Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Tilbagevendende Herpetisk stromal keratitis i Mus, en model for at studere menneskets HSK

Published: December 18, 2012 doi: 10.3791/4276

Summary

De fleste undersøgelser af herpetisk corneal disease anvende en primær infektion model. Imidlertid primær infektion med HSV-1 ikke fører typisk til human sygdom. Her beskriver vi en tilbagevendende model af herpes hornhinde sygdom, som i højere grad efterligner menneskelig sygdom.

Abstract

Herpetisk øjensygdom, betegnet herpetisk stromal keratitis (HSK), er en potentielt blændende infektion af hornhinden, som resulterer i over 300.000 kliniske besøg hvert år til behandling. Mellem 1 og 2 procent af patienter med klinisk sygdom vil opleve tab af synet af den inficerede hornhinde. Langt størstedelen af ​​disse tilfælde er resultatet af reaktivering af en latent infektion med herpes simplex type I virus og ikke på grund af akut sygdom. Interessant den akutte infektion er den model, der oftest bruges til at studere denne sygdom. Imidlertid blev det opfattelsen, at en tilbagevendende model af HSK ville være mere reflekterende af hvad der sker i løbet af klinisk sygdom. De tilbagevendende dyremodeller for HSK har ansat både kaniner og mus. Fordelen af ​​kaniner er, at de oplever reaktivering fra latens fraværende nogen kendt stimulus. Når det er sagt, er det vanskeligt at undersøge den rolle, som mange immunologiske faktorer spiller ved tilbagevendende HSK fordi kaninmodellen ikke har Immungiske og genetiske ressourcer, at musen har. Vi valgte at bruge musemodel for tilbagevendende HSK fordi den har den fordel, at der er mange midler til rådighed, og ved vi også, når reaktivering vil opstå, fordi reaktivering induceres ved eksponering for UV-B-lys. Indtil videre har denne model mulighed for disse laboratorier bruge det til at definere flere immunologiske faktorer, der er vigtige for denne sygdom. Det har også givet os mulighed for at teste både terapeutisk og vaccinens effekt.

Protocol

Animal Care Note: Analgetika anvendes ikke i denne model, som de er antiinflammatoriske og vil således medføre, at modellen.

1. Fremstilling af virus

  1. Grow HSV-1 på Vero-celler (80% konfluente) under anvendelse af et udgangsmateriale fortynding af 0,01 infektionsmultiplicitet (i T-150-kolbe, ca 5 x 10 5 plaquedannende enheder) i 3-4 dage indtil alle celler har afrundede op og er nemt forrykke ved at ramme kolben.
  2. Fjern medier til sterile centrifugerør og centrifugeres i Sorvall Legend RT ved 4 ° C og 3500 rpm i 15 minutter. Efter fjernelse af supernatanten (se 1.3), resuspender store pellet fra hver 50 ml rør med 5 ml medium i alt. Sonikeres i 1 min i to 30 sek bursts.
  3. Fjern supernatanten og tages i 50 ml sterile Oak Ridge rør og centrifugeres ved 9.000 rpm i 1 time ved 4 ° C i en Beckman J2-21-centrifuge. Dette er for at producere en lille viral pellet. Supernatanten kasseres.
  4. Kombiner sonikeres fra 1,2 with pellet fra 1,3 og sonikeres igen i 45 sek. Centrifuge i en Sorvall Legend RT ved 1.500 rpm i 5 min ved 4 ° C. Gem supernatanten. Dette udgør virusstamopløsningen, som er alikvoteret og opbevaret ved -70 ° C.
  5. Titer virus på Vero-celler. I normalt plade 10 0 til 10 -8 fortynding (hver især er en 10-fold fortynding) 2x fra 2 separate fortynding sæt. Titrering af virus udføres på 12 brønds sterile plader.

2. Mus Infektion

  1. Injicere hver mus med 0,1 ml anæstetisk cocktail/20 g mus legemsvægt (ketamin, 60 mg / kg + Xylazin 5 mg / kg, som er fortyndet i HBSS). Denne cocktail anvendes, fordi det er et af de sikreste anæstesi ved passende doser anvendes, og virkningen af ​​dette stof er meget kortvarig.
  2. Når mus bedøves ridse hornhinden i det højre øje med en 30 gauge nål ved hjælp af et dissektionsmikroskop for at sikre, at hornhinden ikke er perforeret.
  3. Hver mus receIVED en intraperitoneal injektion af 1 ml poolet humant serum (Sigma, Temecula, Californien, anti-HSV reaktivitet med en effektiv dosis til 50% viral neutralisering af 1:800) for at beskytte hornhinder fra beskadigelse under primær infektion.
  4. Nummer musene med enten øreclips eller ved øret punch.
  5. Efter alle musene er blevet nummereret, under anvendelse af en 20 ul pipettor, inficere vi hvert øje med 10 6 PFU (5 pi). Vi inficerer kun et øje og typisk højre øje. Vi lægger også 5 ul af HBSS til det andet øje for at holde den fugtig, mens de er bedøvet. 5 ul er tilstrækkelig til at opretholde hydrering af øjnene, da procedurerne udføres i mindre end 10 min, og dyrene doseres med anæstetikum i overensstemmelse hermed. Infektion bekræftes ved pensling mus 3 dage efter infektion med en steril bomuld applikator, der blev hydratiseret i 1 ml Vero medier. Derefter 100 gl tilsættes til Vero-celler dyrket i plader med 48 brønde. Disse plader er overvågning dagligt for cytopatiske virkninger (Cpe).

3. Reaktivering af mus fra Latency

  1. Mus bedøves mindst 5 uger efter primær infektion. Det skal bemærkes, at vi har genaktiveret mus op til et år efter primær infektion og har ikke observeret signifikante forskelle i respons.
  2. Når først bedøvet de er placeret TM20 chromato-Vu transilluminator, som udsender UV-B ved en maksimal bølgelængde på 302 nm, således at kun et enkelt øje udsættes for UV-B lys. Hver mus eksponeret til 250 mJ UV-B lys cm2.
  3. Reaktivering bestemmes ved pensling øjne med steril bomuld applikator, der først anbringes i 1 ml Vero medier på dag 0 (før UV-B udsættelse for kontrol til spontane shedders) og derefter på dag 1 til 7 efter UV-B-bestråling. Podepinden materiale er vurderet som beskrevet i 2.5). For de podninger, der har infektiøst virus mængden af ​​virus er fnisede af et standard plaque-assay under anvendelse af plader med 12 brønde.
ove_title "> 4. klinisk vurdering

  1. Mus bedømmes for klinisk øjensygdom af en maskeret observatør, der anvender et binokulært dissektionsmikroskop.
  2. Corneauklarhed er vurderet på en skala fra 0 til 4, hvor 0 indikerer klart stroma, 1 indikerer mild stromal uklarheder, 2 indikerer moderat opacitet med mærkbare iris funktioner, 3 angiver tæt uigennemsigtighed med tab af definerede iris detalje undtagen elev margener, og 4 angiver total opacitet uden posterior view.
  3. Neovaskularisering er vurderet på en skala fra 1-8 ved at dividere hornhinden i 4 lige store kvadranter, og bestemmelse af omfanget af vaskularisering i hver af disse kvadranter.
  4. Blepharitis måles som følger: 0, ingen læsioner, 1, minimal øjenlåg hævelse, 2, moderat hævelse og crusty okulær udledning, 3, alvorlig hævelse, moderat periokulær hårtab, og hudlæsioner og 4, alvorlig hævelse med øjnene crusted lukket, svær periokulær hårtab, og hudlæsioner.
  5. Tegn på hjernebetændelse incluDED krumrygget tilbage, pjusket hår, og åbenlyse neurologiske abnormiteter. Mus bliver aflivet, når de viser tydelige tegn på hjernebetændelse.

5. Repræsentative resultater

Den tilbagevendende model, som blev beskrevet ovenfor, blev første gang offentliggjort af Shimeld, et al. 1-3. De testede og vores laboratorium har anvendt en modificeret version af denne model til at offentliggøre mange manuskripter årene 4-15. Modellen blev anvendt til at definere den rolle, som cytokin interferon-γ spiller i tilbagevendende HSV-1 sygdom 10. Som vist i figur 3, mus mangler IFNy viste dårligere corneal disease end gjorde vildtypemus 14. Det blev også brugt med succes til at definere den terapeutiske værdi af flere forskellige vaccine-konstruktioner 6,10,11. Bemærk, at i et tilfælde vaccinen testet arbejdede godt profylaktisk men ikke vise sig at være terapeutisk effektiv 6. Imidlertidnår en replikationsinkompetent viral vaccine blev testet, var det ikke kun effektiv profylaktisk, men var også meget effektiv terapeutisk 10,11, se figur 5 i reference 10. For nylig har vi brugt denne model til at bestemme, om kønsforskelle blev påvises hos mus gennemgår tilbagevendende HSK. Som figur 1 viser, mandlige C57BL / 6 mus viser signifikant mindre uklarhed af hornhinden end do kvindelige C57BL / 6 mus. Ligeledes når corneal neovaskularisering blev evalueret, hanmus viste signifikant mindre ny karvækst i hornhinden, end hvad hunmus (figur 2). Vi tester i øjeblikket, hvorvidt denne phenotype er stamme specifikt ved at udføre lignende analyser i andre musestammer. Vi vil også undersøge, om forskellen skyldes mangel på testosteron eller tilstedeværelse af estrogen.

Figur 1
Figur 1. Corneal sygdom i mandlige og kvindelige C57BL / 6 musestammer efter UV-B-induceret genaktivering. Latent inficerede mus blev induceret til at reaktivere og UV-B-bestråling, og musene blev overvåget for uklarhed af hornhinden i 35 dage. Antallet af mus anvendt til disse undersøgelser var som følger: mænd, n = 15; kvinder, n = 15. Resultater viser middel ± SEM. * Der var signifikant større virus-fremkaldt sygdom hos kvindelige C57BL / 6 mus til dag 14 til 35 (P = 0,001 til 0,01).

Figur 2
Figur 2. Corneal sygdom i mandlige og kvindelige C57BL / 6 musestammer efter UV-B-induceret genaktivering. Latent inficerede mus blev induceret til at reaktivere og UV-B-bestråling, og musene blev overvåget for corneal neovaskularisering i 35 dage. Antallet af mus anvendt til disse undersøgelser var som følger: mænd, n= 15; kvinder, n = 15. Resultater viser middel ± SEM. * Der var signifikant større virus-fremkaldt sygdom hos kvindelige C57BL / 6 mus til dag 14 til 28 (P = 0,001 til 0,01).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den tilbagevendende model af herpetisk stromal keratitis (HSK) beskrevet her giver investigator at studere menneskelig HSK i en model, der er mere i overensstemmelse med det, der er observeret under sygdom hos mennesker. Således er modellens styrke er, at sygdom opstår i forbindelse med et immunsystem, der allerede ved stimuleret under primær sygdom. Da disse mus allerede en immunreaktion mod HSV-1, de faktorer, der reaktivere at immunresponset sandsynligvis forskellige fra dem, der oprindeligt frembragt den. Derfor vil terapeutisk intervention for at forebygge primær HSK ikke altid fører til bedring af tilbagevendende HSK, som vi har vist i forskellige publikationer, når de evaluerer forskellene mellem primær og recidiverende HSK 6,8,10-13,15. Som tidligere anført er dette især tilfældet ved udviklingen af ​​vacciner for at forebygge human HSK. De fleste vacciner vil forhindre udvikling af den primære HSK men meget få har vist sig at være effektivt til reduktion recurrent HSK 6,10,11.

Svaghederne ved denne model er, at det tager meget længere tid at udføre et eksperiment. Der er en næsten 6 uger efter primær infektion, hvor musene bliver latent inficerede og den humane serum metaboliseres. Desuden vil ikke alle mus, der er latent inficerede kaste påviselig virus i tårefilmen af ​​det inficerede øje. Det betyder ikke, at de ikke genaktivere, kun at vi ikke kan registrere deres reaktivering ved dyrkning virus. Det er meget sandsynligt, at de fleste, om ikke alle mus kan genaktivere men at de ikke producerer tilstrækkelige antal virus, der skal påvises ved plakanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Jay Pepose for at hjælpe undervise model til os. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health Tilskud EY11885 (PMS), EY21247 (PMS) og en ubegrænset bevilling fra Forsknings at forebygge blindhed til Department of Ophthalmology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Sigma D5796
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150
Human Serum Sigma S7023
L-Glutamine Cellgro 25-005-C1
Pen/ Strep Sigma P4333
Fungizone Invitrogen 15290018
Centrifuge Sorvall Legend RT
Centrifuge Beckman 52-21
Transilluminatior UVP 95-0452-02
Sonicatior Branson Sonifier 450
Oak Ridge Tubes Nalgene Z 720410
Flasks- 7150 Corning 430823
Plates- 12 well Corning CLS 3513
Plates- 48 well Corning CLS 3548
Sterile Conical Tubes- 30 ml Corning CLS 430828
Sterile Cotton-tipped Applicators Fisher 23-400-125
30G Needles Becton-Dickinson 305106
25G Needles BD 305122
10 ml Syringe BD 309602
10 ml Syringe BD 309604

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, B., Easty, D. An improved model of recurrent herpetic eye disease in mice. Curr. Eye Res. 8, 1193-1205 (1989).
  2. Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Reactivation of latent infection and induction of recurrent herpetic eye disease in mice. J. Gen. Virol. 71, 397-404 (1990).
  3. Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, W. A., Easty, D. L. Passive immunization protects the mouse eye from damage after herpes simplex virus infection by limiting spread of virus in the nervous system. J. Gen. Virol. 71, 681-687 (1990).
  4. Laycock, K. A., Lee, S. F., Brady, R. H., Pepose, J. S. Characterization of a murine model of recurrent herpes simplex viral keratitis induced by ultraviolet B radiation. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32, 2741-2746 (1991).
  5. Keadle, T. L., Stuart, P. M. IL-10 ameliorates corneal disease in a mouse model of recurrent herpetic keratitis. Microbial Path. 38, 13-21 (2005).
  6. Keadle, T. L., Laycock, K. A., Miller, J. K., Hook, K. K., Fenoglio, E. D., Francotte, M., Slaoui, M., Stuart, P. M., Pepose, J. S. Efficacy of a recombinant glycoprotein D subunit vaccine on the development of primary and recurrent ocular infection with herpes simplex virus type 1 in mice. J. Inf. Dis. 176, 331-338 (1997).
  7. Keadle, T. L., Laycock, K. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Proinflammatory cytokines IL-1 and TNF-a are required for recurrent herpetic keratitis in NIH mice. Invest. Ophth. Vis. Sci. 41, 96-102 (2000).
  8. Keadle, T. L., Usui, N., Laycock, K. A., Kumano, Y., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Corneal cytokine expression in a murine model recurrent herpetic stromal keratitis. Ocular Immunol. Inflam. 9, 193-205 (2001).
  9. Keadle, T. L., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. CD4+ and CD8+ cells are key participants in the development of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. Microbial Path. 32, 255-262 (2002).
  10. Keadle, T. L., Morrison, L. A., Morris, J. L., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic immunization with a virion host shutoff-defective, replication-incompetent herpes simplex virus type 1 strain limits recurrent herpetic ocular infection. J. Virol. 76, 3615-3625 (2002).
  11. Keadle, T. L., Laycock, K. A., Morris, J. L., Leib, D. A., Morrison, L. A., Pepose, J. S., Stuart, P. M. Therapeutic vaccination with vhs(-) herpes simplex virus reduces the severity of recurrent herpetic stromal keratitis in mice. J. Gen. Virol. 83, 2361-2365 (2002).
  12. Keadle, T. L., Morris, J. L., Stuart, P. M. The effects of aminoguanidine on primary and recurrent ocular herpes simplex virus infection. Nitric Oxide. 13, 247-253 (2005).
  13. Stuart, P. M., Morris, J. E., Sidhu, M., Keadle, T. L. CCL3 protects mice from corneal pathology during recurrent HSV-1 infection. Front. Biosci. 13, 4407-4415 (2008).
  14. Keadle, T. L., Alexander, D. E., Leib, D. A., Stuart, P. M. Interferon gamma is not required for recurrent herpetic stromal keratitis. Virology. 380, 46-51 (2008).
  15. Carr, D. J., Austin, B. A., Halford, W. P., Stuart, P. M. Delivery of Interferon-gamma by an adenovirus vector blocks herpes simplex virus Type 1 reactivation in vitro and in vivo independent of RNase L and double-stranded RNA-dependent protein kinase pathways. J. Neuroimmunol. 206, 39-43 (2009).

Tags

Infektion Immunology Virology medicin Infectious Diseases oftalmologi herpes herpetisk stromal keratitis HSK keratitis patogenese klinisk evaluering virus øjne mus dyremodel
Tilbagevendende Herpetisk stromal keratitis i Mus, en model for at studere menneskets HSK
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morris, J., Stuart, P. M., Rogge,More

Morris, J., Stuart, P. M., Rogge, M., Potter, C., Gupta, N., Yin, X. T. Recurrent Herpetic Stromal Keratitis in Mice, a Model for Studying Human HSK. J. Vis. Exp. (70), e4276, doi:10.3791/4276 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter