Summary
Primaria, umani fetali di derivazione cerebrale, le cellule progenitrici multipotenti proliferano
Abstract
La differenziazione dei progenitori neurali umane in tipi di cellule neuronali e gliali offre un modello da studiare e confrontare regolazione molecolare dello sviluppo neurale linea cellulare. Espansione in vitro di progenitori neurali da tessuto fetale CNS è stato ben caratterizzato. Nonostante l'identificazione e l'isolamento di progenitori gliali da umano adulto sub-corticale della sostanza bianca e lo sviluppo delle diverse condizioni di coltura per la differenziazione diretta di progenitori neurali fetali in oligodendrociti che producono mielina, l'acquisizione di sufficienti oligodendrociti umani per la sperimentazione in vitro rimane difficile. Differenziazione dei galactocerebroside + (GALC) e O4 + precursori degli oligodendrociti o cellule progenitrici (OPC) da cellule precursori neurali è stato segnalato con secondo cervello fetale trimestre. Tuttavia, queste cellule non proliferano in assenza di cellule di supporto tra astrociti e neuroni, e si perdono rapidamente nel tempo in cultura. Rimane la necessità di un sistema di coltura per produrre cellule della linea oligodendrocyte adatto per la sperimentazione in vitro.
Cultura di oligodendrociti primari umani potrebbe, per esempio, essere un modello utile per studiare la patogenesi di neurotropici agenti infettivi come il poliomavirus umano, JCV, che in vivo infetta le cellule. Queste cellule coltivate potrebbe anche fornire modelli di altre malattie demielinizzanti del sistema nervoso centrale (CNS). Primaria, fetale umano derivato dal cervello, le cellule progenitrici multipotenti neurali proliferano in vitro, pur mantenendo la capacità di differenziarsi in neuroni (cellule progenitrici derivate da neuroni, PDN) e astrociti (cellule progenitrici derivate da astrociti, PDA) Questo studio mostra che progenitori neurali può essere indotta a differenziare attraverso molte delle fasi di sviluppo lignaggio oligodendrocitario (progenitrici derivate oligodendrociti, DOP). Noi cellule progenitrici neurali in coltura DMEM-F12 senza siero dei media suptegrato con fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF), il fattore di crescita derivato piastrine (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), fattore neurotrofico 3 (NT-3), N-2 e triiodotironina (T3). Le cellule coltivate sono diversi passaggi in cellule 2.5e6 per fiaschi 75 centimetri circa ogni sette giorni. Utilizzando tali condizioni, la maggior parte delle cellule in coltura mantenere una morfologia caratterizzata da alcuni processi e marcatori espresse del pre-cellule oligodendrociti, come A2B5 e O-4. Quando rimuoviamo i quattro fattori di crescita (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) e aggiungere mezzo condizionato da PDN, le cellule iniziano ad acquisire più processi e indicatori esprimono specifici di differenziazione degli oligodendrociti, come GALC e la mielina proteina basica (MBP). Abbiamo eseguito la caratterizzazione fenotipica in citometria a flusso multicolore di identificare indicatori unici di oligodendrociti.
Protocol
Nota: per la coltura di routine di progenitrici neurali e cellule della linea oligodendrocitario, incubazione avviene a 37 ° C in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera. Ogni 2 giorni, il mezzo viene sostituito con 50 a 100% di mezzo fresco se la cultura è 40-70% confluenti. Al momento della confluenza vicino, le colture sono diversi passaggi a 2-2.5e6/T75 pallone di solito su una pianificazione settimanale.
1. Preparazione del Flask Coated
- Per preparare fiasche rivestite diluire 5 mg di poli-D-lisina (PDL) in 100 ml di acqua deionizzata (DI-acqua), poi cappotto fiasche T75 con 50 ug / ml di PDL a temperatura ambiente (RT) al buio. Dopo 1 ½ ora, aspirare il Pdl e risciacquare i palloni una volta con acqua demineralizzata. Lasciate le fiasche secco prima della semina delle cellule (Tabella 1).
2. Avvio di differenziazione delle cellule progenitrici neurali in oligodendrociti progenitrici derivate (DOP)
Il protocollo èOlate cellule progenitrici del SNC è descritto in una precedente pubblicazione e non è parte di questo protocollo 1. Le cellule progenitrici del sistema nervoso centrale sono stati isolati dal telencefalo di un 8 settimane di gestazione il cervello del feto, ottenuto in accordo con le linee guida NIH.
- Crescere multipotenziale popolazione di cellule progenitrici neurali sul PDL fiasche rivestite in media Neurobasal supplementato con 25 ng / ml di bFGF e 20 ng / ml di fattore di crescita epidermico (EGF) (Figura 1A). Non usarli se maggiore di passaggio 11 (p11).
- Iniziare a differenziare le cellule progenitrici neurali, quando la cultura è di circa il 70% confluenti.
- Rendere terreno completo differenziazione oligodendrociti utilizzando DMEM privo di siero / PROSCIUTTI F12 medie 01:01 supplementato con albumina di siero bovino, L-glutammina, gentamicina, componenti N2, T3, Shh, NT-3, bFGF e PDGF-AA (Tabella 1) . Questo terreno sarà definita come supporto oligo con fattori di crescita (oligo media + GF).
- Rimuovere Progensupporto Itor dai fiaschi, lavare le cellule una volta con tampone fosfato salino (PBS), quindi aggiungere mezzo di oligo + GF (dettagli descritti al punto 2.3) per avviare la differenziazione degli oligodendrociti. Solo le cellule impegnate nella stirpe oligodendrocitario crescerà (Figura 1B). Cultura le cellule in questo mezzo per 3 settimane.
- Ogni settimana, quando le cellule sono a 90-95% di confluenza, passaggio usando tripsina (0,05%)-EDTA (0,1%) (4 ml per una beuta T75). Trasferire il mezzo intero dalle cellule da diversi passaggi in una provetta da 50 ml; questo mezzo condizionato viene utilizzata per estinguere la tripsina. Assicurarsi di non asciugare le cellule. Quindi aggiungere tripsina.
- Incubare le cellule in tripsina per 5 min a RT, delicatamente la beuta volte per aiutare distacco cellulare.
- Quench la tripsina con l'aggiunta di 4-5 mL di terreno condizionato al pallone con le cellule distaccate.
- Trasferire il mezzo e le cellule allo stesso tubo da 50 ml. Centrifugare il mezzo e le cellule a 1.200 giri al minuto (~300 xg) per 5 min a RT.
- Aspirare il surnatante, risospendere il pellet cellulare, con delicatezza ribaltare il tubo, e quindi aggiungere fresche medie oligo + GF. Delicatamente medie pipetta e cellule su e giù per fare una sospensione uniforme cella.
- Contare le cellule, e 2.5e6 trasferimento in ogni nuovo PDL rivestita T75 pallone.
3. Fase finale nella differenziazione degli oligodendrociti
- Dopo 3 settimane di coltura in oligo media + GF, quando le cellule sono a 70-80% di confluenza, avviare il processo finale di differenziazione (Figura 1C).
- Preparare media nello stesso modo come il mezzo oligo + GF ma senza aggiungere il quattro GF: Shh, NT-3, bFGF e PDGF-AA. Questo mezzo senza il GF quattro saranno definita come supporto di oligo - GF.
- Aspirare il mezzo oligo + GF dal pallone, sciacquare una volta con PBS e quindi aggiungere un volume totale di 16 ml di terreno, di cui ¾ (12 ml) è oligo medio - GF e ¼ (4 ml) è medio PDN condizionato, per 6-10 Giorni). L'uso di mezzo condizionato da PDN non è critico per il processo di differenziazione o la sopravvivenza delle cellule. Abbiamo infatti osservato che solo il contatto diretto con le cellule di PDO PDN in esperimenti di co-coltura ha avuto un effetto sulla durata della sopravvivenza DOP. Il tempo di sopravvivenza medio di oligo - GF poteva essere prolungata per due o tre settimane se le cellule DOP sono co-coltura con cellule PDN. Il protocollo di differenziare cellule progenitrici neurali in PDN è descritto in una precedente pubblicazione e non è parte di questo protocollo 1. La crescita fattore di ritiro dai risultati medi di coltura della cultura progressivamente differenziate di cellule con processi multipli (Figura 1D).
4. Citometria a Flusso del test
Il saggio citofluorimetria confronta l'acquisizione di marcatori oligodendrociti durante il processo di differenziazione in rapporto con quelli della popolazione parentale.
- Usa pro neuralegenitors il controllo. Seme cellule DOP a 2.5x10 6 celle in due palloni T75 rivestite con poli-D-lisina in oligo medie + GF.
- Una settimana dopo, sostituire media con fresca media oligo + GF in fusti come una cultura di controllo per la vitalità delle cellule, mentre altri contenitori avuto oligo medio - GF.
- Dissociare cellule DOP in entrambi i mezzi utilizzare 20 U / ml di papaina e non tripsina. Questo perché papaina ha un effetto più delicato sulle cellule durante la dissociazione preservare la morfologia cellulare.
- Aggiungere 5 ml di soluzione salina bilanciata di Earle (EBSS) in una fiala papaina. Posizionare il flacone a 37 ° C per 10 minuti o fino a quando la papaina è completamente sciolto e la soluzione appare chiara. Questa è la soluzione di papaina utilizzata per dissociare le cellule.
- Aggiungere 0,5 ml di EBSS ad un Deoxyribonuclease I (DNasi) flaconcino (Tabella 1). Mescolare delicatamente. Aggiungere 0,25 ml di questa soluzione nel flacone di papaina disciolto. Questo preparato contiene una concentrazione finale di circa 20 U / ml di papaina e 00,005% DNasi.
- Soluzione luogo papaina (come descritto sopra) sulle cellule e incubare a 37 ° C per 15-30 min, monitorare il distacco delle cellule usando un microscopio. Interrompere la reazione con 5 ml di terreno con o senza GF e centrifugare a 1200 rpm per 7 min.
- Trasferire pellet cellulari da entrambi flaconi in due differenti 5 ml provette di polipropilene e lavarli con normale media fisiologica (NPM: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, Hepes 10 mM e 10 mM di glucosio) supplementato con 1 mg / ml albumina di siero bovino (BSA NPM +).
- Eseguire superficie immunocolorazione a 4 ° C per 20 minuti usando anticorpi primari specifici e adeguatamente titolata per A2B5, O4, GALC (Tabella 2).
- Lavare le cellule con NPM + BSA a 4 ° C per 5 minuti e incubare con specifici anticorpi secondari a 4 ° C per 20 min (Tabella 2).
- Per macchia antigeni intracellulari tra cui nestina, proteina acida fibrillare gliale (GFAP), classe III e essereta,-tubulina, e la proteina basica della mielina (MBP) (Tabella 2), fissare le cellule in 2% paraformaldeide (PFA) per 20 minuti a RT e permeabilize freddo con etanolo al 70% per 15 min a -20 ° C.
- Lavare le cellule con PBS 1x e incubare con specifici anticorpi secondari (Tabella 2).
- Per discriminare tra cellule intatte e detriti subcellulare durante l'analisi di citometria a flusso, colora le cellule con 4,6-Diamidino-2-phenyllindole, cloridrato (DAPI) (Life Technologies, Grand Island, NY).
- In ottimizzare il protocollo di cui sopra, abbiamo eseguito tutti gli esperimenti di controllo necessarie per confermare la specificità di ogni immunoreagenti. Brevemente, per gli anticorpi marcati direttamente, il controllo appropriato negativo era un anticorpo direttamente coniugato della stessa classe isotipo di immunoglobuline (o sottoclasse) e coniugato con fluorocromo come anticorpo primario (cioè il controllo di isotipo). Per immunostaining indiretto di anticorpi primari, l'appropriato controllo negativo wcome anticorpo secondario coniugato con il fluorocromo di interesse che specificamente mirato alla classe di immunoglobuline (o sottoclasse) del ospite in cui è stato generato l'anticorpo primario. Quando gli anticorpi primari da più host (topo, coniglio, pollo) sono stati utilizzati insieme, abbiamo utilizzato l'anticorpo secondario di mira l'anticorpo primario di ogni host e ogni anticorpo secondario utilizzato è stato in genere cross-adsorbito contro le immunoglobuline dagli altri host per ridurre al minimo cross- ospitare immunoreattività. I controlli positivi inclusi immunostaining diretta o indiretta di preparazioni cellulari note per esprimere gli antigeni di interesse utilizzando sia immunoreazioni diretto o indiretto con gli anticorpi primari specifici per questi antigeni. I metodi di ottimizzazione sopra sono state eseguite una volta per ogni tipo di immunocolorazione esperimenti. Immunoreazioni di controllo ha evidenziato alcuna significativa cross-epitopo immunoreattività tra gli anticorpi primari e secondari. Citometria di flusso è stata eseguita su uniformementesospesi cellule contrassegnati in modo fluorescente utilizzando una cella FACVantage SE sorter (BD Biosciences, San Jose, CA) dotato di tre laser, che forniscono lunghezze d'onda di eccitazione 488 nm sintonizzate, 647 nm, e un ampio UV (351-364 nm) (Figura 2) .
5. Test di immunofluorescenza
Nota: Per gli esperimenti di immunofluorescenza, DOP sono placcati in oligo media + GF o oligo medio - GF a 2.5e5 in piastre da 6 pozzetti rivestiti con PDL. Le cellule vengono fissate in 2% PFA in vari momenti dopo il prelievo di fattori di crescita. L'anticorpo macchia viene eseguita su piastre da 6 pozzetti di plastica anziché coprioggetto.
- Rimuovere il supporto e aggiungere il 2% PFA. Incubare per 10 minuti a RT. Eliminare PFA. Lavare le cellule per 3 volte con PBS, 5 min ciascuna volta. Fare attenzione a non asciugare le cellule.
- Permeabilize cellule per marcatori intracellulari mediante soluzione di Triton 0,25% in PBS per 10 minuti a RT.
- Per prevenire il legame non specifico, cellule blocco fo 10 min con HHG (1 mM tampone HEPES, 2% siero di cavallo, e siero di capra 10% in soluzione salina bilanciata di Hanks '). Diluire specifici anticorpi primari (Tabella 2) per una predeterminata concentrazione HHG. Posizionare anticorpi diluiti su cellule. Incubare per 1 ora a RT l'agitatore o a 4 ° C per una notte.
- Lavare le cellule per 3 volte con PBS per 5 minuti ogni volta. Diluire appropriati anticorpi secondari (Tabella 2) accoppiato con un fluorocromo ad una predeterminata concentrazione HHG. Mettere la miscela di anticorpi secondari diluiti su cellule. Incubare per 1 ora a RT su un agitatore nel buio.
- Lavare le cellule per 3 volte con PBS per 5 minuti ogni volta.
- Per evitare la fotodecolorazione aggiungere 10 ml di prolungare oro con DAPI per le cellule e mettere un coprioggetto di vetro su di essi. Visualizzare le cellule marcate usando un microscopio a fluorescenza Axiovert 200M (Zeiss, Thornwood, NY) (Figura 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
E 'molto importante per avviare il processo di differenziazione da un 70% -80% coltura confluente di cellule progenitrici neurali (Figura 1A). Molte cellule si estinguerà dopo aver cambiato il mezzo di coltura da capostipite a medio oligo poiché include fattori di crescita specifici. Questo indica che la crescita di cellule progenitrici neurali non impegnati ad un fenotipo oligodendrocitario non sarà supportato dal nuovo mezzo (Figura 1B). Incubazione in mezzo oligo + GF per una settimana comportato una cultura intermedio presentante una stretta, morfologia bipolare (Figura 1B). Le cellule vengono mantenute in oligo media + GF per 3-4 settimane (Figura 1C). Fattore di crescita ritiro dal mezzo di coltura portato progressivamente coltura di cellule differenziate con processi multipli (Figura 1D). Citometria di flusso per la rappresentazione quantitativa dei dati.
Figure 2A, 2B e 2C dimostrano che la maggioranza dei progenitori neurali espresso il neuroepiteliale cellule staminali marcatore nestina, mentre solo piccole sottopopolazioni espressa lineage-restrittive marcatori come il marcatore astrociti GFAP (Figura 2A), il marcatore neuronale classe III β-tubulina (Figura 2B) , o il marcatore oligodendrociti O4 (Figura 2C). Quando mezzo di coltura è stato sostituito con oligo media + GF e le cellule sono state coltivate per 1 settimana, ridotta espressione nestina e aumentato A2B5 espressione può essere osservato (Figura 2D). A2B5 è un marker precursore neuroglia. In confronto, due settimane dopo la sostituzione medie, nestina espressione era diminuita ulteriormente e A2B5 sola espressione aumentata (Figura 2E) nonché l'espressione di un altro marcatore oligodendrociti, O4 (Figura 2F). Due giorni dopo fattore di crescita di astinenza, O4 espressione aumentata così come l'espressione di GALC, unfine marcatore degli oligodendrociti (Figura 2G). Sei giorni dopo il ritiro fattore di crescita, la co-espressione di O4 e GALC aumentato (Figura 2H) ed è paragonabile alla co-espressione di GALC e MBP (Figura 2I). Il multi-epitopo immunostaining rivela che più della metà delle cellule in coltura esprimono MBP (Figura 2J). Ulteriori prove di differenziazione DOP è stato caratterizzato, usando un saggio di immunofluorescenza, con l'aumento di espressione temporale MBP in queste cellule dopo la sospensione del fattore di crescita (Figura 3A-C). In sintesi, cellule progenitrici neurali fetali sono in grado di proliferare in vitro, pur mantenendo la capacità di differenziarsi in tre tipi principali di cellule cerebrali (Figura 4).
Figura 1. Contrasto di fase o microscopiaf (A), le cellule progenitrici neurali coltivate in terreno progenitore, (B), le cellule progenitrici neurali cresciute in oligo media + GF per una settimana mostrano un alterato stretta, morfologia bipolare; (C) differenziati progenitrici derivate oligodendrociti coltivate per 3 giorni in media oligo dopo morfologia fattore di crescita mostra il ritiro degli oligodendrociti caratterizzata da più processi. Ingrandimento 20x.
Figura 2 citometria di flusso dell'analisi delle cellule progenitrici neurali co-esprimono il precursore cellule marcatore Nestin (tutti gli assi verticali) con:. (A) il marcatore astrociti GFAP; (B) il marcatore neuronale β tubulina III, e (C) il oligodendrocitario marcatore O4, (D), le cellule progenitrici neurali coltivate per una settimana in oligo mezzi + GF co-express Nestin e A2B5, (E) nestina e A2B5 co-espressione dopo due settimane di neurale crescita progenitori in oligo media + GF (F) A2B5 e O4 co-espressione dopo due settimane di neurale crescita progenitori in oligo media + GF, (G) due giorni dopo la sospensione del fattore di crescita, diversi marcatori di differenziazione degli oligodendrociti, O4 e GALC, sono espressi. Sei giorni dopo la sospensione del fattore di crescita (H) una porzione maggiore di cellule doppio-sono positivi per O4 e GALC, (I) doppio positivo per GALC e MPB, e (J) doppio positivo per O4 e MBP. AJ sono rappresentativi di quattro esperimenti indipendenti. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. Indiretta immunofluorcolorazione escence di progenitrici derivate oligodendrociti per MBP (A) 2 giorni, (B) 5 giorni, e (C, D) 9 giorni dopo la sospensione del fattore di crescita. (D) rappresenta l'immagine fase della cultura 9 giorni in media oligo - GF e (E) è un ingrandimento del riquadro bianco della stessa immagine (A, B) ingrandimento 20x, (C, D) ingrandimento 32x..
Figura 4. Rappresentazione schematica del nostro modello di coltura cellulare. Primaria, fetale umano derivato dal cervello, le cellule progenitrici multipotenti neurali proliferare in vitro, pur mantenendo la loro plasticità. Usando diverse condizioni di coltura, le cellule progenitrici neurali in grado di differenziare in neuroni (PDN), astrociti (PDA) e degli oligodendrociti (DOP), come dimostrato da specifici differentiatagli ioni di marcatori.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo protocollo descrive come oligodendrociti fetali derivare da cellule primarie umane progenitrici neurali e caratterizzare il loro fenotipo utilizzando sia citometria di flusso e colorazione di immunofluorescenza. L'espansione e la crescita dei progenitori neurali fetali da CNS è stata molto ben descritta 1-4. Tuttavia, ottenere sufficienti oligodendrociti umani per la sperimentazione in vitro resta difficile, anche se è possibile identificare e isolare precursori gliali da materiale umano adulto bianco 5-13. Ci sono stati diversi tentativi per lo sviluppo di diverse condizioni di coltura per la differenziazione diretta di progenitori neurali fetali nella produzione di mielina oligodendrociti 14-21. Questo protocollo descrive ulteriormente nestina positive cellule progenitrici neurali esprimono il marker O4 (Figura 2) se coltivate per 3 settimane in un terreno privo di siero supplementato con fattori di crescita PDGF-selezionati (AA, bFGF, Shh, e NT-3), tcappello sono essenziali per la sopravvivenza e la proliferazione dei precursori degli oligodendrociti 22-24. Rimozione di questi fattori di crescita nelle cellule O4 + comportato ulteriore differenziazione ed espressione di componenti della mielina (galactocerebroside e MB). Inoltre, l'espressione di marcatori di differenziazione oligodendrociti coincide con cambiamenti morfologici di cellule che in prima appariva stretta e bipolare (Figura 1B) di cellule che diventano multipolare con ben sviluppati processi (Figura 1C). La rimozione di fattori di crescita per consentire ulteriormente le fasi finali della differenziazione è basata su studi condotti sia in topo e umano 15,25. La presenza di triiodotironina (T3) è importante per la sopravvivenza e la differenziazione di oligodendrociti 26 mentre abbiamo osservato che la rimozione dei quattro fattori di crescita era necessaria per l'espressione di marcatori finali della differenziazione. Questo è stato confrontato con cellule mantenute in oligo medie + GF unasa di controllo.
Non siamo i primi a descrivere la differenziazione di cellule progenitrici multipotenti alle cellule neurali oligodendrociti in risposta a segnali quali Shh e bFGF 24. Studi precedenti hanno mostrato che oligodendrogenesis corticale inizia circa 10 settimane di età gestazionale 24 negli esseri umani con la capacità di oligodendrociti umani fetali per mielinizzare aumentare proporzionalmente con l'età gestazionale 22. Differenziazione dei galactocerebroside + e + O4 cellule precursori degli oligodendrociti a partire da cellule progenitrici neurali è stato segnalato con secondo cervello fetale trimestre 21,27. Tuttavia, queste cellule non proliferano in assenza di cellule di supporto tra astrociti e neuroni, e si perdono rapidamente nel tempo in cultura 21. Il nostro sistema supporta la formazione di GALC MBP + + e cellule di cultura umana fetale da 8 settimane di età gestazionale. Inoltre abbiamo descritto che la differeoligodendrociti ntiated potrebbero essere coltivate in vitro senza la necessità di sostenere cellule come astrociti o neuroni, sebbene la co-coltura con neuroni potrebbe allungare la sopravvivenza dei oligodendrociti differenziati. Un altro vantaggio di questo protocollo è la possibilità di coltivare un gran numero di cellule che esprimono il marcatore O4 + che possono essere coltivate e diversi passaggi in coltura per settimane pur mantenendo la loro fenotipo. In quel momento le cellule O4 + può essere ulteriormente spinto nella fase finale di differenziazione quando i fattori di crescita sono rimossi dal mezzo. Il protocollo descritto in questo documento risponde alla necessità di lignaggi oligodendrociti adatti per sperimentazione in vitro. Inoltre, riteniamo che l'identificazione di fattori specifici che inducono la cascata differenziazione dei progenitori neurali verso il progenitore di derivazione degli oligodendrociti è importante per la comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari di sviluppotransizioni. Essa può anche servire come un importante strumento per lo studio delle patologie demielinizzanti e virus-cellula ospite interazioni riguardano la patogenesi del virus che causano neurotropi come JCV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale presso il National Institutes of Health, NINDS. Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del Laboratorio di Medicina Molecolare e Neuroscienze, Rick Dreyfuss per aiutare con la microscopia e Pamela Vagliatura C. per l'aiuto con la redazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DME/HAMS F12 1:1 | Omega Scientist | DM-251 | 1X | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine Albumin | Sigma | A9418 | 1% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Gentamicin | Quality Biologicals | 120-098-031 | 50 μg/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-Glutamine | Quality Biologicals | 118-084-061 | 2 mM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| T3 | Sigma | T2877 | 3 nM | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| N2 Components | Gibco BRL | 17502 | 1:100 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Shh | R&D System | 1314-SH/CF | 2 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| bFGF | PeproTech Inc | 100-18B | 20 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDGF-AA | PeproTech Inc | 100-13A | 10 ng/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PDL | Sigma | P6407 | 50 μg/m | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15712 | 2% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Trypsin | Quality Biologicals | 118-087-721 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Papain | Worthington | LK003178 | 20 U/ml | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DNase vials | Worthington | LK003172 | 0.005% | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EBSS | Worthington | LK003188 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ProLong Gold with DAPI |
Invitrogen | P36931 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. Reagents. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 2. Antibodies (Abs) used for flow cytometry and immunocytochemistry assays. Antibody conjugates: PE, phyc–rythrin; PETR, phyc–rythrin Texas Red; AMCA, amino-methyl-coumarin-acetate; Cy, cyanine; FITC, fluorescein isothiocyanate. Ig: immunoglobulin. AF: Alexa Fluor; gαm: goat anti-mouse; gαrb: goat anti-rabbit; dαck: donkey anti-chicken. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Messam, C. A., Hou, J., Gronostajski, R. M., Major, E. O. Lineage pathway of human brain progenitor cells identified by JC virus susceptibility. Ann. Neurol. 53, 636-646 (2003).
- Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
- Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system. Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).
- McKay, R. Stem cells in the central nervous system. Science. 276, 66-71 (1997).
- Belachew, S., et al. Postnatal NG2 proteoglycan-expressing progenitor cells are intrinsically multipotent and generate functional neurons. J. Cell Biol. 161, 169-186 (2003).
- Almazan, G., McKay, R. An oligodendrocyte precursor cell line from rat optic nerve. Brain Res. 579, 234-245 (1992).
- Filipovic, R., Zecevic, N. Neuroprotective role of minocycline in co-cultures of human fetal neurons and microglia. Exp. Neurol. 211, 41-51 (2008).
- Goldman, S. A., Natesan, S. A niche-defying feat: induced oligoneogenesis in the adult dentate gyrus. Cell Stem Cell. 3, 125-126 (2008).
- Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nat. Med. 9, 439-447 (2003).
- Lyssiotis, C. A., et al. Inhibition of histone deacetylase activity induces developmental plasticity in oligodendrocyte precursor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 14982-14987 (2007).
- Sim, F. J., Goldman, S. A. White matter progenitor cells reside in an oligodendrogenic niche. Ernst Schering Res. Found Workshop. , 61-81 (2005).
- Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium. Nature. 303, 390-396 (1983).
- Windrem, M. S., et al. Progenitor cells derived from the adult human subcortical white matter disperse and differentiate as oligodendrocytes within demyelinated lesions of the rat brain. J. Neurosci. Res. 69, 966-975 (2002).
- Chen, Y., et al. Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells. Nat. Protoc. 2, 1044-1051 (2007).
- Armstrong, R. C. Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells. Methods. 16, 282-292 (1998).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136, 1443-1452 (2009).
- Gard, A. L., Williams, W. C. 2nd, Burrell, M. R. Oligodendroblasts distinguished from O-2A glial progenitors by surface phenotype (O4+GalC-) and response to cytokines using signal transducer LIFR beta. Dev. Biol. 167, 596-608 (1995).
- Hu, B. Y., Du, Z. W., Zhang, S. C. Differentiation of human oligodendrocytes from pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 4, 1614-1622 (2009).
- Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
- Pfeiffer, S. E., Warrington, A. E., Bansal, R. The oligodendrocyte and its many cellular processes. Trends Cell Biol. 3, 191-197 (1993).
- Zhang, S. C., Ge, B., Duncan, I. D. Tracing human oligodendroglial development in vitro. J. Neurosci. Res. 59, 421-429 (2000).
- Bradl, M., Lassmann, H. Oligodendrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119, 37-53 (2010).
- Chong, S. Y., Chan, J. R. Tapping into the glial reservoir: cells committed to remaining uncommitted. J. Cell Biol. 188, 305-312 (2010).
- Jakovcevski, I., Filipovic, R., Mo, Z., Rakic, S., Zecevic, N. Oligodendrocyte development and the onset of myelination in the human fetal brain. Front Neuroanat. 3, 5 (2009).
- Rao, R. C., Boyd, J., Padmanabhan, R., Chenoweth, J. G., McKay, R. D. Efficient serum-free derivation of oligodendrocyte precursors from neural stem cell-enriched cultures. Stem Cells. 27, 116-125 (2009).
- D'Intino, G., et al. Triiodothyronine administration ameliorates the demyelination/remyelination ratio in a non-human primate model of multiple sclerosis by correcting tissue hypothyroidism. J. Neuroendocrinol. 23, 778-790 (2011).
- Cui, Q. L., et al. Human fetal oligodendrocyte progenitor cells from different gestational stages exhibit substantially different potential to myelinate. Stem Cells Dev. , (2012).
- Messam, C. A., Hou, J., Major, E. O. Coexpression of nestin in neural and glial cells in the developing human CNS defined by a human-specific anti-nestin antibody. Exp. Neurol. 161, 585-596 (2000).
