Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Progenitor-härledda oligodendrocyt Kultur System från human fetal hjärna

Published: December 20, 2012 doi: 10.3791/4274
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Neurophysiology, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

Summary

Primär, mänskliga fostrets hjärna-derived, multipotentiella progenitorceller förökar

Abstract

Differentiering av humana neurala stamceller i neuronala och glia celltyper erbjuder en modell för att studera och jämföra molekylära regleringen av neurala celler härstamning utveckling. In vitro expansion av neurala stamceller från foster CNS-vävnad har väl karakteriserade. Trots identifiering och isolering av gliala progenitorceller från vuxen människa subkortikal vita substansen och utveckling av olika odlingsbetingelser för direkt differentiering av fetala neurala stamceller till myelin producerar oligodendrocyter, förvärva tillräckliga personalresurser oligodendrocyter för in vitro experiment är fortfarande svårt. Differentiering av galaktocerebrosid + (GalC) och O4 + har oligodendrocyt föregångare eller stamfaderceller (OPC) från neurala prekursorceller rapporterats med andra trimestern fostrets hjärna. Emellertid dessa celler prolifererar inte i frånvaro av stödceller innefattande astrocyter och neuroner, och försvinner snabbt över tiden i odling. Behovet kvarstår för en kultur för att producera celler av oligodendrocyt härstamning lämplig för in vitro-experiment.

Odling av primära humana oligodendrocyter kan, exempelvis, vara en användbar modell för att studera patogenesen för neurotropa smittämnen såsom humana polyomavirus, JCV, att in vivo infekterar dessa celler. Dessa odlade celler kan också ge modeller för andra demyeliniserande sjukdomar i det centrala nervsystemet (CNS). Primär human fetal hjärna-derived, multipotentiella neurala stamceller förökar in vitro samtidigt som förmågan att differentiera till neuron (stamfader-härledda neuroner, PDN) och astrocyter (stamfader härledda astrocyter, PDA) Denna studie visar att neurala stamceller kan induceras att differentiera genom många av de olika stadierna i oligodendrocytic härstamning utveckling (stamfader-härledda oligodendrocyter, SUB). Vi kultur neurala progenitorceller i DMEM-F12 serumfritt medium supkompletterat med basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF), blodplättshärledd tillväxtfaktor (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), neurotrofisk faktor 3 (NT-3), N-2 och trijodtyronin (T3). De odlade cellerna passeras vid 2.5e6 celler per 75cm kolvar ungefär var sjunde dag. Med användning av dessa betingelser, majoriteten av cellerna i odling bibehålla en morfologi kännetecknas av få processer och uttrycka markörer för pre-oligodendrocytceller, såsom A2B5 och O-4. När vi tar bort de fyra tillväxtfaktorer (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) och lägg konditionerade media från PDN, cellerna börjar få fler processer och uttrycka markörer specifika för oligodendrocyt differentiering, såsom GalC och myelin basiskt protein (MBP). Vi utförde fenotypisk karaktärisering med multicolor flödescytometri för att identifiera unika markörer för oligodendrocyt.

Protocol

Anmärkning: För rutinmässig odling av neurala stamceller och oligodendrocytic celler härstamning, är inkubering sker vid 37 ° C i en fuktad 5% CO 2 atmosfär. Varje 2 dagar, ersätts mediet med användning av 50 till 100% av färskt medium om kultur är 40-70% sammanflytande. Vid tidpunkten för nära konfluens är kulturerna passeras vid 2-2.5e6/T75 kolv oftast på ett veckoschema.

1. Förbereda Coated Flask

  1. För att framställa belagda kolvar späd 5 mg poly-D-lysin (PDL) i 100 ml avjoniserat vatten (DI-vatten), därefter belägga T75-kolvar med 50 pg / ml av PDL vid rumstemperatur (RT) i mörker. Efter 1 ½ timme, aspirera PDL och skölj kolvarna gång med DI-vatten. Låt kolvarna torrt innan ympning av cellerna (tabell 1).

2. Starta Differentiering av neurala stamceller till progenitorceller som härrör oligodendrocyter (SUB)

Protokollet till ärolat mänskliga CNS progenitorceller beskrivs i en tidigare publikation och det är inte en del av detta protokoll 1. Humana CNS progenitorceller isolerades från telencefalon av en 8-veckors graviditet fetal hjärna, som erhållits i enlighet med NIH riktlinjer.

  1. Grow multipotentiella population av neurala progenitorceller i PDL belagda kolvar i Neurobasal-medium kompletterat med 25 ng / ml bFGF och 20 ng / ml epidermal tillväxtfaktor (EGF) (figur 1A). Använd dem inte om mer än passagen 11 (P11).
  2. Börja att differentiera de neurala stamceller när kulturen är cirka 70% sammanflytande.
  3. Göra fullständig differentiering oligodendrocyt mediet med serumfritt DMEM / Hams F12 01:01 medium kompletterat med bovint serumalbumin, L-glutamin, gentamicin, N2-komponenter, T3, Shh, NT-3, bFGF, och PDGF-AA (Tabell 1) . Detta medium kommer att definieras som oligo medium med tillväxtfaktorer (oligo medium + GF).
  4. Ta progenMonitor media från kolvarna, skölj celler en gång med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), tillsätt sedan oligo medium + GF (detaljer beskrivna i 2,3) för att starta oligodendrocyt differentiering. Endast celler engagerade i oligodendrocytic härstamning kommer att växa (Figur 1B). Odla cellerna i detta medium under 3 veckor.
  5. Varje vecka, när cellerna är vid 90-95% konfluens, passagen dem med trypsin (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml för en T75 kolv). Överför hela mediet från de celler som skall passera in i en 50 ml koniskt rör, detta konditionerat medium kommer att användas för att släcka trypsinet. Se till att inte torka ut cellerna. Tillsätt sedan trypsin.
  6. Inkubera cellerna i trypsin under 5 minuter vid RT, knacka försiktigt på kolven flera gånger för att hjälpa cell lossnar.
  7. Släcka trypsinet genom tillsats 4-5 ml av konditionerat medium till kolven med de lösgjorda cellerna.
  8. Överför mediet och cellerna till samma 50 ml koniska rör. Centrifugera mediet och cellerna vid 1.200 rpm (~300 xg) under 5 min vid RT.
  9. Aspirera supernatanten, resuspendera cellpelleten försiktigt tippa röret och sedan lägga nytt oligo medium + GF. Försiktigt pipett medium och cellerna upp och ned för att göra en enhetlig cellsuspension.
  10. Räkna cellerna och 2.5e6 överföring till varje ny PDL-belagd T75 kolv.

3. Sista steget i differentiering av oligodendrocyter

  1. Efter 3 veckors odling i oligo medium + GF, när cellerna är på 70-80% sammanflödet, starta den slutliga processen av differentiering (Figur 1C).
  2. Förbered mediet på samma sätt som oligo-medium + GF men utan tillsats av fyra GF: Shh, NT-3, bFGF och PDGF-AA. Detta medium utan fyra GF kommer att definieras som oligo medium - GF.
  3. Sug oligo medium + GF från kolven, skölj en gång med PBS och sedan lägga en total volym på 16 ml medium, varav ¾ (12 ml) är oligo Medium - GF och ¼ (4 ml) är PDN konditionerat medium för 6-10 Dagar). Användningen av konditionerat medium från PDN är inte kritisk för differentiering processen eller till överlevnad av cellerna. Vi faktiskt observerat att endast direkt kontakt SUB med PDN celler i samodling experiment påverkat längden på SUB överlevnad. Överlevnadstiden i oligo medium - GF kan förlängas till två eller tre veckor om SUB cellerna samodlas med PDN celler. Protokollet att skilja mänskliga neurala stamceller till PDN beskrivs i en tidigare publikation och det är inte en del av detta protokoll 1. Tillväxtfaktor tillbakadragande från resultaten odlingsmedium i progressivt differentierade kultur av celler med flera processer (Figur 1D).

4. Flödescytometri analys

Det flödescytometri analys jämför förvärvet av oligodendrocytceller markörer under differentiering processen förbindelser med dem i deras föräldrars befolkning.

  1. Använd neurala progenitors som kontroll. Seed SUB celler vid 2.5x10 6 celler i två T75-kolvar belagda med poly-D-lysin i oligo-medium + GF.
  2. En vecka senare, byt medium med färskt oligo medium + GF i flaskor som en kontroll kultur för cellviabilitet, medan andra kolvar hade oligo Medium - GF.
  3. Att dissociera SUB celler i båda medierna används 20 U / ml papain och inte trypsin. Detta beror på att papain har en mildare effekt på cellerna under dissociationen bevara den cellulära morfologin.
  4. Tillsätt 5 ml Earles balanserade saltlösning (EBSS) till en flaska papain. Placera flaskan vid 37 ° C under 10 minuter eller tills papain fullständigt upplöses och lösningen förefaller klar. Detta är papain lösning som används för att dissociera cellerna.
  5. Tillsätt 0,5 ml EBSS till en deoxiribonukleas I (DNas) injektionsflaska (tabell 1). Blanda försiktigt. Lägg 0,25 ml av denna lösning till flaskan med upplöst papain. Denna beredning innehåller en slutlig koncentration av ca 20 U / ml papain och 00,005% DNas.
  6. Placera papain-lösning (såsom beskrivits ovan) på cellerna och inkuberas vid 37 ° C under 15-30 min, övervaka avskiljandet av celler med användning av mikroskop. Stoppa reaktionen med 5 ml medium med eller utan GF och centrifugera vid 1.200 rpm under 7 minuter.
  7. Överför cellpelletar från båda flaskorna i två olika 5 ml polypropylenrör och tvätta dem med normal fysiologisk medium (NPM: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaClz 2, 10 mM Hepes och 10 mM glukos) kompletterat med 1 mg / ml bovint serumalbumin (NPM + BSA).
  8. Utför yta immunfärgning vid 4 ° C under 20 min med användning av specifika och lämpligt titreras primära antikroppar för A2B5, O4, GalC (tabell 2).
  9. Tvätta cellerna med NPM + BSA vid 4 ° C under 5 min och inkubera dem med specifika sekundära antikroppar vid 4 ° C under 20 minuter (Tabell 2).
  10. Att färga intracellulära antigener inklusive nestin, gliafibrillärt surt protein (GFAP), klass III & varaTA,-tubulin och myelinbasprotein (MBP) (tabell 2), fixera cellerna i 2% paraformaldehyd (PFA) under 20 minuter vid RT och permeabilisering med kall 70% etanol under 15 min vid -20 ° C.
  11. Tvätta cellerna med 1 x PBS och inkubera med specifika sekundära antikroppar (Tabell 2).
  12. Att diskriminera mellan intakta celler och subcellulära skräp under flödescytometrianalys, fläcka cellerna med 4,6-diamidino-2-phenyllindole, dihydroklorid (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY).
  13. Vid optimering av ovanstående protokoll utförde vi alla lämpliga kontroller experiment för att bekräfta specificiteten för varje immunoreagens. Kortfattat, för direkt märkta antikroppar, var den lämpliga negativa kontrollen en direkt konjugerad antikropp av samma isotyp immunoglobulin klass (eller underklass) och fluorokrom konjugat som primär antikropp (dvs isotypkontroll). För indirekt immunfärgning av primära antikroppar, lämplig negativ kontroll wsom sekundär antikropp konjugerad till fluorokromen av intresse som specifikt riktade immunoglobulin klass (eller underklass) av värden, i vilken den primära antikroppen genererades. När primära antikroppar från flera värdar (mus, kanin, kyckling) användes tillsammans, vi använde den sekundära antikroppen riktar den primära antikroppen för varje värd och används varje sekundär antikropp vanligtvis cross-adsorberat mot immunglobuliner från andra värdar att minimera gränsöverskridande värd immunoreaktivitet. De positiva kontrollerna inkluderas direkt eller indirekt immunofärgning av cellpreparat kända för att uttrycka antigenerna av intresse med användning av antingen direkta eller indirekta immunoreaktioner med de primära antikropparna specifika för dessa antigener. Ovanstående optimeringsmetoder utfördes en gång för varje typ av immunfärgning experiment. Kontroll immunreaktioner visade ingen signifikant över epitop immunreaktivitet bland primära och sekundära antikroppar. Flödescytometri utfördes på likformigtsuspenderade fluorescensmärkta celler med en FACVantage SE cellsorterare (BD Biosciences, San Jose, CA) utrustad med tre lasrar som ger exciteringsvåglängder inställda till 488 nm, 647 nm, och en bred UV (351-364 nm) (Figur 2) .

5. Immunofluorescensanalys

Obs: För immunofluorescens experiment är SUB klädd i oligo medium + GF eller oligo Medium - GF vid 2.5e5 i 6-brunnars plattor belagda med PDL. Cellerna fixerades i 2% PFA vid olika tidpunkter efter tillbakadragande av tillväxtfaktorer. Antikroppen fläcken utförs på plast 6 brunnar istället för täckglas glas.

  1. Ta medier och tillsätt 2% PFA. Inkubera under 10 minuter vid RT. Släng PFA. Tvätta cellerna 3 gånger med PBS, 5 minuter varje gång. Var noga med att inte torka ut cellerna.
  2. Permeabilisering celler för intracellulära markörer använder 0,25% triton-lösning i PBS under 10 min vid RT.
  3. För att förhindra icke-specifik bindning, blockera celler feller 10 min med HHG (1 mM HEPES-buffert, 2% hästserum och 10% getserum i Hanks balanserade saltlösning). Späd specifika primära antikroppar (tabell 2) till en förutbestämd koncentration i HHG. Placera utspädda antikroppar på celler. Inkubera 1 timme vid rumstemperatur på skakapparat eller vid 4 ° C över natten.
  4. Tvätta cellerna 3 gånger med PBS, under 5 min varje gång. Späd lämpliga sekundära antikroppar (Tabell 2) i kombination med en fluorokrom till en förutbestämd koncentration i HHG. Placera blandningen av utspädda sekundära antikroppar mot celler. Inkubera 1 h vid RT på en skakare i mörker.
  5. Tvätta cellerna 3 gånger med PBS, under 5 min varje gång.
  6. För att undvika att fotoblekning lägga 10 pl Förläng guld med DAPI till cellerna och placera ett täckglas ovanpå dem. Visualisera märkta celler med användning av en Axiovert 200M fluorescensmikroskop (Zeiss, Thornwood, NY) (Figur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det är mycket viktigt att starta differentiering processen från en 70% -80% konfluenta neurala progenitorceller kultur (figur 1A). Många celler kommer att dö ut efter byte av odlingsmedium från stamfader till oligo-medium eftersom det innehåller specifika tillväxtfaktorer. Detta tyder på att tillväxten av neurala stamceller inte engagerade i en oligodendrocytic fenotyp inte kommer att stödjas av det nya mediet (Figur 1B). Inkubation i oligo-medium + GF under en vecka resulterade i en mellanliggande kultur uppvisar en smal, bipolär morfologi (Figur 1B). Cellerna hålls i oligo-medium + GF under 3-4 veckor (Figur 1C). Tillväxtfaktor tillbakadragande från odlingsmediet resulterade i gradvis differentierade odling av celler med flera processer (figur 1D). Flödescytometri används för kvantitativ representation av data.

Figurerna 2A, 2B och 2C visar att majoriteten av neurala progenitorceller uttryckte neuroepiteliala stam nestin cellmarkör, medan endast små subpopulationer uttryckte linjenegativa restriktiva markörer såsom astrocyt markören GFAP (Figur 2A), den neuronala markören klass III β-tubulin (fig 2B) , eller den oligodendrocyt markören O4 (figur 2C). När odlingsmedium ersattes med oligo-medium + GF och celler odlades under 1 vecka, minskade nestin uttryck och ökade A2B5 uttryckning kan observeras (Figur 2D). A2B5 är en prekursor neuroglial markör. I jämförelse, 2 veckor efter medelhög byte, var nestin uttryckning minskade ytterligare och A2B5 uttryck enbart ökade (figur 2E) liksom expressionen av en annan markör oligodendrocyt, O4 (figur 2F). Två dagar efter tillväxtfaktor tillbakadragande, ökade O4 uttryck samt ett uttryck för GalC, ensen oligodendrocyt markör (Figur 2G). Sex dagar efter tillväxtfaktor tillbakadragande ökade samexpression av O4 och GalC (Figur 2H) och är jämförbar med samexpression av GalC och MBP (figur 2i). Multi-epitop immunfärgning avslöjar att mer än hälften av cellerna i odling uttrycker MBP (Figur 2J). Ytterligare bevis på SUB differentiering karaktäriserades med användning av en immunofluorescensanalys, av den tidsmässiga ökningen av MBP-expression i dessa celler efter tillväxtfaktor tillbakadragande (Figur 3A-C). Sammanfattningsvis, humana fetala neurala progenitorceller kan proliferera in vitro under bibehållande av förmågan att differentiera till 3 huvudtyper hjärnceller (Figur 4).

Figur 1
Figur 1. Faskontrastmikroskopi of (a) neurala progenitorceller odlade i stamceller mediet, (B) neurala progenitorceller odlade i oligo-medium + GF för en vecka uppvisar en förändrad smal, bipolär morfologi, (C) differentierade stamceller härledda oligodendrocyter odlas för 3 dagar i oligo-medium Efter tillväxtfaktor tillbakadragande uppvisar oligodendrocyt morfologi kännetecknas av flera processer. 20x förstoring.

Figur 2
Figur 2 Flödescytometrianalys av neurala progenitorceller samuttrycker prekursorn-cellmarkör nestin (alla vertikala axlar) med:. (A) astrocytisk markör GFAP, (B) den neuronala markören β III tubulin, och (C) den oligodendrocytic markör O4, (d) neurala stamceller som odlas för en vecka i oligo medier + GF samuttrycker Nestin och A2B5, (E) nestin och A2B5 samexpression efter två veckors neurala stamceller tillväxt i oligo medium + GF (F) A2B5 och O4 samexpression efter två veckors neurala stamceller tillväxt i oligo medium + GF, (G) två dagar efter tillväxtfaktor tillbakadragande är distinkta oligodendrocytceller markörer för differentiering, O4 och GalC, uttryckt. Sex dagar efter tillväxtfaktor tillbakadragande (H) en ökad andel celler är dubbel positiv för O4 och GalC, (I) dubbel positiv för GalC och MPB och (J) dubbel positiv för O4 och MBP. AJ är representativa för fyra oberoende experiment. Klicka här för att se större bild .

Figur 3
Figur 3. Indirekt immunofluorescence färgning av stamceller härledda oligodendrocyter för MBP (A) 2 dagar, (B) 5 dagar, och (c, d) 9 dagar efter tillväxtfaktor tillbakadragande. (D) representerar fas bilden av 9 dagars kultur i oligo medium - GF och (E) är en utvidgning av den vita rutan av samma bild (A, B) 20x förstoring, (C, D) 32x förstoring..

Figur 4
Figur 4. Schematisk framställning av vår cellkultur modell. Primär, human fetal hjärna-härledd, multipotentiella neurala progenitorceller prolifererar in vitro samtidigt som deras plasticitet. Använda olika odlingsbetingelser, kan neurala progenitorceller differentierar till neuroner (PDN), astrocyter (PDA) och oligodendrocytceller (SUB), såsom visas av specifik differentiation markörer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll beskriver hur man härleda foster oligodendrocyter från primära humana neurala stamceller och karakterisera deras fenotyp med både flödescytometri och immunofluorescensfärgning. Expansion och tillväxt av neurala stamceller från foster CNS har mycket väl beskriven 1-4. Men få tillräckliga personalresurser oligodendrocyter för in vitro experiment fortfarande svårt, även om det är möjligt att identifiera och isolera gliaceller prekursorer från vuxen människa vita substansen 5-13. Det har funnits olika försök i utvecklingen av olika odlingsbetingelser för direkt differentiering av fetala neurala stamceller till myelin producerar oligodendrocyter 14-21. Detta protokoll beskriver vidare nestin positiva neurala progenitorceller uttrycker O4 markör (figur 2) när de odlas i 3 veckor i ett serumfritt medium kompletterat med utvalda tillväxtfaktorer (PDGF-AA, bFGF, Shh, och NT-3), thatt är väsentliga för spridning och överlevnad oligodendrocytceller prekursorer 22-24. Avlägsnande av dessa tillväxtfaktorer i O4 +-celler resulterade i ytterligare differentiering och uttryckning av myelin-komponenter (galaktocerebrosid och MB). Dessutom sammanfaller uttrycket av oligodendrocytceller differentieringsmarkörer med morfologiska förändringar från celler som först verkade smal och bipolär (figur 1B) till celler som blir multipolär med väl utvecklade processer (figur 1C). Avskaffandet av tillväxtfaktorer för att ytterligare ge de slutliga stegen för differentiering bygger på studier gjorda i både mus och människa 15,25. Närvaron av trijodtyronin (T3) är viktigt för överlevnad och differentiering av oligodendrocyter 26 medan vi observerat att avlägsnandet av de fyra tillväxtfaktorer var nödvändig för expression av slutliga markörer för differentiering. Detta jämfördes med celler hålls i oligo-medium + GF ensa kontroll.

Vi är inte de första att beskriva differentiering av multipotenta neurala stamceller på oligodendrocytceller som svar på signaler, såsom Shh och bFGF 24. Tidigare rapporter har visat att kortikala oligodendrogenesis börjar ca 10 veckor gestationsålder hos människor 24 med kapacitet av humana fetala oligodendrocyter att myelinate ökar proportionellt med gestationsålder 22. Differentiering av galaktocerebrosid + och O4 + oligodendrocytceller prekursorceller från neurala stamceller har rapporterats med andra trimestern fostrets hjärna 21,27. Emellertid dessa celler prolifererar inte i frånvaro av stödceller innefattande astrocyter och neuroner, och försvinner snabbt över tiden i odling 21. Vårt system stöder bildandet av GalC + och MBP + celler från human fetal kultur från 8 veckors gestationsålder. Dessutom beskrev vi att differentiated oligodendrocyter kan odlas in vitro utan behov av stödjande celler som astrocyter eller neuroner, fastän samodling med neuroner kan förlänga överlevnaden av de differentierade oligodendrocyter. Ytterligare en fördel med detta protokoll är möjligheten att odla ett stort antal celler som uttrycker O4 + markör som kan odlas och passerades i kultur i veckor med bibehållen fenotyp. I detta ögonblick dessa O4 + celler kan skjutas vidare i det slutliga steget av differentiering när tillväxtfaktorer avlägsnas från mediet. Det protokoll som beskrivs i detta dokument tar upp behovet av oligodendrocytceller linjer lämpliga för in vitro-experiment. Dessutom tror vi att identifieringen av specifika faktorer som inducerar differentiering kaskad av neurala stamceller till stamfar-derived oligodendrocyt är viktigt för att förstå de cellulära och molekylära mekanismer för utvecklandeövergångar. Det kan också fungera som ett viktigt verktyg för att studera demyeliniserande störningar och virus-värd interaktioner cell avser patogenes av mänskliga neurotropa virus såsom JCV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Denna forskning stöds av Interna forskningsprogram vid National Institutes of Health, NINDS. Författarna vill tacka alla medlemmar i laboratoriet för molekylär medicin och neurovetenskap, Rick Dreyfuss för att hjälpa till med mikroskopi och Pamela C. Siktning för att hjälpa till med redigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DME/HAMS F12 1:1 Omega Scientist DM-251 1X
Bovine Albumin Sigma A9418 1%
Gentamicin Quality Biologicals 120-098-031 50 μg/ml
L-Glutamine Quality Biologicals 118-084-061 2 mM
T3 Sigma T2877 3 nM
N2 Components Gibco BRL 17502 1:100
NT-3 PeproTech Inc 450-03 2 ng/ml
Shh R&D System 1314-SH/CF 2 ng/ml
bFGF PeproTech Inc 100-18B 20 ng/ml
PDGF-AA PeproTech Inc 100-13A 10 ng/ml
PDL Sigma P6407 50 μg/m
PFA Electron Microscopy Sciences 15712 2%
Trypsin Quality Biologicals 118-087-721
Papain Worthington LK003178 20 U/ml
DNase vials Worthington LK003172 0.005%
EBSS Worthington LK003188
ProLong Gold
with DAPI		 Invitrogen P36931

Table 1. Reagents.
Primary Abs(all at 1 μg/ml) Species Isotype Source Secondary Abs
Flow Cytometry
A2B5-Biotin Mouse IgM Gift J. Nielson Streptavidin PETR, Invitrogen, CA
O4FITC Mouse IgM Gift from J. Nielson
A2B5 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
O4 Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-FITC, Invitrogen, CA
GalC Mouse IgG3 Millipore, MA gαm IgG3-PE, Southern Biotech, AL
MBP Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-AMCA, Jackson Immu., PA
Nestin Mouse IgG1 Messam et al. 200028 gαm IgG1-PECy5, Invitrogen, CA
GFAP Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-PE, Jackson Immu, PA
βIII tubulin Mouse IgG2 Covance, CA gαm IgG2a-PETR, Invitrogen, CA
Immunocytochemistry
βIII tubulin
(1:1,500) 		Mouse IgG2a Covance, CA gαm IgG2a-FITC, Invitrogen, CA
(1:1,000)
GFAP
(1:1,000) 		Rabbit IgG Millipore, MA gαrb IgG-FITC, Jackson Immu, PA
(1:500)
MBP
(1:50)		 Chicken IgY Millipore, MA dαck IgY-FITC, Jackson Immu, PA
(1:100)
O4
(1:100) 		Mouse IgM Millipore, MA gαm IgM-AF546, Invitrogen, CA
(1:100)
GalC
(1:10) 		Rabbit IgG Millipore, MA gαm IgM-AF750, Invitrogen, CA
(1:100)

Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phyc–rythrin; PETR, phyc–rythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility. Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).
  2. Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
  3. Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
  4. McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276, 66-71 (1997).
  5. Belachew, S., et al. Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons. J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).
  6. Almazan, G., McKay, R. An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve. Brain Res. 579, 234-245 (1992).
  7. Filipovic, R., Zecevic, N. Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia. Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).
  8. Goldman, S. A., Natesan, S. A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus. Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).
  9. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nat. Med. 9, 439-447 (2003).
  10. Lyssiotis, C. A., et al. Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).
  11. Sim, F. J., Goldman, S. A. White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche. Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).
  12. Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium. Nature. 303, 390-396 (1983).
  13. Windrem, M. S., et al. Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain. J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).
  14. Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
  15. Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
  16. Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136, 1443-1452 (2009).
  17. Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).
  18. Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).
  19. Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
  20. Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).
  21. Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. Tracing human oligodendroglial development in vitro. J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).
  22. Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).
  23. Chong, S. Y., Chan, J. R. Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted. J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).
  24. Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front Neuroanat. 3, 5 (2009).
  25. Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures. Stem Cells. 27, 116-125 (2009).
  26. D'Intino, G., et al. Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism. J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).
  27. Cui, Q. L., et al. Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate. Stem Cells Dev. , (2012).
  28. Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody. Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).

Tags

Neurovetenskap utvecklingsbiologi medicin Stem Cell Biology molekylärbiologi cellbiologi fysiologi härstamning karakterisering neurala stamceller differentiering cellodling modell
Progenitor-härledda oligodendrocyt Kultur System från human fetal hjärna
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Monaco, M. C. G., Maric, D.,… More

Monaco, M. C. G., Maric, D., Bandeian, A., Leibovitch, E., Yang, W., Major, E. O. Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain. J. Vis. Exp. (70), e4274, doi:10.3791/4274 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter