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Immunology and Infection

आवर्तक चूहों में ददहा Stromal Keratitis, मानव HSK के अध्ययन के लिए एक मॉडल

doi: 10.3791/4276 Published: December 18, 2012

Summary

ददहा corneal बीमारी की सबसे अध्ययन एक प्राथमिक संक्रमण मॉडल का उपयोग करें. HSV-1 साथ प्राथमिक संक्रमण आम तौर पर मानव रोग के लिए नहीं नेतृत्व करता है. यहाँ हम ददहा corneal बीमारी है, जो और अधिक बारीकी से मानव रोग mimics की आवर्तक मॉडल का वर्णन.

Abstract

ददहा नेत्र रोग, करार दिया ददहा stromal keratitis (HSK), कॉर्निया के एक संभावित चकाचौंध संक्रमण है कि 300,000 से अधिक उपचार के लिए नैदानिक ​​यात्राओं में प्रत्येक वर्ष का परिणाम है. नैदानिक ​​रोग के साथ उन रोगियों के 1 और 2 के बीच प्रतिशत संक्रमित कॉर्निया की दृष्टि की हानि का अनुभव होगा. इन मामलों की विशाल बहुमत दाद द्वारा एक अव्यक्त संक्रमण के पुनर्सक्रियन का परिणाम हैं सिंप्लेक्स मैं वायरस प्रकार गंभीर बीमारी की वजह से नहीं है और. दिलचस्प बात यह है कि, तीव्र संक्रमण मॉडल सबसे अक्सर इस रोग का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, यह महसूस किया गया कि HSK की एक आवर्तक मॉडल अधिक जो नैदानिक ​​रोग के दौरान होता है चिंतनशील होगा. HSK लिए बारम्बार पशु मॉडल दोनों खरगोश और चूहों कार्यरत है. खरगोशों का लाभ यह है कि वे अनुभव विलंबता से पुनर्सक्रियन किसी भी ज्ञात उत्तेजना अनुपस्थित. उस ने कहा, यह भूमिका है कि कई प्रतिरक्षाविज्ञानी कारकों आवर्तक HSK में खेलने का पता लगाने के लिए मुश्किल है क्योंकि खरगोश मॉडल Immun नहीं हैological और आनुवंशिक संसाधनों है कि माउस है. हम आवर्तक HSK लिए माउस मॉडल का उपयोग करें, क्योंकि यह वहाँ कई संसाधन उपलब्ध होने का लाभ है और हम भी जानते हैं कि जब पुनर्सक्रियन घटित होगा चुना क्योंकि पुनर्सक्रियन यूवी बी प्रकाश के लिए जोखिम से प्रेरित है. इस प्रकार अब तक, इस मॉडल उन प्रयोगशालाओं की अनुमति दी गई है, यह कई प्रतिरक्षाविज्ञानी कारक है कि इस रोग के लिए महत्वपूर्ण हैं को परिभाषित करने का उपयोग करने के लिए. यह भी हमें दोनों चिकित्सीय और टीका प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए अनुमति दी गई है.

Protocol

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पशु की देखभाल नोट: दर्दनाशक दवाओं इस मॉडल में इस्तेमाल किया जाता है, के रूप में वे विरोधी भड़काऊ कर रहे हैं और इस तरह मॉडल अमान्य कर रहे हैं.

1. वायरस की तैयारी

  1. वेरो कोशिकाओं (80%) सहधारा 0.01 संक्रमण की बहुलता के 3-4 दिनों के लिए एक प्रारंभिक कमजोर पड़ने (T-150 फ्लास्क में, के बारे में 5 x 10 5 पट्टिका बनाने इकाइयों) का उपयोग करने पर आगे बढ़ें HSV-1 जब तक कोशिकाओं के सभी गोल अप और आसानी से फ्लास्क मार से उखाड़ फेंकना है.
  2. बाँझ अपकेंद्रित्र 4 और Sorvall लीजेंड आरटी में अपकेंद्रित्र ट्यूबों मीडिया निकालें डिग्री सेल्सियस और 15 मिनट के लिए 3,500 rpm. प्रत्येक 50 मिलीलीटर ट्यूब से मीडिया के कुल के 5 मिलीलीटर के साथ सतह पर तैरनेवाला (1.3 देखें), resuspend बड़ी गोली को हटाने के बाद. दो 30 सेकंड bursts में 1 मिनट के लिए Sonicate.
  3. सतह पर तैरनेवाला और 9,000 rpm पर 50 मिलीलीटर बाँझ ओक रिज ट्यूब और अपकेंद्रित्र में डाल 4 ° सी एक Beckman में अपकेंद्रित्र J2-21 में 1 घंटे के लिए निकालें. यह एक छोटे वायरल गोली है. तैरनेवाला त्यागें.
  4. 1.2 बुद्धि से sonicate गठबंधन1.3 से ज गोली और 45 सेकंड के लिए फिर sonicate. में Sorvall लीजेंड RT 4 में 5 मिनट के लिए 1500 rpm पर अपकेंद्रित्र ° सी. तैरनेवाला सहेजें. यह वायरस स्टॉक है जो aliquoted और -70 पर संग्रहीत डिग्री सेल्सियस का गठन
  5. वेरो कोशिकाओं पर टिटर वायरस. मैं आमतौर पर बाहर -8 10 (प्रत्येक 10 गुना कमजोर पड़ने जा रहा है) के कमजोर पड़ने से 2x 2 अलग कमजोर पड़ने सेट 0 10 प्लेट. वायरस के अनुमापन 12 अच्छी तरह से बाँझ प्लेटों पर किया जाता है.

2. माउस संक्रमण

  1. चतनाशून्य करनेवाली औषधि cocktail/20 छ माउस शरीर के वजन के 0.1 मिलीलीटर (Ketamine, 60 मिलीग्राम / किग्रा के साथ प्रत्येक माउस सुई + Xylazine 5 मिलीग्राम / किग्रा HbSS में पतला है). इस कॉकटेल है क्योंकि यह एक संज्ञाहरण का सबसे सुरक्षित साधन जब उचित dosages प्रयोग किया जाता है और इस दवा के प्रभाव बहुत अल्पकालिक प्रयोग किया जाता है.
  2. जब चूहों anesthetized हैं एक 30 गेज सुई के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि कॉर्निया छिद्रित नहीं है सही आंख की कॉर्निया खरोंच.
  3. एक माउस receक्रम में प्राथमिक संक्रमण के दौरान नुकसान से corneas की रक्षा, जमा मानव सीरम (50% 1:800 के वायरल निराकरण के लिए एक प्रभावी खुराक के साथ विरोधी एचएसवी जेट सिग्मा, Temecula, कैलिफोर्निया) के 1 मिलीलीटर की एक intraperitoneal इंजेक्शन ived.
  4. या तो कान क्लिप के साथ या कान पंच द्वारा चूहों संख्या.
  5. चूहों के सभी गिने किया गया है के बाद, एक 20 μl pipettor का उपयोग कर, हम 10 6 pfu (5 μl) के साथ प्रत्येक आंख को संक्रमित. हम केवल एक आंख और आम तौर पर सही आंख को संक्रमित. हम भी अन्य आंख यह नम रखने जबकि वे anesthetized हैं HbSS के 5 μl जगह है. 5 उल प्रक्रियाओं के बाद से कम से कम 10 मिनट में प्रदर्शन कर रहे हैं, और जानवरों चतनाशून्य करनेवाली औषधि के साथ dosed हैं तदनुसार आँखों के जलयोजन बनाए रखने के लिए पर्याप्त है. संक्रमण चूहों एक बाँझ कपास applicator कि वेरो मीडिया के 1 मिलीलीटर में हाइड्रेटेड था के साथ 3 दिनों के बाद संक्रमण swabbing द्वारा पुष्टि की है. फिर 100 μl वेरो 48 अच्छी तरह प्लेटें में विकसित कोशिकाओं को जोड़ा जाता है. इन प्लेटों दैनिक कोशिकाविकृति संबंधी प्रभाव के लिए निगरानी कर रहे हैं (CPE).

3. लेटेंसी से चूहे के पुनर्सक्रियन

  1. चूहे प्राथमिक संक्रमण के बाद कम से कम 5 सप्ताह anesthetized हैं. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि हम चूहों सक्रिय बना दिया है एक वर्ष निम्नलिखित प्राथमिक संक्रमण और प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण मतभेद नहीं मनाया.
  2. Anesthetized एक बार वे TM20 transilluminator Chromato नजरों से देख, जो 302 एनएम ऐसी है कि केवल एक ही आंख यूवी बी प्रकाश से अवगत कराया है की एक चोटी तरंगदैर्ध्य पर यूवी बी का उत्सर्जन करता रखा जाता है. प्रत्येक माउस 250 प्रकाश यूवी-B के MJ 2 सेमी से अवगत कराया है.
  3. पुनर्सक्रियकण बाँझ कपास applicator कि 1 0 दिवस पर वेरो मीडिया के 1 मिलीलीटर में रखा (यूवी-B के लिए सहज shedders के लिए नियंत्रण के प्रदर्शन से पहले) और 1 से 7 के बाद यूवी बी विकिरण दिनों पर तो साथ आँखों swabbing द्वारा निर्धारित किया जाता है. झाड़ू सामग्री 2.5 में वर्णित के रूप में मूल्यांकन किया जाता है). उन swabs कि संक्रामक वायरस के लिए वायरस की राशि 12 अच्छी तरह प्लेटें का उपयोग एक मानक पट्टिका परख द्वारा tittered है.
ove_title "> 4 नैदानिक ​​मूल्यांकन

  1. चूहे नैदानिक ​​नेत्र रोग के लिए एक नकाबपोश एक द्विनेत्री विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग पर्यवेक्षक द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं.
  2. कॉर्नियल अस्पष्टता 0 से 4 के एक पैमाने पर है, जहां 0 स्पष्ट stroma इंगित करता है पर मूल्यांकन किया गया है, 1 हल्के stromal अपारदर्शन इंगित करता है, प्रत्यक्ष आईरिस सुविधाओं के साथ 2 मध्यम अस्पष्टता को इंगित करता है, 3 परिभाषित परितारिका विस्तार के शिष्य हाशिये, और 4 को छोड़कर नुकसान के साथ घने अस्पष्टता इंगित करता है इंगित करता है कोई पीछे दृश्य के साथ कुल अस्पष्टता.
  3. Neovascularization 1 के पैमाने पर 4 बराबर quadrants में कॉर्निया विभाजित और इन quadrants की प्रत्येक में vascularization की सीमा निर्धारित करने से 8 के लिए मूल्यांकन किया गया है.
  4. ब्लेफेराइटिस के रूप में मापा जाता है: 0, कोई घावों, 1, न्यूनतम पलक सूजन, 2, मध्यम सूजन और crusty नेत्र निर्वहन, 3, गंभीर सूजन, मध्यम periocular बालों के झड़ने, और त्वचा के घावों, और 4, आँखों crusted बंद के साथ गंभीर सूजन, गंभीर periocular बालों के झड़ने, और त्वचा के घावों.
  5. इन्सेफेलाइटिस inclu के साक्ष्यded वापस hunched, झालरदार, बाल, और स्पष्ट neurologic असामान्यताएं. चूहे euthanized हैं जब वे इन्सेफेलाइटिस के महत्वपूर्ण संकेत प्रदर्शित.

5. प्रतिनिधि परिणाम

आवर्तक मॉडल है जो ऊपर वर्णित किया गया था 1 Shimeld, एट अल द्वारा प्रकाशित किया गया था 1-3. वे परीक्षण किया है और हमारी प्रयोगशाला में इस मॉडल का एक संशोधित संस्करण का उपयोग किया गया 4-15 साल में कई पांडुलिपियों प्रकाशित. मॉडल भूमिका को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था कि cytokine आवर्तक एचएसवी -1 10 रोग में इंटरफेरॉन γ नाटकों. के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है, की तुलना में IFNγ प्रदर्शित बदतर corneal बीमारी की कमी चूहों जंगली प्रकार चूहों 14 किया. यह भी सफलतापूर्वक कई अलग टीका 6,10,11 constructs चिकित्सकीय मूल्य निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. ध्यान दें कि अच्छी तरह से एक मामले में परीक्षण किया गया टीका prophylactically काम किया था, लेकिन साबित करने के लिए therapeutically प्रभावी नहीं 6. हालांकि,जब एक प्रतिकृति अक्षम वायरल वैक्सीन का परीक्षण किया गया था, यह केवल प्रभावी prophylactically नहीं था, लेकिन यह भी बहुत प्रभावी therapeutically 10,11, 10 संदर्भ में 5 चित्रा देखें. हाल ही में हम इस मॉडल का इस्तेमाल किया है निर्धारित करने के लिए अगर लिंग भेद आवर्तक HSK के दौर से गुजर चूहों में detectable थे. जैसा कि चित्र 1 को दर्शाता है, पुरुष C57BL / 6 चूहों काफी कम corneal अस्पष्टता से महिला C57BL / 6 चूहों को प्रदर्शित करते हैं. इसी तरह, जब corneal neovascularization मूल्यांकन किया गया था, नर चूहों काफी कम कॉर्निया में नए पोत वृद्धि की तुलना में मादा चूहों (2 चित्रा) का प्रदर्शन किया. वर्तमान में हम परीक्षण कर रहे हैं कि क्या इस phenotype चूहों के अन्य प्रकारों में इसी तरह के विश्लेषण प्रदर्शन द्वारा विशिष्ट तनाव है. हम यह भी तय है कि अंतर टेस्टोस्टेरोन की कमी या एस्ट्रोजन की उपस्थिति की वजह से है.

चित्रा 1
चित्रा 1 पुरुष और महिला C57BL / यूवी बी प्रेरित पुनर्सक्रियन के बाद 6 माउस उपभेदों में कॉर्नियल रोग. गुप्त रूप से संक्रमित चूहों यूवी बी विकिरण और चूहों थे corneal अस्पष्टता के लिए 35 दिनों के लिए निगरानी के साथ पुन: सक्रिय करने के लिए प्रेरित किया गया. इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल चूहों की संख्या के रूप में इस प्रकार थे: पुरुषों, n = 15, महिलाओं, n = 15. परिणाम मतलब ± SEM संकेत मिलता है. * महिला C57BL / 6 चूहों में 14-35 दिन (पी 0.01 = 0.001 के लिए) के लिए काफी अधिक रोग वायरस से प्रेरित था.

चित्रा 2
चित्रा 2 पुरुष और महिला C57BL / यूवी बी प्रेरित पुनर्सक्रियन के बाद 6 माउस उपभेदों में कॉर्नियल रोग. गुप्त रूप से संक्रमित चूहों यूवी बी विकिरण और चूहों थे corneal neovascularization के लिए 35 दिनों के लिए निगरानी के साथ पुन: सक्रिय करने के लिए प्रेरित किया गया. इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल चूहों की संख्या के रूप में इस प्रकार थे: पुरुषों, n= 15, महिलाओं, n = 15. परिणाम मतलब ± SEM संकेत मिलता है. * महिला C57BL / 6 चूहों में 14-28 दिन (पी 0.01 = 0.001 के लिए) के लिए काफी अधिक रोग वायरस से प्रेरित था.

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Discussion

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(HSK) ददहा stromal keratitis की आवर्तक मॉडल यहाँ वर्णित अन्वेषक एक मॉडल है कि अधिक है कि जो मानव रोग के दौरान मनाया जाता है के साथ संगत है में मानव HSK का अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है. इस प्रकार, मॉडल ताकत हैं कि रोग एक प्रतिरक्षा प्रणाली है कि प्राथमिक बीमारी के दौरान प्रेरित द्वारा पहले से ही है के संदर्भ में होता है. चूंकि इन चूहों को पहले से ही एचएसवी-1 के लिए एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है, कारक है कि है कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को पुन: सक्रिय करने की संभावना है जो कि मूल रूप से यह उत्पन्न से अलग हैं. इसलिए, चिकित्सकीय हस्तक्षेप करने के लिए प्राथमिक HSK को रोकने हमेशा आवर्तक HSK के सुधार नहीं सीसा, जो हम विभिन्न प्रकाशनों में दिखाया गया है जब - प्राथमिक और आवर्तक HSK 6,8,10-13,15 के बीच मतभेद का मूल्यांकन. जैसा कि पहले बताया गया है, यह विशेष रूप से मामला है जब मानव HSK को रोकने के लिए टीके विकसित. ज्यादातर टीके प्राथमिक HSK के विकास को रोकने के लिए, लेकिन बहुत कुछ recu को कम करने में प्रभावी होना दिखाया गया हैrrent 6,10,11 HSK.

इस मॉडल की कमजोरियों रहे हैं कि यह बहुत लंबे समय तक एक प्रयोग करने के लिए लेता है. लगभग 6 सप्ताह के बाद की अवधि के प्राथमिक संक्रमण के दौरान जो चूहों को गुप्त रूप से संक्रमित हो जाते हैं और मानव सीरम प्रशासित metabolized है. इसके अलावा, चूहों कि गुप्त रूप से संक्रमित नहीं कर रहे हैं सभी detectable वायरस संक्रमित आंख के आंसू फिल्म में डाला जाएगा. इसका मतलब यह है कि वे पुन: सक्रिय नहीं था नहीं है, केवल यह है कि हम संवर्धन वायरस से उनके पुनर्सक्रियन नहीं पता लगा सकते हैं. यह बहुत संभव है कि सबसे अधिक है, सभी चूहों को पुनः सक्रिय करते हैं लेकिन अगर नहीं है कि वे वायरस के लिए पर्याप्त संख्या पट्टिका परख द्वारा पता लगाया जा उत्पादन नहीं है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों के लिए मदद करने के लिए हमें करने के लिए मॉडल शिक्षण डा. जे Pepose धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम अनुदान स्वास्थ्य EY11885 (पीएमएस), EY21247 (पीएमएस) और अनुसंधान से एक अप्रतिबंधित अनुदान नेत्र विज्ञान विभाग अंधापन को रोकने के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Sigma D5796
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150
Human Serum Sigma S7023
L-Glutamine Cellgro 25-005-C1
Pen/ Strep Sigma P4333
Fungizone Invitrogen 15290018
Centrifuge Sorvall Legend RT
Centrifuge Beckman 52-21
Transilluminatior UVP 95-0452-02
Sonicatior Branson Sonifier 450
Oak Ridge Tubes Nalgene Z 720410
Flasks- 7150 Corning 430823
Plates- 12 well Corning CLS 3513
Plates- 48 well Corning CLS 3548
Sterile Conical Tubes- 30 ml Corning CLS 430828
Sterile Cotton-tipped Applicators Fisher 23-400-125
30G Needles Becton-Dickinson 305106
25G Needles BD 305122
10 ml Syringe BD 309602
10 ml Syringe BD 309604

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References

  1. Shimeld, C., Hill, T. J., Blyth, B., Easty, D. An improved model of recurrent herpetic eye disease in mice. Curr. Eye Res. 8, 1193-1205 (1989).
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