Summary
De meeste studies van de herpes ziekte van het hoornvlies gebruik maken van een primaire infectie model. Echter, primaire infectie met HSV-1 gewoonlijk niet tot menselijke ziekte. Hier beschrijven we een terugkerende herpes model van ziekte van het hoornvlies, die beter nabootst menselijke ziekte.
Abstract
Herpetische oogziekte, genoemd herpetische keratitis stromale (HSK), is een potentieel verblindende infectie van de cornea die resulteert in meer dan 300.000 klinische bezoeken per jaar voor behandeling. Tussen 1 en 2 procent van de patiënten met klinische ziekte ervaart verlies van het gezichtsvermogen van de geïnfecteerde hoornvlies. De overgrote meerderheid van deze gevallen zijn het resultaat van reactivering van een latente infectie door herpes simplex virus type I en niet door acute ziekte. Interessant is dat de acute infectie is de meest gebruikte model om deze ziekte te bestuderen. Er werd echter van mening dat een steeds terugkerend model van HSK zou meer een afspiegeling is van wat er gebeurt tijdens de klinische ziekte. De recurrente diermodellen voor HSK hebben gebruikt zowel konijnen en muizen. Het voordeel van konijnen is dat ze ervaren reactivering van latentie bij gebrek aan een bekende stimulus. Dat gezegd hebbende, is het moeilijk om te verkennen de rol die vele immunologische factoren spelen in terugkerende HSK, omdat het konijn model heeft niet de Immunsche en genetische hulpbronnen die de muis heeft. We kozen voor het muismodel voor terugkerende HSK gebruiken omdat het heeft het voordeel dat er veel middelen beschikbaar en ook wij weten wanneer reactivering zal optreden omdat reactivering wordt veroorzaakt door blootstelling aan UV-B licht. Tot nu toe heeft dit model mag deze laboratoria te gebruiken om een aantal immunologische factoren die belangrijk zijn voor deze ziekte te definiëren. Het is ook toegestaan om zowel therapeutische als werkzaamheid van het vaccin te testen.
Protocol
Animal Care Note: analgetica niet gebruikt in dit model zijn anti-inflammatoire en zou dus het model ongeldig.
1. Bereiding van Virus
- HSV-1 groeien op Vero-cellen (80% confluent) met een verdunning start van 0,01 multipliciteit van infectie (in T-150 kolf ongeveer 5 x 10 5 plaque vormende eenheden) gedurende 3-4 dagen totdat alle cellen afgerond-up en zijn gemakkelijk verdreven door het raken van de kolf.
- Verwijder media steriele centrifugebuizen en centrifugeer in Sorvall Legend RT bij 4 ° C en 3500 rpm gedurende 15 minuten. Na verwijdering supernatant (zie 1.3), resuspendeer grote pellet van elk 50 ml buis met 5 ml media totaal. Sonificeer 1 min in twee 30 sec barst.
- Verwijder supernatant en in 50 ml steriele Oak Ridge en centrifugeer bij 9000 rpm, gedurende 1 uur bij 4 ° C in een Beckman J2-21 centrifuge. Dit is om een kleine virale pellet. Verwijder het supernatant.
- Combineer ultrasone trillingen van 1,2 with pellet van 1,3 en ultrasone trillingen weer voor 45 sec. Centrifuge in Sorvall Legend RT bij 1500 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C. Sla het supernatant. Dit vormt de virus stock die gealiquoteerd en opgeslagen bij -70 ° C.
- Titer virus op Vero-cellen. Ik meestal plaat 10 0 naar 10 -8 verdunning (die elk een 10-voudige verdunning) 2x uit 2 afzonderlijke verdunning sets. Titratie van virus wordt uitgevoerd op 12-well platen steriel.
2. Muis Infectie
- Injecteer elke muis met 0,1 ml anestheticum cocktail/20 g lichaamsgewicht muis (Ketamine, 60 mg / kg + Xylazine 5 mg / kg die wordt verdund in HBSS). Deze cocktail wordt gebruikt omdat het een van de veiligste anesthesie bij juiste doseringen worden gebruikt en de effecten van dit geneesmiddel zeer korte duur.
- Als muizen verdoofd krassen op het hoornvlies van het rechteroog van een 30 gauge naald met een dissectiemicroscoop dat de cornea niet geperforeerd is.
- Elke muis receIVED een intraperitoneale injectie van 1 ml van samengevoegd menselijk serum (Sigma, Temecula, Californië, anti-HSV reactiviteit met een effectieve dosis voor 50% neutralisatie van virale 1:800) om hoornvliezen beschermen tegen beschadiging tijdens primaire infectie.
- Nummer de muizen met beide oren clips of op het gehoor punch.
- Nadat alle muizen zijn genummerd, met een pipet 20 pi, we infecteren met elk oog 10 6 PFU (5 pi). We infecteren slechts een oog en typisch het rechteroog. Wij plaatsen ook 5 pi HBSS naar het andere oog vochtig te houden terwijl ze verdoofd. 5 ul volstaat om hydratatie van het oog te handhaven, omdat de procedures worden uitgevoerd in minder dan 10 minuten en de dieren gedoseerd met verdoving dienovereenkomstig. Besmetting bevestigd door zwabberen muizen 3 dagen na infectie met een steriele katoenen applicator dat gehydrateerde was in 1 ml van Vero media. Vervolgens werd 100 ul toegevoegd aan Vero-cellen gekweekt in 48-well platen. Deze platen worden dagelijks toezicht op cytopathogeen effect (Cpe).
3. Reactivering van Muizen uit Latency
- Muizen verdoofd tenminste 5 weken na primaire infectie. Opgemerkt dat we muizen geactiveerd tot een jaar na primaire infectie en niet waargenomen significante verschillen in respons.
- Zodra ze verdoofd geplaatst TM20 chromatografische Vu transilluminator, dat UV-B uitzendt met een piekgolflengte van 302 nm zodanig dat alleen een oog wordt blootgesteld aan UV-B licht. Elke muis wordt blootgesteld aan 250 mJ van UV-B licht cm 2.
- Reactivering wordt bepaald door zwabberen ogen met steriele katoenen applicator die eerst in 1 ml van Vero media geplaatst op dag 0 (vóór UV-B blootstelling te controleren voor spontane shedders) en daarna op dag 1 tot 7 na UV-B straling. Het wattenstaafje materiaal wordt geëvalueerd zoals beschreven in 2.5). Voor die swabs dat besmettelijke virus de hoeveelheid virus wordt giechelde door een standaard plaque assay met 12 putjes.
- Muizen worden geëvalueerd voor klinische oogziekte door een gemaskerde waarnemer met behulp van een binoculaire stereomicroscoop.
- Vertroebeling van het hoornvlies wordt beoordeeld op een schaal van 0 tot 4, waarbij 0 aangeeft duidelijke stroma, 1 milde stromale troebelingen aangeeft, 2 matig dekking geeft met waarneembare iris functies, 3 geeft aan dichte dekking met het verlies van bepaalde iris detail, behalve pupil marge, en 4 betekent totale dekking zonder posterior uitzicht.
- Neovascularisatie beoordeeld op een schaal van 1 tot 8 door het hoornvlies in 4 gelijke kwadranten en bepalen van de mate van vascularisatie in elk van deze kwadranten.
- Blefaritis wordt als volgt gemeten: 0, geen beschadigingen, 1, minimale ooglid zwelling, 2, matige zwelling en knapperig ooguitvloeiing, 3, ernstige zwelling, matige perioculaire haaruitval, en de huid laesies, en 4, ernstige zwelling met de ogen vastgeroeste dicht, ernstige perioculaire haaruitval en huidaandoeningen.
- Bewijs van encefalitis included terug gebogen, gegolfde haar, en voor de hand liggende neurologische afwijkingen. Muizen zijn geëuthanaseerd als ze weer te geven significante symptomen van encefalitis.
5. Representatieve resultaten
De terugkerende model dat hierboven beschreven werd eerst door Shimeld, et al.. 1-3. Ze testten en ons laboratorium is met behulp van een aangepaste versie van dit model voor vele manuscripten te publiceren over de jaren 4-15. Het model werd gebruikt om de rol te bepalen dat het cytokine interferon-γ speelt in recidiverende HSV-1 ziekte 10. Zoals getoond in figuur 3, muizen die IFNy weergegeven erger corneaziekten dan heeft wild-type muizen 14. Ook werd met succes gebruikt om de therapeutische waarde van verschillende vaccin-constructen 6,10,11 definiëren. Merk op dat in het ene geval het vaccin getest goed gewerkt profylactisch maar niet blijken te zijn therapeutisch effectief 6. Echterwanneer een replicatie-incompetent viraal vaccin werd getest, was het niet alleen effectief profylactisch, maar ook zeer effectief therapeutisch 10,11, zie figuur 5 in referentie 10. Meer recent hebben we gebruikt dit model om te bepalen of geslachtsgebonden verschillen zijn detecteerbaar in muizen periodieke HSK. Zoals figuur 1 toont, mannelijke C57BL / 6 muizen vertonen aanzienlijk minder dan hoornvlies doen vrouwelijke C57BL / 6 muizen. Ook wanneer corneale neovascularisatie werd geëvalueerd mannelijke muizen vertoonden minder nieuwe vaatgroei in de cornea heeft dan vrouwelijke muizen (figuur 2). Momenteel testen we of dit fenotype stamspecifieke door een soortgelijke analyse in andere muizenstammen. Daarnaast zal ook of het verschil te wijten aan het gebrek aan testosteron of de aanwezigheid van oestrogeen.
Figuur 1. Ziekte van het hoornvlies bij mannelijke en vrouwelijke C57BL / 6 muizenstammen na UV-B geïnduceerde reactivering. Latent geïnfecteerde muizen werden geïnduceerd om opnieuw met UV-B straling en muizen werden gecontroleerd op het hoornvlies gedurende 35 dagen. Het aantal muizen gebruikt voor deze studies waren als volgt: mannen, n = 15; vrouwen, n = 15. Resultaten geven het gemiddelde ± SEM. * Er was significant groter virus-geïnduceerde ziekte in vrouwelijke C57BL / 6 muizen voor dagen 14 tot 35 (P = 0,001 tot 0,01).
Figuur 2. Ziekte van het hoornvlies bij mannelijke en vrouwelijke C57BL / 6 muizenstammen na UV-B geïnduceerde reactivering. Latent geïnfecteerde muizen werden geïnduceerd om opnieuw met UV-B straling en muizen werden gedurende corneale neovascularisatie gedurende 35 dagen. Het aantal muizen gebruikt voor deze studies waren als volgt: mannetjes, n= 15; vrouwen, n = 15. Resultaten geven het gemiddelde ± SEM. * Er was significant groter virus-geïnduceerde ziekte in vrouwelijke C57BL / 6 muizen voor dagen 14 tot 28 (P = 0,001 tot 0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De recurrente model van herpetische stromale keratitis (HSK) hier beschreven staat stelt de onderzoeker voor de menselijke HSK studeren in een model dat meer in overeenstemming is met hetgeen wordt waargenomen tijdens ziekte bij de mens. Dus het model sterktes die ziekte zich in het kader van een immuunsysteem dat reeds door gestimuleerd tijdens primaire ziekte. Omdat deze muizen al een immuunrespons tegen HSV-1, de factoren die de immuunrespons opnieuw waarschijnlijk verschillend van die oorspronkelijk gegenereerd. Daarom zullen therapeutische interventie op de primaire HSK voorkomen niet altijd tot verbetering van terugkerende HSK, die we hebben laten zien in diverse publicaties bij de beoordeling van de verschillen tussen primaire en terugkerende HSK 6,8,10-13,15. Zoals reeds aangegeven, is dit bijzonder het geval wanneer het ontwikkelen van vaccins voor menselijk HSK voorkomen. De meeste vaccins voorkomt de ontwikkeling van primaire HSK maar weinig is aangetoond effectief te verminderen recurrent HSK 6,10,11.
De zwakke punten van dit model is dat het veel langer duurt om uit te voeren een experiment. Er is een bijna 6 weken na de primaire infectie waarin de muizen latent geïnfecteerd raken en de toegediende humaan serum wordt gemetaboliseerd. Bovendien zijn niet alle muizen die latent geïnfecteerd zijn zal detecteerbaar virus afgestoten in de traanfilm van de geïnfecteerde oog. Dit betekent niet dat ze niet opnieuw te activeren, alleen dat we kunnen niet hun reactivering te detecteren door het kweken van virus. Het is zeer waarschijnlijk dat de meeste, zo niet alle muizen niet opnieuw maar dat ze niet voldoende aantallen virus worden gedetecteerd door plaque assay produceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Dr Jay Pepose bedanken voor het helpen van het onderwijzen van de model voor ons. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grants EY11885 (PMS), EY21247 (PMS) en een onbeperkte subsidie van onderzoek naar blindheid te voorkomen bij Afdeling Oogheelkunde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Human Serum | Sigma | S7023 | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-C1 | |
| Pen/ Strep | Sigma | P4333 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290018 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Centrifuge | Beckman | 52-21 | |
| Transilluminatior | UVP | 95-0452-02 | |
| Sonicatior | Branson | Sonifier 450 | |
| Oak Ridge Tubes | Nalgene | Z 720410 | |
| Flasks- 7150 | Corning | 430823 | |
| Plates- 12 well | Corning | CLS 3513 | |
| Plates- 48 well | Corning | CLS 3548 | |
| Sterile Conical Tubes- 30 ml | Corning | CLS 430828 | |
| Sterile Cotton-tipped Applicators | Fisher | 23-400-125 | |
| 30G Needles | Becton-Dickinson | 305106 | |
| 25G Needles | BD | 305122 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309602 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 |
References
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, B., Easty, D. An improved model of recurrent herpetic eye disease in mice. Curr. Eye Res. 8, 1193-1205 (1989).
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Reactivation of latent infection and induction of recurrent herpetic eye disease in mice. J. Gen. Virol. 71, 397-404 (1990).
- Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Passive immunization protects the mouse eye from damage after herpes simplex virus infection by limiting spread of virus in the nervous system. J. Gen. Virol. 71, 681-687 (1990).
- Laycock, K. A., Lee, S. F., Brady, R. H., Pepose, J. S. Characterization of a murine model of recurrent herpes simplex viral keratitis induced by ultraviolet B radiation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 2741-2746 (1991).
- Keadle, T. L., Stuart, P. M. IL-10 ameliorates corneal disease in a mouse model of recurrent herpetic keratitis. Microbial Path. 38, 13-21 (2005).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Miller, J. K., Hook, K. K., Fenoglio, E. D., Francotte, M., Slaoui, M., Stuart, P. M., Pepose, J. S. Efficacy of a recombinant glycoprotein D subunit vaccine on the development of primary and recurrent ocular infection with herpes simplex virus type 1 in mice. J. Inf. Dis. 176, 331-338 (1997).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Proinflammatory cytokines IL-1 and TNF-a are required for recurrent herpetic keratitis in NIH mice. Invest. Ophth. Vis. Sci. 41, 96-102 (2000).
- Keadle, T. L., Usui, N., Laycock, K. A., Kumano, Y., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Corneal cytokine expression in a murine model recurrent herpetic stromal keratitis. Ocular Immunol. Inflam. 9, 193-205 (2001).
- Keadle, T. L., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. CD4+ and CD8+ cells are key participants in the development of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. Microbial Path. 32, 255-262 (2002).
- Keadle, T. L., Morrison, L. A., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic immunization with a virion host shutoff-defective, replication-incompetent herpes simplex virus type 1 strain limits recurrent herpetic ocular infection. J. Virol. 76, 3615-3625 (2002).
- Keadle, T. L., Laycock, K. A., Morris, J. L., Leib, D. A., Morrison, L. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic vaccination with vhs(-) herpes simplex virus reduces the severity of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. J. Gen. Virol. 83, 2361-2365 (2002).
- Keadle, T. L., Morris, J. L., Stuart, P. M. The effects of aminoguanidine on primary and recurrent ocular herpes simplex virus infection. Nitric Oxide. 13, 247-253 (2005).
- Stuart, P. M., Morris, J. E., Sidhu, M., Keadle, T. L. CCL3 protects mice from corneal pathology during recurrent HSV-1 infection. Front. Biosci. 13, 4407-4415 (2008).
- Keadle, T. L., Alexander, D. E., Leib, D. A., Stuart, P. M. Interferon gamma is not required for recurrent herpetic stromal keratitis. Virology. 380, 46-51 (2008).
- Carr, D. J., Austin, B. A., Halford, W. P., Stuart, P. M. Delivery of Interferon-gamma by an adenovirus vector blocks herpes simplex virus Type 1 reactivation in vitro and in vivo independent of RNase L and double-stranded RNA-dependent protein kinase pathways. J. Neuroimmunol. 206, 39-43 (2009).
