), som vist ved specifikke differentiation markører.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver, hvordan man kan udlede føtale oligodendrocytter fra primære humane neurale stamceller og karakterisere deres fænotype ved hjælp af både flowcytometri og immunfluorescensfarvning. Den ekspansion og vækst af neurale stamceller fra fostre CNS har været meget godt beskrevet 1-4. Men opnåelse af tilstrækkelige menneskelige oligodendrocytter til in vitro-eksperimenter stadig vanskeligt, selv om det er muligt at identificere og isolere gliale precursorer fra voksen human hvide substans 5-13. Der har været forskellige forsøg på udviklingen af forskellige dyrkningsbetingelser til direkte differentiering af føtale neurale stamceller i myelin producerende oligodendrocytter 14-21. Denne protokol beskrives endvidere nestin positive neurale progenitorceller udtrykker O4 markør (fig. 2), når den dyrkes i 3 uger i et serumfrit medium suppleret med udvalgte vækstfaktorer (PDGF-AA, bFGF, Shh, og NT-3), that er afgørende for spredning og overlevelse af oligodendrocyt forstadier 22-24. Fjernelsen af ​​disse vækstfaktorer i O4 +-celler resulterede i yderligere differentiering og ekspression af myelin komponenter (galactocerebrosid og MB). Desuden falder ekspressionen af oligodendrocyt differentieringsmarkører med morfologiske ændringer fra celler, som først forekom smalle og bipolar (figur 1B) til celler, der bliver multipolær med veludviklede processer (figur 1C). Fjernelsen af vækstfaktorer til yderligere at tillade de sidste trin af differentiering var baseret på undersøgelser udført i både mus og menneske 15,25. Tilstedeværelsen af triiodothyronin (T3) er vigtig for overlevelse og differentiering af oligodendrocytter 26, mens vi observeret, at fjernelse af de fire vækstfaktorer var nødvendig for ekspression af de endelige markører for differentiering. Dette blev sammenlignet med celler holdt i oligo medium + GF asaid kontrol.

Vi er ikke den første til at beskrive differentiering af multipotente neurale progenitorceller til oligodendrocytceller som reaktion på signaler såsom Shh og bFGF 24. Tidligere rapporter viste, at kortikale oligodendrogenesis begynder omkring 10 uger gestationsalder hos mennesker 24 med en kapacitet på humane føtale oligodendrocytter at myelinate stigende proportionalt med gestationsalder 22. Differentiering af galactocerebrosid + og O4 + oligodendrocytceller precursorceller fra neurale stamceller er blevet rapporteret ved hjælp af andet trimester føtal hjerne 21,27. Men disse celler ikke proliferere i fraværet af bæreceller herunder astrocytter og neuroner, og går tabt hurtigt med tiden i kultur 21. Vores system understøtter dannelsen af GalC + og MBP +-celler fra human føtal kultur fra 8 uger gestationsalder. Endvidere har vi beskrevet, at Forskelntiated oligodendrocytter kan dyrkes in vitro uden behov for at støtte celler som astrocytter eller neuroner, selvom samdyrkning med neuroner kan forlænge overlevelsen af differentierede oligodendrocytter. Endnu en fordel ved denne protokol er det muligt at dyrke et større antal celler, der udtrykker O4 + markør, der kan dyrkes og passeres i kultur i uge under opretholdelse af deres fænotype. I det øjeblik disse O4 +-celler kan skubbes yderligere i det sidste trin af differentiering, når de vækstfaktorer fjernes fra mediet. Protokollen er skitseret i grønbogen omhandler behovet for oligodendrocyt slægter egnede til in vitro-eksperimenter. Desuden mener vi, at identifikationen af ​​specifikke faktorer, der inducerer differentiering kaskade af neurale stamceller i retning af progenitor-afledt oligodendrocyt er vigtigt for at forstå de cellulære og molekylære mekanismer i udviklingsmæssigovergange. Det kan også tjene som et vigtigt redskab til at studere demyeliniseringssygdomme og virus-værtscelle interaktioner vedrører patogenesen af ​​humane neurotrofiske virus som JCV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program ved National Institutes of Health, NINDS. Forfatterne vil gerne takke alle medlemmerne af Laboratory of Molecular Medicine og Neurovidenskab, Rick Dreyfuss for at hjælpe med mikroskopi og Pamela C. Sigtning for at hjælpe med redigeringen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DME/HAMS F12 1:1 Omega Scientist DM-251 1X
Bovine Albumin Sigma A9418 1%
Gentamicin Quality Biologicals 120-098-031 50 μg/ml
L-Glutamine Quality Biologicals 118-084-061 2 mM
T3 Sigma T2877 3 nM
N2 Components Gibco BRL 17502 1:100
NT-3 PeproTech Inc 450-03 2 ng/ml
Shh R&D System 1314-SH/CF 2 ng/ml
bFGF PeproTech Inc 100-18B 20 ng/ml
PDGF-AA PeproTech Inc 100-13A 10 ng/ml
PDL Sigma P6407 50 μg/m
PFA Electron Microscopy Sciences 15712 2%
Trypsin Quality Biologicals 118-087-721
Papain Worthington LK003178 20 U/ml
DNase vials Worthington LK003172 0.005%
EBSS Worthington LK003188
ProLong Gold
with DAPI		 Invitrogen P36931

Table 1. Reagents.
Primary Abs(all at 1 μg/ml) Species Isotype Source Secondary Abs
Flow Cytometry
A2B5-Biotin Mouse IgM Gift J. Nielson Streptavidin PETR, Invitrogen, CA
O4FITC Mouse IgM Gift from J. Nielson
A2B5 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
O4 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
GalC Mouse IgG3 Millipore, MA gαm IgG3-PE, Southern Biotech, AL
MBP Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA
Nestin Mouse IgG1 Messam et al. 200028 gαm IgG1-PECy5, Invitrogen, CA
GFAP Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA
βIII tubulin Mouse IgG2 Covance, CA gαm IgG2a-PETR, Invitrogen, CA
Immunocytochemistry
βIII tubulin
(1:1,500) 		Mouse IgG2a Covance, CA gαm IgG2a-FITC, Invitrogen, CA
(1:1,000)
GFAP
(1:1,000) 		Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA
(1:500)
MBP
(1:50)		 Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA
(1:100)
O4
(1:100) 		Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA
(1:100)
GalC
(1:10) 		Rabbit IgG Millipore, MA gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA
(1:100)

Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phyc–rythrin; PETR, phyc–rythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility. Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).
  2. Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
  3. Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
  4. McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276, 66-71 (1997).
  5. Belachew, S., et al. Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons. J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).
  6. Almazan, G., McKay, R. An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve. Brain Res. 579, 234-245 (1992).
  7. Filipovic, R., Zecevic, N. Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia. Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).
  8. Goldman, S. A., Natesan, S. A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus. Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).
  9. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nat. Med. 9, 439-447 (2003).
  10. Lyssiotis, C. A., et al. Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).
  11. Sim, F. J., Goldman, S. A. White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche. Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).
  12. Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium. Nature. 303, 390-396 (1983).
  13. Windrem, M. S., et al. Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain. J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).
  14. Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  15. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
  16. Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136, 1443-1452 (2009).
  17. Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).
  18. Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).
  19. Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
  20. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).
  21. Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. Tracing human oligodendroglial development in vitro. J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).
  22. Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).
  23. Chong, S. Y., Chan, J. R. Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted. J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).
  24. Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front Neuroanat. 3, 5 (2009).
  25. Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures. Stem Cells. 27, 116-125 (2009).
  26. D'Intino, G., et al. Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism. J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).
  27. Cui, Q. L., et al. Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate. Stem Cells Dev. , (2012).
  28. Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody. Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).

Tags

Neuroscience Developmental Biology Medicine Stem Cell Biology Molecular Biology cellebiologi fysiologi slægt karakterisering neurale stamceller differentiering cellekultur-model
Stamfader-afledt oligodendrocyt Culture System fra human føtal hjerne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monaco, M. C. G., Maric, D.,… More

Monaco, M. C. G., Maric, D., Bandeian, A., Leibovitch, E., Yang, W., Major, E. O. Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain. J. Vis. Exp. (70), e4274, doi:10.3791/4274 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter