Summary
La maggior parte degli studi sulla malattia erpetica corneale utilizzare un modello di infezione primaria. Tuttavia, l'infezione primaria con HSV-1 non tipicamente portare a malattie umane. Qui si descrive un modello ricorrente della malattia erpetica corneale, che più da vicino imita malattia umana.
Abstract
Malattie degli occhi erpetica, chiamato cheratite erpetica stromale (HSK), è un'infezione potenzialmente accecante della cornea che si traduce in oltre 300.000 visite cliniche ogni anno per il trattamento. Tra 1 e 2 per cento di quei pazienti con malattia clinica sperimenterà perdita della vista della cornea infetto. La grande maggioranza di questi casi sono il risultato di riattivazione di una infezione latente da herpes simplex virus di tipo I e non causa di malattia acuta. È interessante notare che l'infezione acuta è il modello più utilizzato per studiare questa malattia. Tuttavia, si è ritenuto che un modello ricorrente di HSK sarebbe più riflettente di ciò che avviene durante la malattia clinica. I modelli animali ricorrenti per HSK hanno utilizzato entrambi i conigli e topi. Il vantaggio di conigli è che essi sperimentano riattivazione dalla latenza in assenza di qualsiasi stimolo noto. Detto questo, è difficile esplorare il ruolo che molti fattori immunologici giocare in HSK ricorrenti in quanto il modello di coniglio non ha la immungici e le risorse genetiche che il mouse ha. Abbiamo scelto di utilizzare il modello di topo per HSK ricorrenti in quanto ha il vantaggio che vi siano molte risorse disponibili e anche sapere quando riattivazione avverrà perché riattivazione è indotta da esposizione a luce UV-B. Finora, questo modello ha permesso a tali laboratori di utilizzarlo per definire diversi fattori immunologici che sono importanti per questa malattia. Ha inoltre permesso di testare sia terapeutica e l'efficacia del vaccino.
Protocol
Cura degli animali Nota: Gli analgesici non sono utilizzati in questo modello in quanto sono anti-infiammatori e quindi si invaliderebbe il modello.
1. Preparazione di virus
- Grow HSV-1 su cellule Vero (80% confluenti) utilizzando una diluizione iniziale di 0,01 molteplicità di infezione (in T-150 beuta, circa 5 x 10 5 unità formanti placca) per 3-4 giorni finché tutte le celle sono arrotondate-up e sono facilmente sloggiato colpendo il pallone.
- Rimuovere i supporti per provette da centrifuga e centrifugare a sterili Sorvall Leggenda RT a 4 ° C e 3.500 rpm per 15 min. Dopo aver rimosso il surnatante (vedi 1.3), risospendere grande pellet da ciascuna provetta 50 ml con 5 ml di totale media. Ultrasuoni per 1 min in due burst 30 sec.
- Rimuovere il surnatante e mettere in 50 provette sterili Oak Ridge ml e centrifugare a 9000 rpm per 1 ora a 4 ° C in una Beckman J2-21 centrifuga. Questo è di produrre un piccolo pellet virale. Eliminare il surnatante.
- Combina ultrasuoni da 1,2 spiritoh pellet da 1,3 e sonicare ancora per 45 sec. Centrifuga in Sorvall Legenda RT a 1.500 giri al minuto per 5 minuti a 4 ° C. Salvare il surnatante. Questo costituisce il magazzino virus che viene suddiviso in aliquote e conservato a -70 ° C.
- Titer virus su cellule Vero. Io di solito tavola 10 a 0 su 10 -8 diluizione (ciascuno dei quali è a 10 volte più diluita) 2x da 2 serie di diluizione separati. Titolazione dei virus viene eseguita su piastre da 12 pozzetti sterili.
2. Infezione mouse
- Iniettare ciascuna mouse con 0,1 ml di anestetico peso cocktail/20 corpo del mouse g (ketamina, 60 mg / kg + TMA 5 mg / kg che è diluito in HBSS). Questo cocktail è usato perché è uno dei mezzi più sicuri di anestesia quando dosaggi adeguati sono utilizzati e gli effetti di questo farmaco sono molto breve.
- Quando i topi vengono anestetizzati graffiare la cornea dell'occhio destro con un ago calibro 30 utilizzando un microscopio per dissezione per assicurare che la cornea non è perforato.
- Ogni topo received una iniezione intraperitoneale di 1 ml di pool di siero umano (Sigma, Temecula, California; anti-HSV reattività con una dose efficace per il 50% di neutralizzazione virale 1:800) per proteggere cornee da danni durante l'infezione primaria.
- Numero i topi sia con clip orecchio o ad orecchio pugno.
- Dopo che tutti i topi sono stati numerati, utilizzando una pipetta 20 microlitri, si infettano ogni occhio con 10 6 PFU (5 pl). Abbiamo infettare un solo occhio e in genere l'occhio destro. Abbiamo anche posto 5 ml di HBSS per l'altro occhio per mantenerlo umido mentre sono anestetizzati. 5 ul è sufficiente a mantenere l'idratazione degli occhi poiché le procedure sono eseguite in meno di 10 minuti, e gli animali vengono dosati con anestetico conseguenza. Infezione è confermata tamponando topi 3 giorni dopo l'infezione con un applicatore di cotone sterile che è stata idratata in 1 ml di mezzo Vero. Quindi 100 pl viene aggiunto alle cellule Vero coltivate in 48 pozzetti. Queste piastre sono il monitoraggio giorno per effetto citopatico (CPE).
3. La riattivazione di topi da Latenza
- I topi vengono anestetizzati almeno 5 settimane dopo l'infezione primaria. Va notato che abbiamo riattivato topi fino ad un anno dopo l'infezione primaria e non sono osservate differenze significative nella risposta.
- Una volta anestetizzato sono collocati TM20 cromatografia Vu transilluminatore, che emette UV-B alla lunghezza d'onda di picco di 302 nm tali che solo un unico occhio è esposto alla luce UV-B. Ogni mouse è esposto a 250 mJ di UV-B luce cm 2.
- Riattivazione è determinato dal tampone occhi con applicatore cotone sterile che viene dapprima collocato in 1 ml di mezzo Vero giorno 0 (Prima UV-B per controllare l'esposizione per shedders spontanee) e poi il 1-7 post-UV-B irradiazione giorni. Il materiale tampone viene valutata come descritto in 2.5). Per quei tamponi che hanno virus infettivo la quantità di virus è ridacchiarono da un saggio di placca standard utilizzando 12 pozzetti.
- I topi vengono valutati per la malattia di occhio clinico da un osservatore mascherato utilizzando un microscopio binoculare da dissezione.
- Opacità corneale è valutato su una scala da 0 a 4, dove 0 indica stroma chiaro, 1 indica lieve opacizzazione stromale, 2 indica l'opacità moderata con distinguibili le caratteristiche dell'iride, 3 indica l'opacità densa con perdita di dettaglio definito dell'iride ad eccezione dei margini, degli alunni e 4 indica opacità totale senza vista posteriore.
- Neovascolarizzazione è valutato su una scala da 1 a 8 dividendo la cornea in quattro quadranti uguali e determinare il grado di vascolarizzazione in ciascuno di questi quadranti.
- Blefarite è misurata come segue: 0, nessuna lesione, 1, minimo gonfiore delle palpebre, 2, scarico moderato gonfiore oculare e croccante, 3, gonfiore grave, moderata perdita di capelli perioculare, e lesioni cutanee, e 4, forte gonfiore con intercettazione occhi crosta, grave perdita di capelli perioculare, e lesioni cutanee.
- Prove di encefalite inclusioneDED curvo indietro, capelli arruffati, e evidenti alterazioni neurologiche. I topi sono eutanasia quando mostrano segni significativi di encefalite.
5. Risultati rappresentativi
Il modello periodico che è stato sopra descritto è stato pubblicato da Shimeld, et al. 1-3. Hanno testato e il nostro laboratorio ha utilizzato una versione modificata di questo modello a pubblicare i manoscritti nel corso degli anni 4-15. Il modello è stato utilizzato per definire il ruolo che la citochina interferone-γ gioca a ricorrenti HSV-1 malattia 10. Come mostrato in figura 3, topi privi IFNy visualizzato malattia peggiore corneale di fatto topi wild-type 14. È stato anche usato con successo per definire il valore terapeutico di diversi vaccino diverso costruisce 6,10,11. Si noti che in un caso il vaccino testato funzionava bene profilatticamente ma non rivelarsi terapeuticamente efficace 6. Tuttavia,quando una replica-incompetente vaccino virale è stato testato, non era solo profilatticamente efficace, ma è anche molto efficace terapeuticamente 10,11, vedi Figura 5 nel riferimento 10. Più recentemente abbiamo usato questo modello per determinare se le differenze di genere erano rilevabili in topi sottoposti a HSK ricorrente. Come mostra la Figura 1 mostra, maschio topi C57BL / 6 visualizzare opacità corneale molto meno di quanto non facciano C57BL femmina / 6 topi. Analogamente, quando la neovascolarizzazione corneale è stata valutata, topi maschi dimostrato crescita dei vasi significativamente meno nuovo nella cornea di fatto topi femmina (Figura 2). Al momento stiamo testando se questo fenotipo è ceppo specifico eseguendo analisi simili in altri ceppi di topi. Abbiamo anche determinare se la differenza è dovuta alla mancanza di testosterone o la presenza di estrogeni.
Figura 1. Malattia corneale in C57BL maschio e femmina / 6 ceppi di topi a seguito UV-B riattivazione indotta. Topi latentemente infette sono stati indotti a riattivare con irradiazione UV-B e topi sono stati monitorati per opacità corneale per 35 giorni. I numeri di topi utilizzati per questi studi sono stati i seguenti: maschi, n = 15; femmine, n = 15. I risultati indicano media ± SEM. * Si è significativamente maggiore indotta da virus della malattia in topi femmina C57BL / 6 per i giorni 14-35 (P = 0,001-0,01).
Figura 2. Malattia corneale in C57BL maschio e femmina / 6 ceppi di topi a seguito UV-B riattivazione indotta. Topi latentemente infette sono stati indotti a riattivare con irradiazione UV-B e topi sono stati monitorati per la neovascolarizzazione corneale per 35 giorni. I numeri di topi utilizzati per questi studi sono stati i seguenti: maschi, n= 15; femmine, n = 15. I risultati indicano media ± SEM. * Si è significativamente maggiore indotta da virus della malattia in topi femmina C57BL / 6 per i giorni 14-28 (P = 0,001-0,01).
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Discussion
Il modello ricorrente di erpetica cheratite stromale (HSK) qui descritto consente al ricercatore di studiare HSK umano in un modello che è più coerente con quella che si osserva durante la malattia umana. Così, i punti di forza del modello sono che la malattia si verifica nel contesto di un sistema immunitario che ha già da stimolati durante la malattia primaria. Poiché questi topi già hanno una risposta immunitaria a HSV-1, i fattori che riattivano risposta immunitaria che sono probabilmente diverse da quelle che originariamente generato. Pertanto, l'intervento terapeutico per prevenire HSK primario non sempre portare a miglioramento di HSK ricorrenti, che abbiamo dimostrato in diverse pubblicazioni al momento di valutare le differenze tra primario e ricorrente HSK 6,8,10-13,15. Come indicato in precedenza, questo è il caso particolare in cui lo sviluppo di vaccini per prevenire HSK umana. La maggior parte dei vaccini impedirà lo sviluppo di HSK primario ma pochi hanno dimostrato di essere efficace nel ridurre recurrent HSK 6,10,11.
I punti deboli di questo modello sono che ci vuole molto più tempo per eseguire un esperimento. C'è un periodo di quasi 6 settimane dopo l'infezione primaria nel corso del quale i topi diventano latentemente infette e somministrato il siero umano viene metabolizzato. Inoltre, non tutti i topi che sono latentemente infette si libererà del virus rilevabile nel film lacrimale dell'occhio infetto. Questo non significa che non riattivare, solo che non riesce a rilevare la loro riattivazione da virus coltura. E 'molto probabile che la maggior parte, se non tutti i mouse si riattiva, ma che non producono un numero sufficiente di virus per essere rilevati mediante saggio di placca.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Jay Pepose per aiutare insegnare il modello da noi. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni EY11885 (PMS), EY21247 (PMS) e una sovvenzione illimitata di ricerca per prevenire la cecità al Dipartimento di Oftalmologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma | D5796 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Human Serum | Sigma | S7023 | |
| L-Glutamine | Cellgro | 25-005-C1 | |
| Pen/ Strep | Sigma | P4333 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290018 | |
| Centrifuge | Sorvall | Legend RT | |
| Centrifuge | Beckman | 52-21 | |
| Transilluminatior | UVP | 95-0452-02 | |
| Sonicatior | Branson | Sonifier 450 | |
| Oak Ridge Tubes | Nalgene | Z 720410 | |
| Flasks- 7150 | Corning | 430823 | |
| Plates- 12 well | Corning | CLS 3513 | |
| Plates- 48 well | Corning | CLS 3548 | |
| Sterile Conical Tubes- 30 ml | Corning | CLS 430828 | |
| Sterile Cotton-tipped Applicators | Fisher | 23-400-125 | |
| 30G Needles | Becton-Dickinson | 305106 | |
| 25G Needles | BD | 305122 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309602 | |
| 10 ml Syringe | BD | 309604 |
References
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