Summary
포진 성 각막 질환의 대부분의 연구는 주요 감염 모델을 사용합니다. 그러나, HSV-1 기본 감염은 일반적으로 인간의 질병으로 이어질하지 않습니다. 여기보다 밀접하게 인간의 질병을 모방 포진 성 각막 질환의 재발 모델을 설명합니다.
Abstract
포진 성 안구 질환, 포진 성이라고한다 stromal 각막염 (HSK)는 각막의 가능성이 눈부신 감염입니다 치료를위한 300,000 이상 임상 방문 각 연도에 발생합니다. 임상 질환을 가진 환자의 1 ~ 2 %에 감염된 각막의 비전 손실을 경험하게 될 것입니다. 이러한 경우의 대부분은 헤르페스에 의한 잠재 감염의 재 활성화의 결과는 급성 질환으로 인해 않는다고에게 바이러스를 입력하고 단순. 흥미롭게도, 급성 감염 대부분이 질병을 연구하는 데 사용되는 모델입니다. 그러나, HSK의 재발 모델은 임상 적 질환 중 발생하는 일이 더 반영 될 것이라고 생각했다. HSK에 대한 재발 동물 모델은 토끼와 쥐를 모두 고용했다. 토끼의 장점들은 지연의 재 활성화는 알려진 자극을 결석 경험한다는 것입니다. 그것은 토끼 모델이 immun가 없습니다 때문에 많은 면역 요인이 재발 HSK에서 재생하는 역할을 탐험하기가 어렵습니다, 말마우스가 있다고 ological 및 유전 자원. 재 활성화는 UV-B 빛에 노출에 의해 유도되기 때문에 우리는 거기에 많은 자원을 사용할 수있는 그런 이점을 가지고 있으며 또한 재 활성화가 발생합니다 때 알고 있기 때문에 재발 HSK의 마우스 모델을 사용하기로 결정했습니다. 지금까지이 모델이 질병에 중요한 여러 가지 면역 요소를 정의하는 데 사용하는 실험실 수있었습니다. 또한 우리는 치료 및 백신 효능을 모두 테스트 할 수 있습니다.
Protocol
동물 케어 참고 :이 항 염증이며 따라서 모델을 무효화하는 것처럼 진통제는이 모델에 사용되지 않습니다.
1. 바이러스의 작성
- 3-4일에 감염 0.01 다중성의 시작 희석을 (T-150 술병에 약 5 × 10 5 상패 형성 단위)를 사용하여 Vero 세포 (80 % 합류)에 HSV-1을 성장하는 것은 세포의 모든 때까지 반올림 업 쉽게 플라스크를 클릭하여 dislodged 수 있습니다.
- 4에 멸균 원심 분리기 튜브 및 Sorvall 전설 RT에서 원심 분리기로 미디어를 제거 ° C와 15 분에 3,500 RPM. 미디어 총 5 ML 각 50 ML 튜브의 표면에 뜨는 (1.3 참조), resuspend 큰 펠릿을 제거 후. 이 30 초 폭발에서 1 분에 Sonicate.
- 4 Beckman에서 ° C J2-21 원심 분리기에서 1 시간 동안 표면에 뜨는 및 9,000 rpm으로 50 ML 멸균 오크 릿지 튜브와 원심 분리기에 넣어 제거합니다. 이 작은 바이러스 펠릿을 생산하는 것입니다. 표면에 뜨는 폐기하십시오.
- 1.2 지혜에서 sonicate 결합H 1.3에서 펠렛 45 초에 다시 sonicate. 4에 5 분에 1,500 rpm으로 Sorvall 전설 RT의 원심 분리기 ° C. 표면에 뜨는를 저장합니다. 이 -70에서 aliquoted와 저장되어있는 바이러스 재고 ° C.를 구성
- Vero 세포에 Titer 바이러스. 에서 10 -8 희석 (각각 10 배 희석되는) 2 개의 희석 세트에서 2 배까지 나는 보통 판 10 0. 바이러스의 적정은 12도 무균 접시에 수행됩니다.
2. 마우스 감염
- 마취 cocktail/20 g 마우스 몸무게의 0.1 ML 각 마우스를 주사 (케타민, 60 밀리그램 / kg + Xylazine 5 MG / HBSS에 희석되어 kg). 이 적절한 복용량를 사용하고이 약의 효과가 매우 일시적인 있습니다 마취의 가장 안전한 방법 중 하나이기 때문에 칵테일이 사용됩니다.
- 쥐가 anesthetized 때하면 각막이 천공하지 않도록 해부 현미경을 사용하여 30 게이지 바늘로 오른쪽 눈의 각막을 긁어.
- 각 마우스 rece주요 감염 동안 손상 각막을 보호하기 위해, 풀링 된 인간의 혈청 (1:800의 50 % 바이러스 중화위한 효과적인 복용량과 안티 - HSV의 반응성 시그마, Temecula, 캘리포니아) 1 ML의 intraperitoneal 주사를 ived.
- 귀 클립 넣거나 귀를 펀치로 번호 쥐를.
- 마우스의 모든 번호를 한 후, 20 μl pipettor를 사용하여, 우리는 10 6 PFU (5 μl)와 각 눈을 감염. 우리는 한쪽 눈을 일반적으로 오른쪽 눈을 감염. 우리는 또한 그들이 anesthetized있는 동안은 촉촉한 유지하기 위해 다른 눈 HBSS의 5 μl를 놓습니다. 5 UL은 절차 미만 10 분에서 수행되며, 동물 따라 마취와 함께 복용되어 있기 때문에 눈의 보습을 유지하기에 충분한 것입니다. 감염은 Vero 미디어 1 ML에 수화했다 멸균면 작은 주걱으로 마우스에게 삼일 후 감염을 보라고하여 확인합니다. 그런 다음 100 μl를 48 잘 접시에서 자란 Vero 세포에 추가됩니다. 이 번호판은 cytopathic 효과를 매일 모니터링 (CPE).
3. 지연에서 마우스의 재 활성화
- 마우스는 기본 감염 후 적어도 오주 anesthetized 있습니다. 그것은 우리가 일년 다음과 같은 주요 감염에 마우스를 재 활성화하고 응답에 큰 차이를 관찰하지 않은 것을인지해야합니다.
- 일단 anesthetized 그들은 단지 하나의 눈이 UV-B 빛에 노출되는 등 302 nm의 피크 파장에서 UV-B 방출 TM20 Chromato-VU의 transilluminator를 배치하고 있습니다. 각 마우스는 250 UV-B의 MJ 빛 cm 2로 노출되어있다.
- 재가입 먼저 1-7 후 UV-B 조사 일에 다음 날 0에 Vero 미디어 1 ML에 위치 (자연 shedders에 대해 제어 할 수 UV-B 노출 전)되고 멸균면 작은 주걱으로 눈을 보라고에 의해 결정됩니다. 2.5에 설명 된대로 면봉 소재)가 평가됩니다. 전염성 바이러스를 가진 면봉을 위해 바이러스의 양이 12도 접시를 사용하여 표준 상패 분석에 의해 tittered 있습니다.
- 마우스는 쌍안 해부 현미경을 사용하여 가면 관찰자에 의해 임상 안과 질환에 대한 평가입니다.
- 각막 불투명도가 0 명확한 기질을 나타냅니다 0-4의 규모에 평가되며, 1 가벼운 stromal opacification을 나타냅니다, 2 알아볼 수 창포 기능과 함께 적당한 투명도를 나타냅니다, 3 나타냅니다 학생 여백, 4를 제외하고 정의 아이리스 세부의 손실과 밀도 투명도를 나타냅니다 더 뒤쪽 전경을 조망할 수있는 총 불투명도.
- Neovascularization은 4 동일한 당장 자리로 각막을 나누어 이러한 당장 자리의 각 vascularization의 범위를 결정하여 8-1의 규모에 평가하고 있습니다.
- Blepharitis은 다음과 같이 측정되지 않습니다 : 0, 더 병변, 1, 최소한의 눈꺼풀이 붓기, 2, 적당한 붓기와 피 각질의 안구 방전, 3, 심각한 부종, 중간 periocular 머리 손실, 피부 병변, 그리고 4, 눈을 겉 껍질이있는 다물고있는 심각한 부종, 심각한 periocular 헤어 손실 및 피부 병변.
- 뇌염 inclu의 증거ded가 다시 뻗치고 머리, 그리고 명백한 neurologic 이상을 hunched. 그들은 뇌염의 중요한 징후를 표시 할 때 마우스는 euthanized 있습니다.
5. 대표 결과
위에서 설명한 된 재발 모델이 처음 Shimeld, 외 발행되었습니다. 1-3. 그들은 테스트 및 실험실 년 4-15을 통해 많은 원고를 게시하는이 모델의 수정 된 버전을 사용하고 있습니다. 모델은 역할을 정의하는 데 사용 된이 재발 HSV-1 병 10 시토 킨은 인터페론-γ 재생. 로 그림 3에 도시 된 바와 같이,보다 IFNγ 표시 악화 각막 질환을 부족한 마우스는 야생 형 생쥐에게 14 했어요. 또한 여러 가지 백신 6,10,11을 구성의 치료 가치를 정의하는 데 성공적으로 사용되었다. 하나의 사건에서 테스트 백신 prophylactically 잘 작동하지만, 6 therapeutically 효과가 증명하지 않은 있습니다. 그러나,복제 - 무능 바이러스 백신을 테스트했을 때이 prophylactically 만 효과가 아니라, therapeutically도 10,11 매우 효과적이었고, 참조 10 그림 5를 참조하십시오. 최근 우리는 성별 차이가 재발 HSK를 겪고 생쥐에서 감지 된 여부를 결정하는이 모델을 사용했습니다. 그림 1은 설명으로 남성 C57BL / 6 마우스는 여성 C57BL / 6 쥐를보다 훨씬 적은 각막 투명도를 표시합니다. 마찬가지로, 각막 neovascularization이 평가되었을 때, 남성은 여성 마우스 마우스 (그림 2)보다 각막에 훨씬 적은 새로운 혈관의 성장을 보여 주었다. 우리는 현재이 표현형 쥐의 다른 변종 유사한 분석을 수행하여 특정 변형 여부를 테스트하고 있습니다. 우리는 또한 차이가 남성 호르몬의 부족이나 에스트로겐의 존재로 인해 여부를 결정합니다.
그림 1. UV-B 유발 재 활성화에 따라 남성과 여성의 C57BL / 6 마우스 종자의 각막 질병. Latently 감염 마우스는 UV-B 조사 및 마우스 35일에 대한 각막 투명도에 대한 모니터링 된을 다시 활성화 할 수 있도록 유도했다. 다음과 같이이 연구에 사용 마우스의 번호는 있었다 : 남성, N = 15, 여성, N = 15. 결과는 평균 ± SEM을 나타냅니다. * 상당히 큰 바이러스 유발 질환은 일 14-35 (P = 0.001-0.01)에 대한 여성의 C57BL / 6 마우스에서 발생했습니다.
그림 2. UV-B 유발 재 활성화에 따라 남성과 여성의 C57BL / 6 마우스 종자의 각막 질병. Latently 감염 마우스는 UV-B 조사 및 마우스 35일에 대한 각막 neovascularization에 대한 모니터링 된을 다시 활성화 할 수 있도록 유도했다. 남성, N : 이러한 연구에 사용 마우스의 번호는 다음과 같이있었습니다= 15, 여성, N = 15. 결과는 평균 ± SEM을 나타냅니다. * 상당히 큰 바이러스 유발 질환은 일 14-28 (P = 0.001-0.01)에 대한 여성의 C57BL / 6 마우스에서 발생했습니다.
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Discussion
포진 성 각막염 stromal의 재발 모델 (HSK)는 여기서 설명하는 것은 연구자가 인간의 질병 중에 관찰되는 그와 더 일관성있는 모델이 인간의 HSK 공부를 할 수 있습니다. 따라서, 모델의 장점은 질병 주요 질병 중에 자극에 의해 이미 면역 체계의 맥락에서 발생한다는 점입니다. 이 마우스가 이미 HSV-1에 면역 반응이 있기 때문에, 그 면역 반응을 활성화하는 요인은 원래를 생성 한 것과 가능성이 다릅니다. 따라서, 기본 HSK을 방지하기 위해 치료 개입은 항상 기본 및 재발 HSK 6,8,10-13,15 사이의 차이를 평가할 때 우리는 다양한 출판물에 게재되는, 재발 HSK의 개량으로 이어질하지 않습니다. 이전에 표시된 바와 같이 인간의 HSK을 방지하기 위해 백신을 개발할 때,이 경우 특정입니다. 대부분의 백신은 기본 HSK의 개발을 방지 할 수 있지만, 거의가 recu을 감소에 효과 표시되었습니다HSK 6,10,11 rrent.
이 모델의 약점은 실험을 수행하기가 훨씬 더 많은 시간이 소요한다는 점입니다. 마우스가 latently 감염되고 관리 인간의 혈청이 대사되는 동안 차 감염 후 거의 6 주 기간이 있습니다. 또한, latently 감염된 모든 마우스는 감염된 눈의 눈물 영화로 감지 바이러스를 발산합니다. 이것은 우리가 배양 바이러스에 의해 자신의 재 활성화를 검색 할 수뿐만들이 활성화되지 않은 것을 의미하는 것은 아닙니다. 그것은 대부분의 모든 쥐가 재 활성화하려면 어떻게해야합니까하지 않을 경우하지만 그들은 상패 분석에 의해 검출 될 수있는 바이러스의 충분한 숫자를 생성하지 않는 것이 매우 가능성이 높습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
저자는 우리에게 모델을 가르치고 돕기 위해 박사 제이 Pepose 감사드립니다. 이 작품은 건강 보조금 EY11885 (PMS), EY21247 (PMS) 및 안과 부서에 실명을 방지하기 위해 연구에서 제한 교부금의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Human Serum | Sigma | S7023 | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-C1 | |
| Pen/ Strep | Sigma | P4333 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290018 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Centrifuge | Beckman | 52-21 | |
| Transilluminatior | UVP | 95-0452-02 | |
| Sonicatior | Branson | Sonifier 450 | |
| Oak Ridge Tubes | Nalgene | Z 720410 | |
| Flasks- 7150 | Corning | 430823 | |
| Plates- 12 well | Corning | CLS 3513 | |
| Plates- 48 well | Corning | CLS 3548 | |
| Sterile Conical Tubes- 30 ml | Corning | CLS 430828 | |
| Sterile Cotton-tipped Applicators | Fisher | 23-400-125 | |
| 30G Needles | Becton-Dickinson | 305106 | |
| 25G Needles | BD | 305122 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309602 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 |
References
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