Summary
Большинство исследований герпетические заболевания роговицы использовать основной модели инфекции. Тем не менее, первичной инфекции ВПГ-1, как правило, не приводят к болезни человека. Здесь мы опишем периодически модели герпетического заболевания роговицы, которые более точно имитирует человеческую болезнь.
Abstract
Герпетическая болезнь глаз, называемый герпетический кератит стромальных (HSK), является потенциально ослепительно инфекции роговицы, что приводит к более 300.000 клинических посещений каждый год на лечение. От 1 до 2 процентов пациентов с клиническим заболеванием будет испытывать потерю зрения зараженных роговицы. Подавляющее большинство этих случаев являются результатом реактивации латентной инфекции простого герпеса первого типа вируса, а не в связи с острым заболеванием. Интересно, что острой инфекции является модель наиболее часто используется для изучения этого заболевания. Тем не менее, было отмечено, что периодически модели HSK бы лучше отражают то, что происходит во время клинической картины заболевания. Очередная животных моделей для HSK использовали как кроликов и мышей. Преимущество кроликов является то, что они испытывают реактивации с задержкой в отсутствие какого-либо известного стимула. Тем не менее, трудно изучить роль, что многие иммунологические факторы играют в периодических HSK потому что кролик модель не имеет иммунгические и генетические ресурсы, что мышь имеет. Мы решили использовать модель мыши для повторного HSK потому что она имеет то преимущество, существует много ресурсов, а также мы знаем, когда возобновление будет происходить, потому что реактивация индуцируется под воздействием UV-B света. До сих пор эта модель позволила тех лабораторий, использующих его для определения нескольких иммунологических факторов, которые важны для этой болезни. Это также позволило нам проверить, как терапевтический и эффективности вакцины.
Protocol
Примечание уходу за животными: Анальгетики не используются в данной модели, поскольку они являются противовоспалительными и таким образом не повлияет на модель.
1. Подготовка Вирус
- Расти HSV-1 на клетках Веро (80% вырожденная) с использованием начиная разбавления 0,01 множественности инфекции (в Т-150 колбы, примерно 5 х 10 5 бляшкообразующих единиц) в течение 3-4 дней, пока все клетки округло-до и легко смещаются, нажав колбу.
- Удалить СМИ стерильные пробирки и центрифуги Sorvall Legend RT при температуре 4 ° C и 3500 оборотов в минуту в течение 15 мин. После удаления супернатанта (см. п. 1.3), ресуспендируют большой осадок от каждой трубки 50 мл с 5 мл от общего числа средств массовой информации. Разрушать ультразвуком в течение 1 минуты в двух 30-всплесков сек.
- Удалите супернатант и введен в 50 мл стерильной Oak Ridge труб и центрифуге при 9000 оборотах в минуту, в течение 1 часа при температуре 4 ° С в Beckman J2-21 центрифуг. Это для производства небольших вирусных гранул. Удалите супернатант.
- Комбинат разрушать ультразвуком от 1,2 остроумиеч гранул от 1,3 и разрушать ультразвуком раз в течение 45 сек. Центрифуга Sorvall Legend в РТ на 1500 оборотах в минуту в течение 5 мин при 4 ° C. Сохранить супернатант. Это является вирус акции которых аликвоты и хранили при температуре -70 ° C.
- Титр вируса на клетках Vero. Я обычно пластина из 10 0 до 10 -8 разбавления (каждая из которых в 10-кратном разведении) 2x от 2 отдельные наборы разведения. Титрование вируса выполняется на 12-и стерильные чашки.
2. Мышь инфекции
- Вводите каждую мышь с 0,1 мл анестетика cocktail/20 г массы тела мыши (кетамин, 60 мг / кг + Ксилазин 5 мг / кг, разводят в HBSS). Этот коктейль используется потому, что он является одним из самых безопасных средств анестезии при надлежащей дозировке используется и эффект этого препарата очень недолго.
- Когда мышам под наркозом поцарапать роговицу правого глаза с 30 иглой использованием рассекает микроскопом, чтобы убедиться, что роговица не перфорированные.
- Каждая мышь Received внутрибрюшинного введения 1 мл объединенной человеческой сыворотки (Sigma, Темекула, Калифорния; анти-HSV реактивности с эффективной дозы для 50% вирусных нейтрализации 1:800) для того, чтобы защитить роговицу от повреждений во время первичной инфекции.
- Количество мышей с другом ухе клипы или на слух удар.
- После того как все мыши были пронумерованы, используя 20 мкл пипетки, мы заразить каждого глаза с 10 6 PFU (5 мкл). Мы заражать только один глаз и, как правило правый глаз. Мы также разместить 5 мкл HBSS на другой глаз, чтобы держать его влажным, пока они находятся под наркозом. 5 мкл является достаточным для поддержания гидратации глаза, так как процедуры выполняются менее чем за 10 мин, а животным вводили анестетик соответственно. Инфекция подтверждена моечные мышей 3 дня после инфицирования стерильного аппликатора хлопка, который был гидратированных в 1 мл Vero СМИ. Затем 100 мкл добавляют в Vero клеток, выращенных в 48-луночных планшетах. Эти плиты мониторинга ежедневно в течение цитопатического эффекта (CPE).
3. Возобновление мышей от Задержка
- Мышей анестезируют по крайней мере 5 недель после первичной инфекции. Следует отметить, что мы возобновлена мышей до одного года следующим первичной инфекции и не наблюдается существенных различий в ответе.
- После наркоза они находятся TM20 хромато-Vu трансиллюминатор, который излучает УФ-Б на пике волны 302 нм, так что только один глаз подвергается воздействию УФ-B света. Каждая мышь подвергается 250 мДж УФ-В свете см 2.
- Возобновление определяется путем взятия мазка глаз с аппликатором стерильной хлопковой, что сначала помещают в 1 мл Vero СМИ в день 0 (перед УФ-В экспозицию для контроля спонтанных Тримминги), а затем в дни с 1 по 7 пост-UV-B облучения. Материал тампона оценивается как описано в 2,5). Для тех, тампоны, которые имеют инфекционный вирус количество вируса хихикали от стандартного анализа налета с использованием 12-луночных планшетах.
- Мыши оценивают по клиническим заболеванием глаз в маске наблюдателя помощью бинокулярного микроскопа рассекает.
- Помутнение роговицы оценивается по шкале от 0 до 4, где 0 означает ясный стромы, 1 указывает на мягкое стромальные помутнения, 2 указывает на умеренную прозрачность, заметные особенности радужки, 3 указывает на плотную прозрачность с потерей определены подробно радужной оболочки, кроме ученика поля, а 4 указывает, общая непрозрачность, без заднего вида.
- Неоваскуляризации оценивается по шкале от 1 до 8 путем деления роговицы на 4 равных квадранта и определения степени васкуляризации в каждом из этих секторов.
- Блефарит измеряется следующим образом: 0, без повреждений, 1, минимальный отек век, 2, умеренный отек и твердые глазные разряда, 3, сильный отек, умеренная периокулярной выпадение волос и кожи поражений и 4, тяжелые отеки с глаз коркой замке, тяжелые периокулярной выпадение волос, кожи и поражения.
- Свидетельство энцефалита включенийДед сутулая спина, взъерошенные волосы, и очевидные неврологические нарушения. Мыши эвтаназии, когда они обнаруживают существенные признаки энцефалита.
5. Представитель Результаты
Очередная модель, которая была описана выше, был впервые опубликован Shimeld, и др.. 1-3. Они протестированы и наша лаборатория использует модифицированную версию этой модели, чтобы опубликовать много рукописей на протяжении многих лет 4-15. Эта модель была использована для определения той роли, которую цитокинов интерферона-γ играет в периодических HSV-1 заболевания 10. Как показано на рисунке 3, мышей, лишенных IFN-дисплее хуже заболеваниями роговицы, чем у мышей дикого типа 14. Было также успешно использоваться для определения терапевтической ценности различных вакцин строит 6,10,11. Обратите внимание, что в одном случае вакцины испытаны работал хорошо профилактически, но не оказаться терапевтически эффективные 6. Тем не менее,При репликации вирусной вакцины некомпетентность была протестирована, она была не только эффективной профилактической, но был также очень эффективным терапевтически 10,11 см. Рисунок 5 в ссылке 10. Совсем недавно мы использовали эту модель, чтобы определить, гендерные различия были обнаружены у мышей проходят периодические HSK. Как показано на рисунке 1 показано, самцов мышей C57BL / 6 отображать значительно меньше, помутнение роговицы, чем женщины C57BL / 6 мышей. Аналогичным образом, когда неоваскуляризации роговицы оценивали, самцы мышей продемонстрировали значительно меньше новое судно роста в роговице, чем самок мышей (рис. 2). Сейчас мы тестируем ли этот фенотип штамма конкретного, выполняя аналогичный анализ в других линий мышей. Мы также определить, является ли различие связано с отсутствием тестостерона или присутствие эстрогенов.
Рисунок 1. Заболеваниями роговицы в мужской и женской C57BL / 6 линий мышей после UV-B индуцированной активации. Латентно инфицированных мышей вынуждена возобновить с UV-B облучения и мышей наблюдали в течение помутнение роговицы в течение 35 дней. Число мышей, используемых для этих исследований были следующие: мужчины, п = 15; женщин, п = 15. Результаты показывают среднее ± SEM. * Был значительно больше, вирус-индуцированного заболевания у самок мышей C57BL / 6 дней 14-35 (р = 0,001 до 0,01).
Рисунок 2. Заболевания роговицы в мужской и женской C57BL / 6 линий мышей после UV-B индуцированной активации. Латентно инфицированных мышей вынуждена возобновить с UV-B облучения и мышей наблюдали в течение неоваскуляризации роговицы в течение 35 дней. Число мышей, используемых для этих исследований были следующие: мужчины, п= 15; женщин, п = 15. Результаты показывают среднее ± SEM. * Был значительно больше, вирус-индуцированного заболевания у самок мышей C57BL / 6 дней 14-28 (р = 0,001 до 0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Очередная модель герпетического кератита стромальных (HSK), описанные здесь, позволяет следователю для изучения человеческих HSK в модели, которая в большей степени соответствует тому, что наблюдается при болезни человека. Таким образом, сильные модели в том, что заболевание возникает в связи с иммунной системой, которая уже вынужденное течение основного заболевания. Так как эти мыши уже имеют иммунного ответа к ВПГ-1, факторы, активировать иммунный ответ, что, скорее всего, отличаются от тех, вызвавшего его. Таким образом, терапевтическое вмешательство, чтобы предотвратить первичную HSK не всегда приводит к улучшению периодически HSK, который мы показали в различных изданиях при оценке различия между первичной и периодической HSK 6,8,10-13,15. Как указывалось ранее, особенно это случай, когда разработку вакцин для предотвращения человеческих HSK. Большинство вакцин будет препятствовать развитию первичной HSK, но очень немногие из них было показано, что эффективность в снижении RECUrrent HSK 6,10,11.
Недостатки этой модели является то, что оно занимает гораздо больше времени, чтобы выполнить эксперимент. Существует почти 6 недель после первичной инфекции во время которого мышей становятся латентно инфицированных и вводят сыворотки крови человека метаболизируется. Кроме того, не все мыши, которые латентно инфицированных прольет обнаружить вирус в слезной пленки зараженного глаза. Это не значит, что они не активировать, только то, что мы не можем обнаружить их реактивации путем культивирования вируса. Вполне вероятно, что большинство, если не все у мышей активировать, но что они не производят достаточного количества вируса быть обнаружено бляшек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Джей Pepose за помощь в обучении модели нам. Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья грантов EY11885 (ПМС), EY21247 (PMS) и неограниченный грант от исследований в области профилактики слепоты в отделение офтальмологии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Human Serum | Sigma | S7023 | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-C1 | |
| Pen/ Strep | Sigma | P4333 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290018 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Centrifuge | Beckman | 52-21 | |
| Transilluminatior | UVP | 95-0452-02 | |
| Sonicatior | Branson | Sonifier 450 | |
| Oak Ridge Tubes | Nalgene | Z 720410 | |
| Flasks- 7150 | Corning | 430823 | |
| Plates- 12 well | Corning | CLS 3513 | |
| Plates- 48 well | Corning | CLS 3548 | |
| Sterile Conical Tubes- 30 ml | Corning | CLS 430828 | |
| Sterile Cotton-tipped Applicators | Fisher | 23-400-125 | |
| 30G Needles | Becton-Dickinson | 305106 | |
| 25G Needles | BD | 305122 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309602 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 |
References
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, B., Easty, D. An improved model of recurrent herpetic eye disease in mice. Curr. Eye Res. 8, 1193-1205 (1989).
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Reactivation of latent infection and induction of recurrent herpetic eye disease in mice. J. Gen. Virol. 71, 397-404 (1990).
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Passive immunization protects the mouse eye from damage after herpes simplex virus infection by limiting spread of virus in the nervous system. J. Gen. Virol. 71, 681-687 (1990).
- Laycock, K. A., Lee, S. F., Brady, R. H., Pepose, J. S. Characterization of a murine model of recurrent herpes simplex viral keratitis induced by ultraviolet B radiation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 2741-2746 (1991).
- Keadle, T. L., Stuart, P. M. IL-10 ameliorates corneal disease in a mouse model of recurrent herpetic keratitis. Microbial Path. 38, 13-21 (2005).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Miller, J. K., Hook, K. K., Fenoglio, E. D., Francotte, M., Slaoui, M., Stuart, P. M., Pepose, J. S. Efficacy of a recombinant glycoprotein D subunit vaccine on the development of primary and recurrent ocular infection with herpes simplex virus type 1 in mice. J. Inf. Dis. 176, 331-338 (1997).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Proinflammatory cytokines IL-1 and TNF-a are required for recurrent herpetic keratitis in NIH mice. Invest. Ophth. Vis. Sci. 41, 96-102 (2000).
- Keadle, T. L., Usui, N., Laycock, K. A., Kumano, Y., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Corneal cytokine expression in a murine model recurrent herpetic stromal keratitis. Ocular Immunol. Inflam. 9, 193-205 (2001).
- Keadle, T. L., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. CD4+ and CD8+ cells are key participants in the development of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. Microbial Path. 32, 255-262 (2002).
- Keadle, T. L., Morrison, L. A., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic immunization with a virion host shutoff-defective, replication-incompetent herpes simplex virus type 1 strain limits recurrent herpetic ocular infection. J. Virol. 76, 3615-3625 (2002).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Morris, J. L., Leib, D. A., Morrison, L. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic vaccination with vhs(-) herpes simplex virus reduces the severity of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. J. Gen. Virol. 83, 2361-2365 (2002).
- Keadle, T. L., Morris, J. L., Stuart, P. M. The effects of aminoguanidine on primary and recurrent ocular herpes simplex virus infection. Nitric Oxide. 13, 247-253 (2005).
- Stuart, P. M., Morris, J. E., Sidhu, M., Keadle, T. L. CCL3 protects mice from corneal pathology during recurrent HSV-1 infection. Front. Biosci. 13, 4407-4415 (2008).
- Keadle, T. L., Alexander, D. E., Leib, D. A., Stuart, P. M. Interferon gamma is not required for recurrent herpetic stromal keratitis. Virology. 380, 46-51 (2008).
- Carr, D. J., Austin, B. A., Halford, W. P., Stuart, P. M. Delivery of Interferon-gamma by an adenovirus vector blocks herpes simplex virus Type 1 reactivation in vitro and in vivo independent of RNase L and double-stranded RNA-dependent protein kinase pathways. J. Neuroimmunol. 206, 39-43 (2009).
