Summary
معظم الدراسات من مرض القرنية الهربسي استخدام نموذج العدوى الأولية. ومع ذلك، العدوى الأولية مع HSV-1 لا يؤدي عادة إلى الأمراض التي تصيب البشر. نحن هنا وصفا لنموذج متكرر من مرض القرنية الهربسي، الذي يحاكي بشكل وثيق الأمراض التي تصيب البشر.
Abstract
العقبولية أمراض العيون، ووصف التهاب القرنية الهربسي اللحمية (HSK)، هو عدوى محتملة المسببة للعمى القرنية الذي يؤدي إلى أكثر من 300،000 زائر كل عام السريرية للعلاج. وبين 1 و 2 في المئة من هؤلاء المرضى يعانون من مرض السريرية تجربة فقدان الرؤية في القرنية المصابة. الغالبية العظمى من هذه الحالات هي نتيجة لإعادة تنشيط العدوى الكامنة لمن الهربس البسيط من النوع I فيروس وليس بسبب مرض حاد. ومن المثير للاهتمام، والعدوى الحادة هو النموذج الأكثر استخداما لدراسة هذا المرض. ومع ذلك، كان هناك شعور بأن نموذج المتكررة من HSK سيكون أكثر تعبيرا عن ما يحدث أثناء المرض السريري. وقد استخدمت نماذج حيوانية المتكررة لHSK كل الأرانب والفئران. ميزة الأرانب هو أنها تجربة تنشيط من الكمون غياب أي حافز المعروفة. وقال أنه من الصعب استكشاف الدور الذي تلعب العديد من العوامل المناعية في HSK المتكررة لنموذج الأرنب لا يملك إمانological والموارد الوراثية أن الفأر لديه. اخترنا لاستخدام نموذج الفأر لHSK المتكررة لأنه له ميزة كونه هناك العديد من الموارد المتاحة وأيضا نعرف متى سيحدث تنشيط لأن الناجمة عن التعرض لتنشيط UV-B الخفيفة. حتى الآن، وقد سمح هذا النموذج تلك المختبرات استخدامه لتحديد العوامل المناعية التي تعتبر مهمة عدة لهذا المرض. وقد سمح ذلك أيضا لنا لاختبار كل العلاجية ونجاعة اللقاح.
Protocol
ملاحظة العناية الحيوان: لا يتم استخدام المسكنات في هذا النموذج كما هي مضادة للالتهابات، وبالتالي سوف يبطل نموذج.
1. إعداد الفيروسات
- تنمو HSV-1 على خلايا فيرو (80٪ متموجة) باستخدام التخفيف بدءا من 0.01 تعدد العدوى (في T-150 قارورة، عن 5 × 10 5 وحدات لوحة تشكيل) لمدة 3-4 أيام حتى جميع الخلايا اعتقلت المتابعة ويسهل فكها عن طريق ضرب القارورة.
- إزالة وسائل الاعلام لأنابيب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في معقمة الكتب التي أسطورة RT في 4 درجات مئوية و3،500 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة. بعد إزالة طاف (انظر 1.3)، إعادة تعليق بيليه كبيرة من كل أنبوب 50 مل مع 5 مل من مجموع وسائل الإعلام. يصوتن لمدة 1 دقيقة في كل منهما 30 ثانية رشقات نارية.
- إزالة طاف ووضعها في أنابيب معقمة 50 مل أوك ريدج وأجهزة الطرد المركزي في 9000 دورة في الدقيقة، لمدة 1 ساعة في 4 درجات مئوية في بيكمان J2-21 الطرد المركزي. هذا هو إنتاج بيليه الصغيرة الفيروسية. تجاهل طاف.
- الجمع بين يصوتن من 1.2 الطرافةح بيليه ويصوتن من 1.3 مرة أخرى لمدة 45 ثانية. أجهزة الطرد المركزي في الكتب التي أسطورة RT في 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. حفظ طاف. هذا الفيروس يشكل المخزون الذي aliquoted وتخزينها في -70 درجة مئوية.
- فيروس على خلايا فيرو عيار. I وحة عادة 10 0 إلى 10 -8 التخفيف (كل يجري التخفيف يساوي 10-fold) 2X من 2 مجموعات منفصلة التخفيف. يتم تنفيذ المعايرة من الفيروسات على 12-وحات جيدة العقيمة.
2. الماوس العدوى
- حقن كل فأر بنسبة 0.1 مل من مخدر الوزن ز cocktail/20 الجسم الماوس (الكيتامين، 60 ملغ / كغ + زيلازين 5 ملغ / كغ وهو مخففة في HBSS). ويستخدم هذا المزيج لأنها هي واحدة من أسلم وسيلة لتخدير عند استخدام جرعات مناسبة وآثار هذا الدواء هي قصيرة العمر جدا.
- عندما الفئران هي تخدير خدش القرنية من العين اليمنى مع إبرة قياس 30 باستخدام مجهر تشريح للتأكد من أن القرنية ليست مثقوبة.
- كل الماوس RECEحقنة داخل الصفاق IVED من 1 مل من مصل الإنسان المجمعة (سيغما، تيميكولا، كاليفورنيا؛ المضادة للتفاعل مع HSV جرعة فعالة لتحييد الفيروس 50٪ من 1:800) من أجل حماية القرنيات من التلف أثناء العدوى الأولية.
- عدد الفئران مع لقطات من الأذن أو الأذن لكمة.
- بعد كل من الفئران تم ترقيم؛ باستخدام pipettor 20 ميكرولتر، ونحن تصيب كل عين مع PFU 6 10 (5 ميكرولتر). نحن تصيب عين واحدة فقط وعادة العين اليمنى. نضع أيضا 5 ميكرولتر من HBSS إلى العين الأخرى لإبقائها رطبة أثناء وجودهم تخدير. 5 أيار كافية للحفاظ على الماء من العيون منذ يتم تنفيذ الإجراءات في أقل من 10 دقيقة، وأعطيت جرعات التخدير للحيوانات مع وفقا لذلك. وأكد العدوى عن طريق الفئران ينظف 3 أيام بعد الإصابة قضيب من القطن المعقمة التي كان رطب في 1 مل من وسائل الإعلام فيرو. ثم يتم إضافة 100 ميكرولتر للخلايا فيرو نمت في 48 لوحات جيدة. هذه اللوحات والرصد اليومي للآثار الاعتلال الخلوي (CPE).
3. تنشيط الفئران من الكمون
- الفئران هي تخدير على الاقل 5 اسابيع بعد العدوى الأولية. تجدر الإشارة إلى أن لدينا تنشيط الفئران تصل إلى العدوى الأولية التالية والسنة لم يلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في الاستجابة.
- مرة واحدة يتم وضعها تخدير TM20 الصبغي فو transilluminator، والتي تنبعث الأشعة فوق البنفسجية B في طول موجة من 302 نانومتر الذروة بحيث يتعرض سوى عين واحدة لضوء الأشعة فوق البنفسجية-B. يتعرض كل الماوس ل250 سم ضوء UV إم جي-B 2.
- يتم تحديد تنشيط بواسطة ينظف العيون مع القطن المعقم قضيب التي يتم وضعها الأول في 1 مل من وسائل الإعلام في يوم فيرو 0 (UV-B وقبل التعرض للسيطرة على لسفاكي عفوية) ثم في أيام 1-7 بعد UV-B التشعيع. يتم تقييم المواد مسحة كما هو موضح في 2.5). بالنسبة لأولئك مسحات التي لديها فيروس المعدية وtittered كمية الفيروس عن طريق فحص لوحة القياسية باستخدام 12 لوحات جيدة.
- يتم تقييم الفئران السريرية لأمراض العين من قبل المراقب ملثمين باستخدام مجهر مجهر تشريح.
- تم تصنيف عتامة القرنية على مقياس من 0 إلى 4، حيث 0 يشير سدى واضحة، 1 إلى عتامة خفيفة اللحمية (2)، يشير إلى التعتيم معتدلة مع ميزات القزحية ملحوظ، 3 إلى التعتيم الكثيفة مع فقدان التفاصيل القزحية يعرف إلا هوامش تلميذ، و 4 إلى مجموع التعتيم الخلفي مع أي رأي.
- تم تصنيف اتساع الأوعية الدموية على مقياس من 1 إلى 8 من تقسيم القرنية إلى 4 أرباع الدائرة على قدم المساواة وتحديد مدى الأوعية الدموية في كل من هذه الأرباع.
- يتم قياس التهاب الجفن على النحو التالي: 0، لم الآفات؛ 1، تورم جفن الحد الأدنى، 2، معتدلة تصريف العين تورم ويابس، 3، تورم حاد، فقدان الشعر المعتدل المحيط بالعين، والآفات الجلدية، و 4، مع تورم شديد اغلاق العينين متقشرة، شديدة فقدان الشعر المحيط بالعين، والآفات الجلدية.
- دليل على inclu التهاب الدماغدائرة التنمية الاقتصادية منحنية الظهر، والشعر تكدرت، وشذوذات عصبية واضحة. يصرح باستخدامها في الفئران عندما عرض كبير من علامات التهاب الدماغ.
5. ممثل النتائج
نشرت لأول مرة نموذج المتكررة التي وصفت أعلاه Shimeld، وآخرون. 1-3. اختبارها ومختبرنا وقد تم استخدام نسخة معدلة من هذا النموذج لنشر العديد من المخطوطات على مدى السنوات 4-15. تم استخدام نموذج لتحديد الدور الذي يمكن للخلوى الانترفيرون γ يلعب في مرض HSV-1 المتكررة 10. لم الفئران التي تفتقر IFNγ عرض مرض القرنية من أسوأ كما هو موضح في الشكل 3، الفئران البرية من نوع 14. كما كان يستخدم بنجاح لتحديد القيمة العلاجية لقاح مختلفة يبني 6،10،11. لاحظ أنه في حالة واحدة اختبار لقاح عملت بشكل جيد ولكن اتقائيا لم يثبت أن تكون فعالة علاجيا 6. ومع ذلك،عندما تم اختبار لقاح فيروسي غير كفء النسخ المتماثل، فإنه لم يكن فعالا إلا قائي، ولكن أيضا فعالة جدا علاجية 10،11، انظر الشكل 5 في إشارة 10. وفي الآونة الأخيرة وقد استخدمنا هذا النموذج لتحديد ما إذا كانت الفروق بين الجنسين كشفها في الفئران التي تمر HSK المتكررة. كما يوضح الشكل (1)، ذكر C57BL / 6 الفئران التعتيم عرض أقل بكثير من القيام القرنية C57BL أنثى / الفئران 6. وبالمثل، أظهرت الفئران الذكور عندما تم تقييم اتساع الأوعية الدموية القرنية، أقل بكثير نمو الأوعية الجديدة في القرنية مما فعلت الفئران الإناث (الشكل 2). نحن نقوم حاليا باختبار ما إذا كان هذا النمط الظاهري هو سلالة معينة قبل تنفيذ تحليل مماثل في سلالات أخرى من الفئران. سوف نقوم أيضا تحديد ما إذا الفرق ويرجع ذلك إلى عدم وجود هرمون تستوستيرون أو وجود هرمون الاستروجين.
الشكل 1. المرض القرنية في C57BL الذكور والإناث / 6 عقب سلالات الفئران UV-B تنشيط المستحث. وقد حثت الفئران المصابة خفية لإعادة تنشيط مع UV-B التشعيع والفئران تم رصد لعتامة القرنية لمدة 35 يوما. وكانت أعداد الفئران المستخدمة في هذه الدراسات على النحو التالي: ذكور: ن = 15؛ الإناث، ن = 15. تشير النتائج إلى متوسط ± SEM. * كان هناك أكبر بكثير من الفيروسات التي يسببها المرض في الفئران C57BL / 6 انثى للأيام 14-35 (P = 0،001 حتي 0،01).
الشكل 2. مرض القرنية في C57BL الذكور والإناث / 6 عقب سلالات الفئران UV-B تنشيط المستحث. وقد حثت الفئران المصابة خفية لإعادة تنشيط مع UV-B التشعيع والفئران تم رصد لاتساع الأوعية الدموية القرنية لمدة 35 يوما. وكانت أعداد الفئران المستخدمة في هذه الدراسات على النحو التالي: ذكور، ن= 15؛ الإناث، ن = 15. تشير النتائج إلى متوسط ± SEM. * كان هناك أكبر بكثير من الفيروسات التي يسببها المرض في الفئران C57BL / 6 انثى للأيام 14-28 (P = 0،001 حتي 0،01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نموذج متكرر من التهاب القرنية الهربسي اللحمية (HSK) الموصوفة هنا تمكن المحقق لدراسة HSK الإنسان في النموذج الذي هو أكثر اتساقا مع ما لوحظ خلال الأمراض التي تصيب البشر. وهكذا، نقاط القوة للنموذج هي أن المرض يحدث في سياق نظام المناعة لديها بالفعل خلال حفز المرض الأساسي. وبما أن هذه الفئران لديها بالفعل الاستجابة المناعية للHSV-1، والعوامل التي تنشيط الاستجابة المناعية التي تختلف عن تلك التي يحتمل إنشاؤها في الأصل. لذلك، سوف تدخل علاجي لمنع HSK الابتدائي لا يؤدي دائما إلى تحسين حال HSK المتكررة والتي أوضحنا في مختلف المنشورات عند تقييم الاختلافات بين HSK الابتدائي والمتكررة 6،8،10-13،15. كما سبقت الإشارة إليه، وهذا هو الحال عندما سيما تطوير لقاحات لمنع HSK الإنسان. ومعظم اللقاحات منع تطور HSK الابتدائي ولكن ثبت عدد قليل جدا من أن تكون فعالة في الحد من recurrent HSK 6،10،11.
نقاط الضعف في هذا النموذج هي أنه يأخذ وقتا أطول لإجراء التجربة. هناك فترة أسبوع بعد ما يقرب من 6 العدوى الأولية خلالها يصاب خفية الفئران ويتم استقلاب المصل تدار الإنسان. وعلاوة على ذلك، ليس كل الفئران التي يصاب خفية إفراز الفيروس كشفها في الفيلم المسيل للدموع من العين المصابة. هذا لا يعني أنهم لا تنشيط، الا أننا لا نستطيع الكشف عن تنشيط الفيروس عن طريق زراعة. من المرجح جدا أن معظم، إن لم يكن جميع الفئران لا تنشيط ولكنها لا تنتج أعداد كافية من الفيروس ليتم الكشف عن لوحة من الفحص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور جاي Pepose لمساعدة تدريس نموذج لنا. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح EY11885 (PMS)، EY21247 (PMS) ومنحة من البحوث غير المقيد للوقاية من العمى لقسم العيون.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Human Serum | Sigma | S7023 | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-C1 | |
| Pen/ Strep | Sigma | P4333 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290018 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Centrifuge | Beckman | 52-21 | |
| Transilluminatior | UVP | 95-0452-02 | |
| Sonicatior | Branson | Sonifier 450 | |
| Oak Ridge Tubes | Nalgene | Z 720410 | |
| Flasks- 7150 | Corning | 430823 | |
| Plates- 12 well | Corning | CLS 3513 | |
| Plates- 48 well | Corning | CLS 3548 | |
| Sterile Conical Tubes- 30 ml | Corning | CLS 430828 | |
| Sterile Cotton-tipped Applicators | Fisher | 23-400-125 | |
| 30G Needles | Becton-Dickinson | 305106 | |
| 25G Needles | BD | 305122 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309602 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 |
References
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, B., Easty, D. An improved model of recurrent herpetic eye disease in mice. Curr. Eye Res. 8, 1193-1205 (1989).
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Reactivation of latent infection and induction of recurrent herpetic eye disease in mice. J. Gen. Virol. 71, 397-404 (1990).
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Passive immunization protects the mouse eye from damage after herpes simplex virus infection by limiting spread of virus in the nervous system. J. Gen. Virol. 71, 681-687 (1990).
- Laycock, K. A., Lee, S. F., Brady, R. H., Pepose, J. S. Characterization of a murine model of recurrent herpes simplex viral keratitis induced by ultraviolet B radiation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 2741-2746 (1991).
- Keadle, T. L., Stuart, P. M. IL-10 ameliorates corneal disease in a mouse model of recurrent herpetic keratitis. Microbial Path. 38, 13-21 (2005).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Miller, J. K., Hook, K. K., Fenoglio, E. D., Francotte, M., Slaoui, M., Stuart, P. M., Pepose, J. S. Efficacy of a recombinant glycoprotein D subunit vaccine on the development of primary and recurrent ocular infection with herpes simplex virus type 1 in mice. J. Inf. Dis. 176, 331-338 (1997).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Proinflammatory cytokines IL-1 and TNF-a are required for recurrent herpetic keratitis in NIH mice. Invest. Ophth. Vis. Sci. 41, 96-102 (2000).
- Keadle, T. L., Usui, N., Laycock, K. A., Kumano, Y., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Corneal cytokine expression in a murine model recurrent herpetic stromal keratitis. Ocular Immunol. Inflam. 9, 193-205 (2001).
- Keadle, T. L., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. CD4+ and CD8+ cells are key participants in the development of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. Microbial Path. 32, 255-262 (2002).
- Keadle, T. L., Morrison, L. A., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic immunization with a virion host shutoff-defective, replication-incompetent herpes simplex virus type 1 strain limits recurrent herpetic ocular infection. J. Virol. 76, 3615-3625 (2002).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Morris, J. L., Leib, D. A., Morrison, L. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic vaccination with vhs(-) herpes simplex virus reduces the severity of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. J. Gen. Virol. 83, 2361-2365 (2002).
- Keadle, T. L., Morris, J. L., Stuart, P. M. The effects of aminoguanidine on primary and recurrent ocular herpes simplex virus infection. Nitric Oxide. 13, 247-253 (2005).
- Stuart, P. M., Morris, J. E., Sidhu, M., Keadle, T. L. CCL3 protects mice from corneal pathology during recurrent HSV-1 infection. Front. Biosci. 13, 4407-4415 (2008).
- Keadle, T. L., Alexander, D. E., Leib, D. A., Stuart, P. M. Interferon gamma is not required for recurrent herpetic stromal keratitis. Virology. 380, 46-51 (2008).
- Carr, D. J., Austin, B. A., Halford, W. P., Stuart, P. M. Delivery of Interferon-gamma by an adenovirus vector blocks herpes simplex virus Type 1 reactivation in vitro and in vivo independent of RNase L and double-stranded RNA-dependent protein kinase pathways. J. Neuroimmunol. 206, 39-43 (2009).
