Summary
Primaire, l'homme dérivés du cerveau du fœtus, des cellules progénitrices multipotentes prolifèrent
Abstract
Différenciation des progéniteurs neuronaux de l'homme dans les types de cellules neuronales et gliales propose un modèle pour étudier et comparer la régulation moléculaire du développement neuronal lignée cellulaire. En expansion in vitro des progéniteurs neuronaux du tissu du SNC du fœtus a été bien caractérisée. Malgré l'identification et l'isolement des progéniteurs gliales de l'adulte humain sous-corticale de la substance blanche et le développement des conditions de culture différentes de différenciation directe des cellules progénitrices neurales foetales en oligodendrocytes de myéline produire, acquérir suffisamment oligodendrocytes humains pour une expérimentation in vitro reste difficile. Différenciation des galactocérébroside + (GalC) et O4 + précurseurs d'oligodendrocytes ou cellules progénitrices (OPC) à partir de cellules précurseurs neurales ont été signalés à l'aide du cerveau du fœtus deuxième trimestre. Cependant, ces cellules ne prolifèrent en l'absence de cellules de soutien, y compris les astrocytes et les neurones, et se perdent rapidement au fil du temps dans la culture. Il subsiste le besoin d'un système de culture pour produire des cellules de la lignée oligodendrocytaire apte à une expérimentation in vitro.
Culture des oligodendrocytes humains primaires pourrait, par exemple, être un modèle utile pour étudier la pathogenèse de la neurotropes agents infectieux comme le polyomavirus humain, JCV, que in vivo infecte ces cellules. Ces cellules en culture pourrait également fournir des modèles d'autres maladies de démyélinisation du système nerveux central (SNC). Primaire, du fœtus humain dérivé du cerveau, les cellules progénitrices neurales pluripotentes proliférer in vitro tout en conservant la capacité de se différencier en neurones (progéniteurs des neurones dérivés, PDN) et les astrocytes (progéniteurs dérivés des astrocytes, PDA) Cette étude montre que les progéniteurs neuronaux peuvent être induites se différencier grâce à de nombreux stades de développement lignée oligodendrogliome (progéniteurs des oligodendrocytes dérivées, AOP). Nous cellules progénitrices neurales culture dans du DMEM-F12 sans sérum supplemented avec le facteur de croissance fibroblastique basique (bFGF), facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF-AA), Sonic Hedgehog (Shh), le facteur neurotrophique 3 (NT-3), N-2 et de la triiodothyronine (T3). Les cellules cultivées sont passées à cellules 2.5e6 par flacons de 75 cm environ tous les sept jours. L'utilisation de ces conditions, la plupart des cellules en culture maintenir une morphologie caractérisée par quelques procédés et expriment des marqueurs de cellules pré-oligodendrocytes, telles que A2B5 et O-4. Quand nous enlevons les facteurs de croissance quatre (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) et ajouter milieux conditionnés provenant de PDN, les cellules commencent à acquérir davantage de processus et de marqueurs spécifiques expresses de la différenciation des oligodendrocytes, comme GalC et de la myéline protéine de base (MBP). Nous avons effectué la caractérisation phénotypique par cytométrie en flux multicolores pour identifier des marqueurs uniques de oligodendrocytes.
Protocol
Remarque: Pour la culture de routine de progéniteurs neuronaux et cellules de la lignée oligodendrogliome, l'incubation se fait à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée 2 5% atmosphère. Tous les 2 jours, le milieu est remplacé à partir de 50 à 100% de milieu frais si la culture est confluente 40-70%. Au moment de la confluence proche, les cultures sont passées à 2-2.5e6/T75 flacon généralement sur une base hebdomadaire.
1. Préparer le flacon couché
- Pour préparer des flacons revêtus de diluer 5 mg de poly-D-lysine (PDL) dans 100 ml d'eau déminéralisée (eau déminéralisée), puis les enrober flacons T75 avec 50 pg / ml de PDL à la température ambiante (RT) dans l'obscurité. Après 1 ½ h, aspirer le PDL et rincer les flacons une fois avec de l'eau déminéralisée. Laissez les flacons secs avant l'ensemencement des cellules (tableau 1).
2. À partir de différenciation des cellules progénitrices neurales progénitrices oligodendrocytes en dérivés (AOP)
Le protocole estolate des cellules progénitrices du système nerveux central est décrit dans une publication antérieure et il ne fait pas partie de ce protocole 1. Les cellules souches du système nerveux central ont été isolés à partir du télencéphale d'un cerveau de 8 semaines de gestation du fœtus, obtenus conformément aux directives du NIH.
- Accroître la population multipotentielle des cellules progénitrices neurales sur PDL flacons revêtus en milieu neurobasal additionné de 25 ng / ml de bFGF et 20 ng / ml de facteur de croissance épidermique (EGF) (figure 1A). Ne les utilisez pas si élevé que le passage 11 (p11).
- Commencent à se différencier les cellules progénitrices neurales lorsque la culture est d'environ 70% de confluence.
- Assurez milieu de différenciation des oligodendrocytes complète à l'aide du DMEM sans sérum / JAMBONS milieu F12 01:01 complétée par la sérum albumine bovine, de L-glutamine, la gentamicine, composants N2, T3, Chut, NT-3, bFGF et PDGF-AA (tableau 1) . Ce milieu sera définie comme moyen oligo des facteurs de croissance (oligo moyenne + GF).
- Retirer Progenmédias Itor des flacons, rincer les cellules une fois avec un tampon phosphate salin (PBS), puis ajouter du milieu oligo + GF (détails décrits en 2.3) pour commencer la différenciation des oligodendrocytes. Seules les cellules engagées dans la lignée oligodendrogliome va croître (figure 1B). Culture des cellules dans ce milieu pendant 3 semaines.
- Chaque semaine, lorsque les cellules sont à confluence, passage de 90-95% les utilisant de la trypsine (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml pour un flacon T75). Transférer le support d'ensemble à partir des cellules à un passage dans un tube conique de 50 ml, ce milieu conditionné est utilisé pour étancher la trypsine. Assurez-vous de ne pas dessécher les cellules. Ensuite, ajoutez la trypsine.
- Incuber les cellules à la trypsine pendant 5 min à température ambiante, en tapotant doucement le flacon plusieurs fois pour aider le détachement des cellules.
- Étancher la trypsine en ajoutant 4-5 ml de milieu conditionné dans le ballon avec les cellules individuelles.
- Transférer le milieu et les cellules de la même 50 ml tube conique. Centrifuger le milieu et les cellules à 1200 rpm (~300 xg) pendant 5 min à température ambiante.
- Aspirer le surnageant, resuspendre le culot cellulaire, doucement basculer le tube, puis ajouter du milieu frais oligo + GF. Doucement moyen pipette et de cellules de haut en bas pour obtenir une suspension cellulaire uniforme.
- Compter le nombre de cellules de transfert, et 2.5e6 dans chaque nouvelle PDL revêtu T75 ballon.
3. Étape finale dans la différenciation des oligodendrocytes
- Après 3 semaines de culture en oligo moyenne + GF, lorsque les cellules sont à confluence de 70-80%, démarrez le processus final de différenciation (figure 1C).
- Préparer le milieu de la même manière que le moyen oligo + GF, mais sans adjonction de quatre GF: Shh, NT-3, bFGF et du PDGF-AA. Ce milieu sans le GF quatre seront définis comme moyen oligo - GF.
- Aspirer le milieu oligo + GF du flacon, rincer une fois avec du PBS puis ajouter un volume total de 16 ml de milieu, dont ¾ (12 ml) est un oligo moyennes - GF et ¼ (4 ml) est PDN milieu conditionné par 6-10 Jours). L'utilisation d'un milieu conditionné provenant PDN n'est pas critique pour le processus de différenciation ou de la survie des cellules. Nous avons en fait constaté que seulement le contact direct avec les cellules de l'AOP PDN dans des expériences de co-culture a eu un effet sur la durée de la survie PDO. Le temps de survie moyen en oligo - GF pourrait être prolongée jusqu'à deux ou trois semaines si les cellules AOP sont co-cultivées avec des cellules PDN. Le protocole de différencier des cellules souches neurales dans PDN est décrit dans une publication antérieure et il ne fait pas partie de ce protocole 1. Retrait du facteur de croissance à partir des résultats de milieux de culture en culture progressivement différenciées des cellules avec plusieurs processus (figure 1D).
4. Essai de cytométrie en flux
Le test de cytométrie en flux compare l'acquisition de marqueurs oligodendrocytes au cours du processus de différenciation par rapport à ceux de leur population parentale.
- Utilisez pro neuronesgéniteurs que le contrôle. Semences cellules PDO à 2,5.10 6 cellules dans deux flacons T75 recouvertes de poly-D-lysine en oligo moyenne + GF.
- Une semaine plus tard, remplacer moyenne avec oligo milieu frais + GF dans des flacons en tant que culture de contrôle pour la viabilité cellulaire, tandis que d'autres flacons ont oligo moyennes - GF.
- Pour dissocier les cellules AOP dans les médias utilisent 20 U / ml de papaïne et la trypsine pas. En effet, la papaïne a un doux effet sur les cellules au cours de la dissociation préserver la morphologie cellulaire.
- Ajouter 5 ml de solution saline équilibrée de Earle (EBSS) dans un flacon à la papaïne. Placer la fiole à 37 ° C pendant 10 minutes, ou jusqu'à ce que la papaïne est totalement dissous et la solution apparaît clairement. C'est la solution la papaïne utilisée pour dissocier les cellules.
- Ajouter 0,5 ml de EBSS à une désoxyribonucléase I (DNase) flacon (tableau 1). Mélanger doucement. Ajouter 0,25 ml de cette solution dans le flacon de la papaïne dissous. Cette préparation contient une concentration finale d'environ 20 U / ml et la papaïne 00,005% DNase.
- Lieu papaïne solution (comme décrit ci-dessus) sur les cellules et incuber à 37 ° C pendant 15-30 min, à surveiller le détachement des cellules à l'aide d'un microscope. Arrêter la réaction avec 5 ml de milieu avec ou sans GF et centrifuger à 1200 tours par minute pendant 7 min.
- Transfert culots cellulaires des deux flacons en deux différents tubes de 5 ml en polypropylène et lavez-les avec le milieu physiologique normal (NPM: 145 mM NaCl, 5 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2, 10 mM de HEPES et 10 mM glucose) additionné de 1 mg / ml sérum-albumine bovine (BSA + NPM).
- Effectuer surface immunomarquage à 4 ° C pendant 20 min en utilisant de manière appropriée spécifiques et titré les anticorps primaires pour A2B5, O4, GalC (tableau 2).
- Laver les cellules avec NPM + BSA à 4 ° C pendant 5 minutes et les incuber avec des anticorps secondaires à 4 ° C pendant 20 min (tableau 2).
- Pour colorer les antigènes intracellulaires, y compris la nestine, protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), classe III et êtreta;-tubuline, protéine basique de myéline et (MBP) (tableau 2), fixer les cellules dans du paraformaldéhyde à 2% (PFA) pendant 20 min à température ambiante et perméabiliser avec de l'éthanol 70% froid pendant 15 min à -20 ° C.
- Laver les cellules avec du PBS 1x et incuber avec des anticorps secondaires (tableau 2).
- Faire la distinction entre les cellules intactes et les débris subcellulaire lors de l'analyse par cytométrie en flux, colorer les cellules avec 4,6-diamidino-2-phenyllindole, dichlorhydrate (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY).
- En optimisant le protocole ci-dessus, nous avons effectué toutes les expériences de contrôle appropriés pour confirmer la spécificité de chaque réactif immunologique. En bref, pour les anticorps directement marqués, le contrôle négatif approprié était un anticorps directement conjugués de la classe même isotype d'immunoglobulines (ou sous-classe) et conjugué fluorochrome comme anticorps primaire (c.-à-isotype contrôle). Pour immunomarquage indirect des anticorps primaires, le contrôle négatif approprié wcomme anticorps secondaire conjugué à un fluorochrome l'intérêt que spécifiquement ciblé la classe d'immunoglobulines (ou sous-classe) de l'hôte dans lequel l'anticorps primaire a été généré. Lorsque anticorps primaires de plusieurs hôtes (souris, lapin, poulet) ont été utilisés ensemble, nous avons utilisé l'anticorps secondaire ciblant l'anticorps primaire de chaque hôte et chaque anticorps secondaire utilisé est généralement contre-adsorbé contre les immunoglobulines des autres hôtes pour minimiser les contre- accueillir immunoréactivité. Les contrôles positifs inclus immunomarquage direct ou indirect des préparations cellulaires connues pour exprimer les antigènes d'intérêt en utilisant soit des réactions immunologiques directs ou indirects avec les anticorps primaires spécifiques de ces antigènes. Les méthodes d'optimisation ci-dessus ont été effectuées une fois pour chaque type d'immunocoloration expériences. Immunoréactions de contrôle n'a pas révélé croisée significative épitope immunoréactivité des anticorps primaires et secondaires. La cytométrie en flux a été réalisée sur uniformesuspension des cellules marquées par fluorescence en utilisant une cellule SE FACVantage trieur (BD Biosciences, San Jose, CA) équipé de trois lasers qui fournissent des longueurs d'onde d'excitation accordés à 488 nm, 647 nm, et une large UV (351-364 nm) (Figure 2) .
5. Immunofluorescence
Remarque: Pour les expériences d'immunofluorescence, PDO sont plaqués en oligo moyenne + GF ou oligo moyennes - GF à 2.5e5 plaques à 6 puits revêtus de PDL. Les cellules sont fixées à 2% de PFA à différents moments après le retrait des facteurs de croissance. L'anticorps tache est réalisée sur plaques de 6 puits en plastique au lieu de lamelles de verre.
- Retirez le support et ajouter les 2% de PFA. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Jeter PFA. Laver les cellules 3 fois avec du PBS, à 5 min à chaque fois. Veillez à ne pas dessécher les cellules.
- Perméabiliser les cellules pour les marqueurs intracellulaires qui utilisent la solution de triton 0,25% dans du PBS pendant 10 min à température ambiante.
- Pour éviter la liaison non spécifique des cellules de bloc, fou 10 min avec HHG (1 mM de tampon HEPES, de sérum de cheval à 2%, et de sérum de chèvre à 10% dans une solution saline équilibrée de Hank). Diluer anticorps primaires spécifiques (tableau 2) à une concentration prédéterminée dans HHG. Placez anticorps dilué sur les cellules. Incuber 1 h à température ambiante sur l'agitateur ou à 4 ° C pendant la nuit.
- Laver les cellules 3 fois avec du PBS, pendant 5 minutes à chaque fois. Diluer appropriées Anticorps secondaires (tableau 2) couplées à un fluorochrome à une concentration prédéterminée dans HHG. Placer le mélange dilué d'Anticorps secondaires sur les cellules. Incuber 1 h à température ambiante sur un agitateur dans l'obscurité.
- Laver les cellules 3 fois avec du PBS, pendant 5 minutes à chaque fois.
- Pour éviter photoblanchiment ajouter 10 ul de prolonger l'or avec du DAPI dans les cellules et placer une lamelle de verre sur le dessus d'eux. Visualisez les cellules marquées à l'aide d'un microscope à fluorescence Axiovert 200M (Zeiss, Thornwood, NY) (figure 3).
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Representative Results
Il est très important de commencer le processus de différenciation à partir d'un 70% -80% culture confluente de cellules progénitrices de neurones (figure 1A). De nombreuses cellules meurent après avoir changé le milieu de culture des progéniteurs à moyen oligo car il inclut des facteurs de croissance spécifiques. Ceci indique que la croissance des cellules progénitrices neurales ne s'engagent pas à un phénotype oligodendrogliome ne seront pas pris en charge par le nouveau média (figure 1B). L'incubation en oligo moyenne + GF pendant une semaine a entraîné une culture intermédiaire présentant une étroite morphologie bipolaire (figure 1B). Les cellules sont maintenues en oligo moyenne + GF pendant 3-4 semaines (figure 1C). Retrait du facteur de croissance du milieu de culture a entraîné progressivement la culture de cellules différenciées avec plusieurs processus (figure 1D). La cytométrie en flux est utilisée pour la représentation quantitative des données.
Les figures 2A, 2B et 2C montrent que la majorité des progéniteurs neuronaux exprimé le neuroépithéliale cellules souches marqueur nestine, alors que seuls les petites sous-populations ont exprimé lignée restrictives des marqueurs tels que le marqueur des astrocytes GFAP (figure 2A), le marqueur neuronal classe III β-tubuline (figure 2B) ou le marqueur oligodendrocytes O4 (figure 2C). Lorsque le milieu de culture est remplacé par oligo moyenne + GF et les cellules ont été cultivées pendant 1 semaine, diminution de l'expression de la nestine et l'augmentation A2B5 expression peut être observée (figure 2D). A2B5 est un marqueur précurseur neurogliale. En comparaison, 2 semaines après le remplacement moyen, expression de la nestine a diminué encore plus loin et A2B5 expression seuls a augmenté (figure 2E) ainsi que l'expression d'un autre marqueur des oligodendrocytes, O4 (figure 2F). Deux jours après le retrait des facteurs de croissance, O4 augmentation de l'expression ainsi que l'expression de GalC, unfin marqueur oligodendrocytes (figure 2G). Six jours après le retrait de croissance facteur, la co-expression de O4 et GalC augmenté (figure 2H) et est comparable à la co-expression de GalC et MBP (figure 2I). L'immunomarquage multi-épitopique révèle que plus de la moitié des cellules en culture sont exprimant MBP (figure 2J). Une preuve supplémentaire de différenciation AOP a été caractérisé, en utilisant un test d'immunofluorescence, par l'augmentation temporelle de l'expression MBP dans ces cellules après le retrait du facteur de croissance (figure 3A-C). En résumé, foetales humaines cellules progénitrices neurales sont capables de proliférer in vitro tout en conservant la capacité de se différencier en 3 grands types de cellules cérébrales (figure 4).
Figure 1. Phase microscopie à contraste of (A) des cellules progénitrices neurales progénitrices cultivées dans un milieu, (B) des cellules progénitrices neurales cultivées en oligo moyenne + GF pendant une semaine présentent une altération étroit, la morphologie bipolaire; (C) différenciées dérivées de progéniteurs des oligodendrocytes cultivés pendant 3 jours dans oligo moyen après le retrait du facteur de croissance présentent la morphologie des oligodendrocytes caractérisé par plusieurs processus. Un grossissement de 20x.
Figure 2 Analyse par cytométrie en flux des cellules progénitrices neurales co-exprimant le marqueur de cellules-précurseur de nestine (tous les axes verticaux) avec:. (A) de la GFAP marqueur astrocytaire, (B) la β tubuline neuronale marqueur III, et (C) l'oligodendrogliome marqueur O4; (D) des cellules progénitrices neurales cultivées pendant une semaine en oligo médias + GF co-expriment nestin et A2B5; (E) nestine et A2B5 co-expression après deux semaines de croissance des progéniteurs neuronaux en oligo moyenne + GF (F) A2B5 et O4 co-expression après deux semaines de croissance des progéniteurs neuronaux en oligo moyenne + GF; (G) deux jours après le retrait du facteur de croissance, distincts des marqueurs de différenciation des oligodendrocytes, O4 et GalC, sont exprimés. Six jours après le retrait du facteur de croissance (H), une proportion accrue des cellules sont positives pour double-O4 et GalC; (I) double positif pour GalC et MPB, et (J) double positif pour O4, et MBP. AJ sont représentatifs de quatre expériences indépendantes. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Indirecte immunofluorcoloration escence de progéniteurs des oligodendrocytes dérivées de MBP (A) 2 jours, (B) 5 jours, et (C, D) 9 jours après le retrait du facteur de croissance. (D) Représente l'image de phase de la culture 9 jours en moyenne oligo - GF et (E) est un agrandissement de la zone blanche de la même image (A, B) un grossissement de 20x, (C, D) grossissement 32x..
Figure 4. Représentation schématique de notre modèle de culture cellulaire. Primaire, de foetus humain dérivé du cerveau, les cellules progénitrices neurales pluripotentes proliférer in vitro tout en conservant leur plasticité. Utiliser différentes conditions de culture, les cellules progénitrices neurales peuvent se différencier en neurones (PDN), les astrocytes (PDA) et les oligodendrocytes (AOP), comme le montre spécifique differentiatmarqueurs d'ions.
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Discussion
Ce protocole décrit la façon de calculer les oligodendrocytes à partir de fœtus humains primaires cellules progénitrices neurales et de caractériser leur phénotype en utilisant la cytométrie en flux à la fois et immunofluorescence. L'expansion et la croissance des progéniteurs neuronaux du système nerveux central du fœtus a été très bien décrit 1-4. Cependant, l'obtention d'oligodendrocytes humains suffisants pour une expérimentation in vitro reste difficile, même si il est possible d'identifier et d'isoler les précurseurs gliales de la substance blanche adulte humaine 5-13. Il ya eu différentes tentatives dans le développement de diverses conditions de culture de la différenciation directe des fœtus progéniteurs neuronaux en produisant la myéline des oligodendrocytes 14-21. Ce nouveau protocole décrit nestine positives cellules progénitrices neurales exprimant le marqueur O4 (Figure 2) lorsqu'elles sont cultivées pendant 3 semaines dans un milieu sans sérum supplémenté en facteurs de croissance de sélection (PDGF-AA, bFGF, Shh, et NT-3), tchapeau sont indispensables à la prolifération et la survie des précurseurs des oligodendrocytes 22-24. La suppression de ces facteurs de croissance dans les cellules O4 + conduit à une différenciation plus poussée et l'expression des constituants de la myéline (galactocérébroside et Mo). En outre, l'expression de marqueurs de différenciation des oligodendrocytes coïncide avec les changements morphologiques des cellules qui au premier abord semblait étroit et bipolaire (figure 1B) à des cellules qui deviennent multipolaire bien développées processus (figure 1C). L'élimination des facteurs de croissance permettent en outre les étapes finales de la distinction était fondée sur des études réalisées à la fois chez la souris et 15,25 humaine. La présence de la triiodothyronine (T3) est important pour la survie et la différenciation des oligodendrocytes 26, alors que nous avons observé que la suppression des quatre facteurs de croissance était nécessaire à l'expression de marqueurs de différenciation finale. Ceci a été comparé avec des cellules conservées en oligo moyenne + GF unesa maîtrise.
Nous ne sommes pas les premiers à décrire la différenciation des cellules progénitrices neurales pluripotentes aux cellules oligodendrocytes en réponse à des signaux tels que Shh et bFGF 24. Des rapports antérieurs ont montré que oligodendrogenèse corticale commence autour de 10 ans chez l'homme semaines de gestation 24 avec la capacité de l'homme oligodendrocytes fœtales à augmenter proportionnellement myéliniser avec l'âge gestationnel 22. Différenciation des galactocérébroside + et + O4 cellules précurseurs d'oligodendrocytes à partir de cellules progénitrices neurales ont été signalés à l'aide du cerveau du fœtus deuxième trimestre 21,27. Cependant, ces cellules ne prolifèrent en l'absence de cellules de soutien, y compris les astrocytes et les neurones, et se perdent rapidement au fil du temps dans la culture 21. Notre système prend en charge la formation de GalC + et + MBP cellules de la culture du fœtus humain à partir de 8 ans semaines de gestation. En outre, nous avons décrit que la différeoligodendrocytes ntiated pourraient être cultivées in vitro sans avoir besoin de cellules de soutien que les astrocytes ou les neurones, bien que la co-culture avec des neurones pourrait prolonger la survie des oligodendrocytes différenciés. Un autre avantage de ce protocole est la possibilité de cultiver un grand nombre de cellules exprimant le marqueur O4 + qui peut être cultivée et passage en culture pendant des semaines tout en conservant leur phénotype. A ce moment, les cellules O4 + peut être poussée plus loin dans la dernière étape de différenciation lorsque les facteurs de croissance sont éliminées du milieu. Le protocole décrit dans le présent document traite de la nécessité d'oligodendrocytes lignées adaptées à une expérimentation in vitro. De plus, nous croyons que l'identification des facteurs spécifiques qui induisent la cascade de la différenciation des progéniteurs neuronaux vers ancêtre dérivé oligodendrocytes est important pour la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires de développementtransitions. Il peut aussi servir comme un outil important pour l'étude des troubles de démyélinisation et des interactions virus-hôte cellulaire liés à la pathogenèse de l'homme des virus neurotropes comme JCV.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le Programme de recherche intra-muros au National Institutes of Health, NINDS. Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du Laboratoire de médecine moléculaire et de neurosciences, Rick Dreyfuss pour aider à la microscopie et Pamela C. Tamiser pour son aide à l'édition.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DME/HAMS F12 1:1 | Omega Scientist | DM-251 | 1X | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine Albumin | Sigma | A9418 | 1% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Gentamicin | Quality Biologicals | 120-098-031 | 50 μg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-Glutamine | Quality Biologicals | 118-084-061 | 2 mM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| T3 | Sigma | T2877 | 3 nM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| N2 Components | Gibco BRL | 17502 | 1:100 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Shh | R&D System | 1314-SH/CF | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| bFGF | PeproTech Inc | 100-18B | 20 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 10 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDL | Sigma | P6407 | 50 μg/m | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | 2% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin | Quality Biologicals | 118-087-721 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Papain | Worthington | LK003178 | 20 U/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DNase vials | Worthington | LK003172 | 0.005% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EBSS | Worthington | LK003188 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ProLong Gold with DAPI |
Invitrogen | P36931 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. Reagents. |
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Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phyc–rythrin; PETR, phyc–rythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken. |
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References
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